Denne artikel beskriver eksperimentelle protokoller for at undersøge ex vivo sammentrækninger af menneskelige myometrium og deres anvendelse i drug discovery. Denne teknik bruges til at forbedre forståelsen af myometrial fysiologi og patofysiologi samt at validere farmakologiske data fra romanen forskning sonder eller narkotika fører.
Opdagelse og karakterisering af roman lægemiddelsammensætninger eller biokemiske sonder stole på robust og fysiologisk relevante assay systemer. Vi beskriver metoder til at måle ex vivo myometrium kontraktilitet. Denne analyse kan bruges til at undersøge faktorer og molekyler der er involveret i modulation af myometrial sammentrækning og til at bestemme deres excitatoriske eller hæmmende handlinger, og dermed deres terapeutiske potentielle in vivo. Biopsier er fremstillet af kvinder, der gennemgår kejsersnit levering med informeret samtykke. Fine strimler af myometrium er dissekeret, klippet og knyttet til en krafttransducer i 1 mL orgel bade superfused med fysiologisk saltvand løsning ved 37 ° C. Strimler udvikle spontane veer inden for 2-3 h under sæt spænding og forblive stabilt i mange timer (> 6 h). Strips kan også blive stimuleret til at indgå som ved de endogene hormoner, oxytocin og vasopressin, som forårsager koncentration-afhængige graduering af sammentrækning frekvens, kraft og varighed, til mere ligner sammentrækninger i arbejdskraft. Derfor, effekten af kendte og nye narkotika fører kan testes på spontan og agonist-induceret sammentrækninger.
Denne protokol beskriver specifikt hvordan dette assay kan bruges til at bestemme styrken af kendte og nye agenser ved at måle deres effekter på forskellige parametre af menneskelige myometrial sammentrækning. Vi bruger oxytocin- og V1a receptor antagonister, atosiban og SR49059 som eksempler på kendte stoffer, som hæmmer induceret af oxytocin og vasopressin sammentrækninger, og vise, hvordan denne metode kan anvendes til at supplere og validere farmakologiske data fra celle-baserede assays til at støtte udvikling af lægemidler. Virkningerne af roman agonister i forhold til oxytocin og vasopressin kan også karakteriseres. Mens vi bruger eksemplet med oxytocin / vasopressin system, denne metode kan også bruges til at studere andre receptorer og Ionkanaler, der spiller en rolle i uterus sammentrækning og afslapning til at fremme forståelsen af menneskets uterin Fysiologi og patofysiologi.
Målet for drug discovery er at producere roman, potent, og yderst selektiv ligander, som skaber en terapeutisk respons ved at aktivere eller hæmme cellulær signalering veje. Dette kræver en passende analyse system til at teste blyforbindelser med pålidelige, robuste og relevante resultater1. Farmakologiske teknikker såsom ligand-receptor binding og funktionelle assays ansætte ofte heterolog celle-baserede systemer, manipuleret til overexpress receptorer, som ellers ikke ville være til stede2. Disse teknikker give værdifuld indsigt for receptor farmakologi og tidlige udvikling af lægemidler, kan oplysningerne ikke afspejler et sandt i vivo scenario. Det er derfor vigtigt, at farmakologisk data fra celle-baserede assays også valideres i fysiologisk relevante modeller.
Uterin glat muskulatur (myometrium) udgør den muskuløs lag af livmoderen, som er ansvarlig for sammentrækninger i løbet af arbejdskraft, at udviske og spile livmoderhalsen og levere fosteret3. Sammentrækning af myometrium er spontan; Det kræver ikke hormonal og nervøs input til kontrakt4. Sammentrækninger er tilvejebragt ved spontane depolarisering af myometrial cellens membran, hvilket fører til åbningen af spænding-drives Ca2 +-kanaler (L-Type kanaler) og tilstrømning af Ca2 + til celle5. Calcium komplekser med calmodulin og aktiverer myosin lys kæde kinase, som til gengæld phosphorylates myosin aktivering kryds broen cyklus dannelse med aktin og sammentrækning. Afslapning er typisk formidlet af nedtrapning fosforylering af myosin af myosin fosfatase og en reduktion i koncentrationen af Ca2 + via sin ekstrudering fra cellen og/eller binding til sarcoplasmic reticulum (SR)5,6 ,7.
Flere metoder er blevet udviklet for at studere myometrial funktion og dysfunktion, i vivo interne og eksterne tocography og intrauterin pres katetre, at generation af omdannet eller udødeliggjort celler af myometrial oprindelse8 ,9,10,11,12. Mens celle kultur systemer kan afsløre, om et stof kan handle på celleniveau, kan strimler af væv inden for orgel bade bruges som værktøjer til at måle funktionelle svar af hele væv til farmakologisk reagenser. Traditionelle orgel badet er typisk et stort opvarmet glas kammer, som er i stand til at bedriften mellem 5 og 50 mL fysiologisk kogsaltopløsning (PSS). Strimler inden for disse store kamre kræver normalt luftning med ilt og store mængder af PSS. Strimler af vævet er dissekeret og suspenderet inden for badning kammer og knyttet til en krafttransducer, som måler ændringer i spændinger, som under en sammentrækning. Strimler af myometrium fra både mennesker og dyr, herunder guinea gris13, mus14, rotte15, kanin16og andre17,18, har været brugt af en række forskningsgrupper for at undersøge mange spørgsmål vedrørende myometrial fysiologi og patologi, herunder præmature og dysfunktionelle arbejde. For eksempel, myometrial strimler har været brugt til at identificere faktorer, der regulerer og ændre myogenic aktivitet19,20,21, bestemme organelle funktion som SR22, samt undersøge modulatorer af ion-kanaler23,24,25,26, pumper og varmevekslere27 for at afgøre deres rolle i myometrial fysiologi.
Denne ex vivo -teknik giver mulighed for vurdering af væv sammentrækning ydeevne og den direkte virkning af forskellige agenter på parametrene for sammentrækning måles herunder, sammentrækning force (styrke), frekvens og varighed, samt den integrationen af disse værdier, til at generere et indeks over samlede arbejde (gennemsnitlige integrerende kraft eller arealet under kurven, AUC). Isoleret væv strip forberedelse udgør en model af mere end én celletype, kan den fysiologiske reaktion af hele væv måles. Orgel bad og isoleret væv strip er derfor et nyttigt redskab i forbindelse med bro mellem celle kultur arbejde og hele dyret /vivo arbejder. Derfor inden for drug discovery, virkningerne af roman agenter i deres excitatoriske (dvs., stimulerende) eller hæmmende (dvs., afslapning) potentielle i vivo kan blive nærmere vurderet. Denne teknik blev med succes anvendt i udviklingen af oxytocin- og V1a-receptor (OTR og V1aR) antagonist atosiban som en tocolytic agent til at hæmme præmature arbejdskraft sammentrækninger og forsinke præterm fødsel. In vitro test af atosiban på myometrial strimler fandt antagonist stand til at reducere oxytocin (OT)-induceret sammentrækninger28,29,30. Vigtigere er disse undersøgelser hjalp til at validere translationel værdien af atosiban og genereret proof-of-concept data behov for at tage det frem til kliniske forsøg31,32,33,34 . Atosiban er nu bredt anvendt som foretrukne stof for at forsinke arbejdskraft i Europa. Lignende proof-of-concept test blev gennemført for oxytocin analog carbetocin til at vise sin terapeutiske potentiale i forebyggelsen af post-partum blødning35,36,37. Andre blyforbindelser i øjeblikket under udvikling med denne analyse omfatter retosiban (GSK221149A)38 og nolasiban (data upubliceret). Disse metoder har også været anvendt med succes til at sammenligne mellem patientgrupper39,40,41,42,43,44, 45,46,47 og undersøges for intra-arter forskelle.
Her beskriver vi brugen af isolerede ex vivo væv strimler fra gravide menneskelige myometrium inden for små (1 mL) custom-made orgel bade til at illustrere, hvordan denne metode kan bruges til at supplere og validere farmakologiske data fra celle-baserede assays . Biopsier blev i vid udstrækning fremstillet af kvinder, der gennemgår pre labor elektiv kejsersnit (CS) levering, som de er planlagt kirurgi og derfor er lettere at planlægge biopsi samling, har nem adgang til myometrium, og væv vil ikke har været udsat for nogen uterotonic stimulanser eller afslapning forud for operationen. Biopsier fås dog også hos kvinder, der gennemgår uplanlagte (nød) CS levering i arbejdskraft giver tilstrækkelig tid til fuldt samtykke patienten. De fleste biopsier er opnået under operationen fra det nedre uterine segment i stedet for kirurgisk snit, men det er også muligt at få prøver fra øvre segment48,49. I nogle tilfælde efter vaginal levering, er punch biopsier fra placenta sengen også opnået50. Men dette er ikke den mest konventionelle rute og mængden af myometrial væv hentet er lille. Ikke-gravide myometrium kan fås fra præ- eller Post-menopausale kvinder, der gennemgår hysterektomi for godartet gynækologisk betingelser. En fuld tykkelse biopsi er stikprøven efter patologi undersøgelse, fra den lavere corpus fra livmoderhalsen, og myometrium er taget fra midten af livmodervæggen at undgå serosal og endometrie overflader.
Mens de fleste udvikling af lægemidler er bestemt til behandling af menneskelige lidelser, udføres mest grundlæggende forskning primært i animalsk væv. Her, beskriver vi metoder til at undersøge ex vivo sammentrækninger af menneskelige myometrium fremstillet af kirurgi, som kan bruges til at behandle en række vigtige spørgsmål relateret til uterin Fysiologi og patologi, samt at validere funktionelle svar til kendte og nye farmakologiske midler til at støtte udvikling af lægemidler. Navnlig, fremhæve vi brugen af denne analyse at undersøge de antagonistiske svar af en kendt OTR og V1aR konkurrencedygtige antagonist, atosiban på OT-inducerede gravid myometrial sammentrækninger, samt at bestemme svar og receptor selektivitet af en nyudviklet selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi demonstrere at vigtige farmakokinetiske parametre såsom EF50 og IC50 kan beregnes, som justerer godt med celle-baserede farmakologi data.
Bruger flere strimler samtidig giver mulighed for direkte sammenligning af flere agent effekter, konkurrence eksperimenter med antagonister og passende tid og køretøj kontrol. Som strimler er ofte tilberedt i grupper af 2, 4 eller 8, giver denne teknik moderat overførselshastighed, gør det muligt for afprøvning af 2 – 4 forbindelser på 6-8 (kumulative) koncentrationer (pr. biopsi). Denne metode giver også real-time data, således at virkningerne kan vurderes hurtigt og protokoller kan justeres. Desuden, denne teknik kan bruges til at teste forbindelser af interesse og har været anvendt med succes af en række forskergrupper fokuseret på myometrial fysiologi og i drug discovery. Udover at analysere ren forbindelser som beskrevet i denne hvidbog, uterin kontraktilitet model har også været og med held kan udnyttes til at screene for romanen uterotonic stoffer fra blandinger, såsom drogetilberedninger fra traditionel medicin7 , 55 , 56.
Selvom denne model er teknisk robust og viser god reproducerbarhed, det har nogle begrænsninger: dissektion kan være svært for dem uvant med væv eller dissektion hospitalsudstyr, dermed nye brugere vil kræve lidt tid til at optimere væv forberedelse og protokoller. Det skal også bemærkes, at menneskelige myometrium afviger betydeligt i udseende til andre modeller som rotter og mus. De fleste gnavere livmoder er sammensat af to rør-lignende uterin horn, hver komplet med en æggestok i den ene ende og sluttede på livmoderhalsen. Hvert horn har klart definerede langsgående og cirkulær muskel lag, som let kan adskilles på dissektion, mens de forskellige fibertyper i menneskelige myometrium er ofte flettet sammen, danner en ‘maske’. Derudover er sammentrækning profiler af menneskelige myometrium meget forskellige til gnavere. Mest bemærkelsesværdigt, er sammentrækninger i menneskelige myometrium mindre hyppige men længere varighed. Eksperimentelle tidsrammer for arbejder med menneskelige myometrium er derfor ofte langt længere end gnavere modeller. Forskelle i receptor udtryk mellem arter kan også bidrage til ganske markante forskelle i svarene til agonister og dette bør tages i betragtning, hvis ekstrapolere resultater på tværs af arter.
Der er også antallet af trin, der har brug for at maksimere output fra dette system. Kritiske trin omfatter bevarelse af væv levedygtighed som pasning når du håndterer væv for at undgå enhver unødig skade under dissektion eller ved montering. En dygtig øje er forpligtet til at dissekere fine strimler af uterin muskel, sikring af orienteringen af muskelfibre er i længderetning og efter flyet af væv, samt at undgå ar væv, decidua og små fartøjer. For at støtte orientering formål, når modellen er i laboratoriet, er det muligt at føje et mærke (f.eks små kirurgiske søm) på tidspunktet for indsamlingen til den ene side af biopsi at afgrænse den serosal kant fra decidual kant.
Væv bør holdes på en støt 36-37 ° C under eksperimenter som væv funktion er underlagt temperatursvingninger. Dette kan opnås med en robust klimaanlæg i laboratoriet. Konstant perfusion af varmede PSS sikrer, at temperaturen er vedligeholdt og rødmen ud af affaldsprodukter fra sammentrækning. Temperatur inden for orgel bade kan ændres ved at ændre strømningshastighed eller justere bad vandtemperaturen direkte. Små bad størrelse i forhold til traditionelle 5-50 mL bade sikrer en relativt hurtig omsætning af PSS og udvaskning af reagenser. Miniaturiserede orgel bad reducerer som beskrevet her, også mængden af PSS og reagenser af interesse behov, hvilket minimerer omkostningerne og besparende dyrebare, nyudviklet kemikalier. Desuden, på grund af den lille bad størrelse og ved hjælp af en HEPES-baseret buffer, kræver dette system ikke iltning fxaf boblende PSS med carbogen. Standardisering af spænding anvendes til strimler er også vigtig. Strimler af denne størrelse (5 mm x 2 mm x 1 mm), bør dette være ca 2 mN (svarende til ~0.2 g). Alternative metoder omfatter anvendelse af en høj kalium løsning til at fremkalde maksimal sammentrækning og strækker sig til halvdelen af denne maksimale sammentrækning. Det bør imidlertid noteres, at spændingen anvendes i vivo kan variere.
De vigtigste udfordringer omfatter at få væv fra menneskelige emner, men selv om beskatning, humane væv klart repræsenterer den mest fysiologisk relevante (og givende) model til at studere uterin sammentrækning i menneskers sygdom og drug discovery. Den isolerede væv strimler dog ikke nødvendigvis svare til væv i vivo som de er fritaget for eksempel af hormonelle og nervøse input som selv ikke afgørende for sammentrækning, vil modulere sammentrækninger in vivo. Denne analyse giver imidlertid mulighed for at analysere myometrial sammentrækninger på en kontrolleret måde, adskilt fra sådanne påvirkninger. Det giver også mulighed for effekten af faktorer som hormonal kontrol af sammentrækning (f.eks.via OT, VP, prostaglandiner, etc.) skal efterforskes, giver ledetråde til regulering af myometrial funktion. Som væv er fremstillet af forskellige kvinder, er der naturligvis nogle variation i de spontane kontraktile profiler mellem enhederne. Derfor er det ofte nødvendigt at udføre eksperimenter på et stort antal (~ n = 10) prøver at minimere variationen i nogle datasæt53. Dette er det vigtigste, når man sammenligner kontraktile aktivitet mellem forskellige patientgrupper. Normalisere svar agonister og antagonister til at styre aktivitet (dvs., at udtrykke som en procentdel af kontrolaktivitet eller høj K+) reducerer nogle af denne variation. Derudover kan data for at reducere Inter strip variation, normaliseres til strip integrationskugle ved at måle deres længde og vægt post eksperimenter41. Dette er især nyttigt, når man sammenligner sammentrækning mønstre mellem forskellige patientgrupper.
Begrænsninger af denne teknik også omfatter adgang til frisk væv, som kræver gode arbejdsforbindelser med hospitalspersonale, især teater personale og involverede i forbindelse med samtykke. Etiske tilladelser fra den lokale videnskabsetisk Komité og Institut eller hospital review board skal også være på plads. Samling af menneskelige myometrium er sandsynligvis udført i CS levering, når donoren er under kirurgi. Biopsi er taget fra samme uterin indsnit stedet lavet for at levere babyen og derfor patienten behøver ikke at gennemgå nogen yderligere procedurer. Theater personale og kirurgen udfører biopsi skal gøres opmærksom på den efterfølgende anvendelse af væv, og at de ikke skal være placeret i Fikseringsvæske løsninger sådan med hensyn til at sende til en patologi afdeling. Den lange eksperimentelle tidsramme er en anden overvejelse. Eksperimenter med humane væv tage mange timer (typisk > 6 h) (i modsætning til 2-3 h for et lignende eksperiment i rotte eller mus livmoderen), på grund af den langsommere hyppigheden af sammentrækning og 2-3 h tidsforsinkelsen mellem væv montering og etablering af spontan sammentrækninger. Men, som vi har vist, humant væv sammentrækninger er robust, og når etableret kan kontrakten i mange timer uden betydelig træthed40.
Dette system giver også andre udfordringer i vivo arbejde at overvinde herunder mulighed for at teste farmaceutiske reagenser på gravide væv. Denne teknik nemt kan ekstrapoleres til andre arter, herunder mus hvorved indledende resultater kan bekræftes, før du fortsætter yderligere i hele dyreforsøg. Kontrolleret ændringer i temperatur, sammensætningen af superfusate (PSS), og pH kan gøres nemt at efterligne forskellige scenarier i vivo og analysere effekten af disse ændringer på sammensatte adfærd. De grundlæggende principper for måling isometriske spænding i myometrial strimler kan også udvides til måling af samtidige ændringer i intracellulære calcium koncentration eller pH ved brug af fluorescerende Ca eller pH (H+) indikatorer og udstyr til at opdage og optage fluorescens57,58,59,60.
Generelt, den menneskelige myometrium repræsenterer en robust og fysiologisk relevante model til at karakterisere og validere nye terapeutiske forbindelser i drug discovery — både rene stoffer og blandinger. Vi har givet eksempler på dens anvendelse i drug discovery med hensyn til ordningen med OT/VP og fokuseret på OTR og V1enR antagonister til at vise, hvordan denne model kan bruges til at bestemme sammensatte effektiviteten og styrken på definerede mål og validere ligand selektivitet. Men det skal bemærkes at denne teknik kan bruges til at studere ethvert mål af interesse eller sti fører til myometrial sammentrækning (eller afslapning) samt støtte drug opdagelsen af nye mål og veje, og fremme vores forståelse af myometrial Fysiologi og patofysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er blevet støttet af den østrigske videnskab fond (FWF) gennem projektet I3243 og det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale No 714366). CWG er blevet støttet af en australsk Research Council (ARC) fremtid Fellowship (FT140100730) og MM en ARC Discovery tidlige karriere forsker (DECRA) Fellowship (DE150100784). SA understøttes af en Harris-Wellbeing præterm fødsel forskning centrum Grant administreres af velvære for kvinder, UK.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |