Dieser Artikel beschreibt experimentelle Protokolle zur Untersuchung von ex-Vivo Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter und deren Anwendung in der Drogeentdeckung. Diese Technik wird verwendet, um die Verbesserung des Verständnisses der Myometrial Physiologie und Pathophysiologie sowie über pharmakologische Daten aus neuartigen Forschung Sonden zu überprüfen oder Drogen führt.
Entdeckung und Charakterisierung der neuartige pharmazeutische Substanzen oder biochemischen Sonden verlassen sich auf robuste und physiologisch relevanten Test-Systeme. Wir beschreiben Methoden zur Messung der ex Vivo Gebärmutter Kontraktilität. Dieser Test kann verwendet werden, um Faktoren zu untersuchen und Moleküle beteiligt die Modulation der Myometrial Kontraktion und ihre erregenden oder hemmenden Handlungen zu bestimmen und damit ihre therapeutische Potenzial in Vivo. Biopsien sind Frauen Sectio Lieferung mit Einwilligung eingeholt. Feine Streifen der Gebärmutter sind seziert, abgeschnitten und an einem Kraftaufnehmer innerhalb 1 mL Orgel Bäder unterkühlte mit physiologischer Kochsalzlösung bei 37 ° C. Streifen spontane Kontraktionen innerhalb von 2 – 3 h unter eingestellte Spannung zu entwickeln und für viele Stunden stabil bleiben (> 6 h). Streifen können auch zum Vertrag, wie durch die körpereigenen Hormone Oxytocin und Vasopressin, die Konzentration abhängig Modulation der Kontraktion Frequenz verursachen, Kraft und Dauer mehr ähneln Kontraktionen in der Arbeit angeregt werden. Daher kann die Wirkung von bekannten und neuartigen Medikament führt auf spontane und Agonist-induzierten Kontraktionen getestet werden.
Dieses Protokoll beschreibt speziell wie dieser Assay verwendet werden kann, die Potenz der bekannte und neuartige Wirkstoffe durch Messung ihrer Auswirkungen auf verschiedene Parameter der menschlichen Myometrial Kontraktion zu bestimmen. Wir verwenden die Oxytocin- und V-1a -Rezeptor-Antagonisten, Atosiban und SR49059 als Beispiele von bekannten Verbindungen die Oxytocin und Vasopressin-induzierten Kontraktionen zu hemmen, und demonstrieren, wie diese Methode verwendet werden kann, zu ergänzen und zu validieren pharmakologische Daten zellbasierte Assays zur Unterstützung der Entwicklung von Medikamenten. Die Auswirkungen der neuartigen Agonisten im Vergleich zu Oxytocin und Vasopressin können auch charakterisiert werden. Während wir das Beispiel der Oxytocin verwenden / Vasopressin-System, diese Methode kann auch zur Untersuchung anderer Rezeptoren und Ionenkanäle, die bei uterine Kontraktion und Entspannung, das Verständnis der menschlichen Gebärmutter Physiologie und Pathophysiologie fördern eine Rolle spielen.
Arzneimittelforschung soll Roman, potent, und hoch selektive Liganden, die eine therapeutische Reaktion erzeugen durch Aktivierung oder Hemmung der zellulären Signalwege zu produzieren. Dies erfordert eine entsprechende Testsystem in die Bleiverbindungen mit zuverlässigen, robusten und relevante Ergebnisse1zu testen. Pharmakologische Techniken wie Ligand-Rezeptor-Bindung und funktionelle Assays setzen häufig heterologe zellbasierte Systeme entwickelt, um Overexpress Rezeptoren, die sonst nicht vorhanden2wäre. Diese Techniken bieten wertvolle Erkenntnisse für Rezeptor Pharmakologie und frühe Arzneimittelentwicklung, reflektieren die gewonnenen Daten möglicherweise keine echte in-Vivo -Szenario. Es ist daher wichtig, dass pharmakologische Daten aus zellbasierte Assays auch physiologisch relevanten Modelle validiert werden.
Uterine glatte Muskulatur (Gebärmutter) bildet die Muskelschicht der Gebärmutter die Kontraktionen während der Wehen, die auszulöschen verantwortet und den Gebärmutterhals zu dehnen und liefern den Fötus3. Kontraktion der Gebärmutter ist spontan; Es erfordert keine hormonelle oder nervös Eingang4Vertrag. Kontraktionen sind herbeigeführt durch spontane Depolarisation der Zellmembran Myometrial führt zur Öffnung der Spannung betriebenen Ca2 +-Kanäle (L-Typ) und Zustrom von Ca2 + in die Zelle5. Kalzium-komplexe mit Calmodulin und Myosin Leichtketten-Kinase, die wiederum Myosin ermöglichen Cross Brückenbildung Zyklus mit Aktin und Kontraktion phosphorylates aktiviert. Entspannung ist in der Regel durch de-Phosphorylierung der Myosin von Myosin Phosphatase und eine Verringerung der Konzentration von Ca2 + über die Extrusion von der Zelle und/oder Sequestrierung in dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR)5,6 vermittelt. ,7.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Myometrial Funktion und Dysfunktion, von in Vivo interner und externer Tocography und intrauterine Druck Katheter zur Generation der transformierten oder verewigt Zellen Myometrial Ursprungs8 studieren ,9,10,11,12. Während Zellkultursysteme erkennen können, ob eine Substanz auf zellulärer Ebene tätig werden kann, können Streifen Gewebe im Organ Bäder, um funktionelle Reaktionen des gesamten Gewebes auf pharmakologische Reagenzien zu messen als Werkzeuge verwendet werden. Das traditionelle Orgel-Bad ist in der Regel einen großen beheizten Glas-Kammer, die in der Lage zwischen 5 und 50 mL physiologischer Kochsalzlösung (PSS) ist. Streifen in dieser großen Kammern verlangen in der Regel Belüftung mit Sauerstoff und große Mengen an PSS. Streifen des Gewebes werden seziert und innerhalb der Kammer Baden ausgesetzt und an ein Kraftaufnehmer, Änderungen in der Spannung, wie z. B. während einer Kontraktion misst. Streifen der Gebärmutter von Menschen und Tieren wie Meerschweinchen13, Maus14, Ratte15, Kaninchen16und andere17,18, durch eine Reihe von Forschungsgruppen verwendet wurden, um zu prüfen viele Fragen rund um Myometrial Physiologie und Pathologie, einschließlich Frühgeburten und dysfunktionale arbeiten. Zum Beispiel Myometrial Streifen wurden verwendet, um die Faktoren zu identifizieren, die zu regulieren und ändern myogen Aktivität19,20,21, bestimmen Organelle Funktion wie die SR-22sowie Untersuchung von Modulatoren des Ion Kanäle23,24,25,26, Pumpen und Wärmetauscher27 um ihre Rolle in der Physiologie der Myometrial zu bestimmen.
Diese ex-Vivo -Technik ermöglicht Gewebe Kontraktion Leistungsbewertung und die unmittelbare Wirkung der verschiedenen Agenten auf die Parameter der Kontraktion zu messenden einschließlich, Kontraktion Kraft (Stärke), Häufigkeit und Dauer, sowie die Integration dieser Werte, um einen Index der gesamten Arbeit getan (mittlere integraler Kraft oder Fläche unter der Kurve, AUC) zu generieren. Da die isolierte Gewebe Streifen Vorbereitung ein Modells von mehr als einer Zelle Art darstellt, kann die physiologische Reaktion des gesamten Gewebes gemessen werden. Die Orgel Bad und isolierte Gewebe Streifen sind daher ein nützliches Werkzeug bei der Bereitstellung von der Brücke zwischen Zelle Kultur Arbeit und Ganztier /in Vivo zu arbeiten. Daher auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung, die Auswirkungen der neuartige Wirkstoffe in Bezug auf ihre exzitatorischen (d. h.anregend) oder hemmende (d.h., Entspannung) potenzielle in Vivo genauer beurteilt werden kann. Diese Technik wurde erfolgreich im Einsatz bei der Entwicklung von Oxytocin und V1a-Rezeptor (OTR und V1aR) Antagonist Atosiban als Tocolytic Mittel um vorzeitige Wehen zu hemmen und Frühgeburt zu verzögern. In-vitro- Tests von Atosiban auf Myometrial Streifen gefunden der Antagonist signifikant senken Oxytocin (OT)-induzierten Kontraktionen28,29,30. Vor allem diese Studien dazu beigetragen, die translationalen Wert von Atosiban validieren und generiert die Proof-of-Concept-Daten nehmen an klinischen Studien31,32,33,34 weiter erforderlich . Atosiban ist jetzt als das Mittel der Wahl verbreitet, um Arbeit in Europa zu verzögern. Ähnliche Proof-of-Concept-Studien wurden für die Oxytocin analoge Carbetocin sein therapeutische Potenzial zeigen bei der Verhinderung postpartale Blutungen35,36,37durchgeführt. Anderen Bleiverbindungen derzeit in der Entwicklung mit diesem Assay gehören Retosiban (GSK221149A)38 und Nolasiban (unveröffentlichte Daten). Diese Methoden haben auch erfolgreich verwendet worden, Vergleich zwischen Patientengruppen39,40,41,42,43,44, 45,46,47 und prüfen für Intra-Arten unterschieden.
Hier beschreiben wir die Verwendung von isolierten ex Vivo Gewebe Streifen von schwangeren menschliche Gebärmutter in kleinen (1 mL) maßgeschneiderte Orgel Bäder zu veranschaulichen, wie diese Methode verwendet werden kann, zu ergänzen und zu validieren pharmakologische Daten aus zellbasierte assays . Biopsien stammen überwiegend aus Frauen Pre-labor elektiven Sectio (CS) Lieferung zu unterziehen, wie sie sind geplante Operation und sind daher leichter zu planen Biopsie Kollektion, haben leichten Zugang zu der Gebärmutter, und Gewebe nicht zu einem gemacht worden werden Uterotonic Stimulanzien oder Beruhigungsmittel vor der Operation. Jedoch Biopsien erhalten Sie ebenfalls von Frauen ungeplant (not-) CS-Lieferung in der Arbeit, vorausgesetzt, es ist genügend Zeit für den Patienten voll und ganz zustimmen. Die meisten Biopsien werden während der Operation von der unteren Uterinsegments auf dem Gelände der chirurgischen Inzision gewonnen, aber es auch möglich ist, Proben aus dem gehobenen Segment48,49erhalten. In einigen Fällen nach Entbindung wurden Stanzbiopsien aus der Plazenta Bett50ermittelt. Aber dies ist nicht die meisten herkömmlichen Route und die Myometrial Gewebe abgerufen ist gering. Nicht-schwangeren Gebärmutter kann vor oder nach der Menopause Frauen unterziehen Hysterektomie für gutartige gynäkologische Bedingungen entnommen werden. Eine volle dicke Biopsie ist gesampelten Post-Pathologie-Prüfung aus dem unteren Korpus von der Zervix und Gebärmutter stammt aus der Mitte von der Gebärmutterwand serosal und endometrialen Oberflächen zu vermeiden.
Während die meisten Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung von menschlichen Erkrankungen bestimmt ist, erfolgt die Grundlagenforschung hauptsächlich in tierischen Geweben. Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung von ex-Vivo Kontraktionen der menschlichen Gebärmutter erhalten von der Operation, die eine Reihe von wichtigen Fragen im Zusammenhang mit uterinen Physiologie und Pathologie sowie funktionale Antworten validieren verwendet werden können für bekannte und neuartige pharmakologische Wirkstoffe zur Unterstützung der Entwicklung von Medikamenten. Insbesondere stellen wir die Verwendung des Assays zu untersuchen, die antagonistische Antwort ein bekannter OTR und V1aR kompetitiver Antagonist, Atosiban auf OT-induzierte schwanger Myometrial Kontraktionen, sowie die Reaktion und Rezeptor zu bestimmen Selektivität von einem neu entwickelten selektive V1aR Antagonisten, [D-Arg8] INT. Wir zeigen, dass wichtige pharmakokinetischen Parameter wie EG50 und IC50 berechnet werden können, die gut mit der Zell-basierte Pharmakologie Daten ausrichten.
Die gleichzeitige Benutzung mehrere Streifen ermöglicht direkten Vergleich mehrerer Agenten Effekte, Wettbewerb Experimente mit Antagonisten sowie entsprechende Zeit und das Fahrzeug. Als Streifen oft in Gruppen von 2, 4 oder 8 vorbereitet sind, bietet diese Technik moderate Durchsatz ermöglichen das Testen von 2 – 4 Verbindungen bei 6 – 8 (kumulativ) Konzentrationen (pro Biopsie). Diese Methode bietet auch Echtzeit-Daten, so dass die Wirkung schnell beurteilt werden können und Protokolle eingestellt werden. Darüber hinaus ist diese Technik kann verwendet werden, um eine Verbindung von Interesse zu testen und wurde durch eine Reihe von Forschungsgruppen konzentrierte sich auf Myometrial Physiologie und in der Drogeentdeckung erfolgreich eingesetzt. Neben reinen Verbindungen zu analysieren, wie in diesem Dokument beschrieben, die uterinen Kontraktilität Modell wurde auch und erfolgreich genutzt werden können, um Bildschirm für neuartige Uterotonic Verbindungen aus Mischungen, wie z. B. pflanzliche Zubereitungen aus traditionellen Medizin7 , 55 , 56.
Obwohl dieses Modell technisch robust ist und gute Reproduzierbarkeit zeigt, es muss einige Einschränkungen: Dissektion kann schwierig sein für diejenigen, die nicht mit dem Gewebe oder mit Dissektion Ausrüstung, damit neue Benutzer werden einige Zeit benötigen, um Gewebe zu optimieren Vorbereitung und Protokolle. Anzumerken ist, dass menschliche Gebärmutter deutlich unterscheidet sich im Aussehen zu anderen Modellen wie Ratte und Maus. Die meisten Nager Uteri bestehen aus zwei schlauchförmige uterine Hörner, jeweils komplett mit einem Eierstock an einem Ende und trat mit der Zervix. Jedes Horn hat klar definierte längs- und kreisförmige Muskelschichten, die bei Dissektion leicht getrennt werden können, während die verschiedenen Fasertypen in menschliche Gebärmutter oft miteinander verflochten sind, bilden ein “Netz”. Darüber hinaus sind die Kontraktion Profile der menschlichen Gebärmutter ganz anders als Nagetiere. Vor allem sind Kontraktionen in der menschlichen Gebärmutter weniger häufige, aber längere Dauer. Experimentelle Zeitrahmen für die Arbeit mit menschlichen Gebärmutter sind daher oft viel länger als Nager-Modelle. Unterschiede zwischen den Arten-Rezeptor-Expression können auch zur recht deutliche Unterschiede in den Antworten zu Agonisten beitragen und dies sollte berücksichtigt werden wenn Hochrechnung der Ergebnisse über Artgrenzen.
Es gibt auch die Anzahl der Schritte, die Rücksicht auf die von diesem System zu maximieren. Wichtige Schritte umfassen die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Gewebe wie kümmert sich beim Umgang mit Gewebe zur Vermeidung von unnötigen Schäden während Dissektion oder bei der Montage. Eine qualifizierte Auge ist erforderlich, um feine Streifen des uterinen Muskels, sicherstellen, dass die Ausrichtung der Muskelfasern in Längsrichtung und Anschluss an die Ebene des Gewebes, und die Vermeidung von Narbengewebe, Decidua und kleine Schiffe zu sezieren. Um Orientierung helfen, sobald die Probe im Labor ist, ist es möglich, einen Tag (z. B. kleine chirurgische Naht) auf der einen Seite der Biopsie, serosal Rand vom deziduale Rand abzugrenzen zum Zeitpunkt der Sammlung hinzufügen.
Gewebe sind stetige 36 – 37 ° c während der Experimente aufzubewahren, wie Gewebefunktion Temperaturschwankungen unterworfen ist. Dies kann mit einer robusten Klimagerät im Labor erreicht werden. Konstante Durchblutung des erwärmten PSS stellt sicher, dass die Temperatur gehalten wird, sowie die Spülung aus Abfallprodukten von Kontraktion. Temperatur innerhalb der Organ-Bäder kann durch Durchflussmenge ändern oder einstellen der Temperatur des Wassers-Bad direkt verändert werden. Die kleine Bad Größe im Vergleich zu traditionellen 5-50 mL Bäder sorgt für einen relativ schnellen Umsatz von PSS und Auswaschung von Reagenzien. Die miniaturisierte Orgel Bad reduziert wie hier beschrieben auch das Volumen der PSS und Reagenzien von Interesse erforderlich, damit Minimierung der Kosten und schonen wertvolle, neu entwickelte Chemikalien. Darüber hinaus aufgrund der kleinen Bad-Größe und mit einem HEPES-Puffer, erfordert dieses System Oxygenierung z.B.nicht von PSS mit Carbogen sprudeln. Wichtig ist auch die Standardisierung der Spannung auf den Streifen aufgetragen. Dies sollte für Streifen dieser Größe (5 x 2 x 1 mm) ca. 2 Mio. (entspricht ~0.2 g). Alternative Methoden umfassen Anwendung eine hohe Kalium-Lösung um maximale Kontraktion und Dehnung auf die Hälfte dieser maximale Kontraktion zu induzieren. Es muss jedoch darauf hingewiesen, diese Spannung in Vivo können abweichen.
Die wichtigsten Herausforderungen Gewebe von Versuchspersonen erhalten unter anderem zwar anstrengend, menschliche Gewebe deutlich vertreten die physiologisch relevante (und lohnende) Modell für das Studium Uteruskontraktion in menschliche Krankheit und Drug Discovery. Das isolierte Gewebe, die Streifen jedoch nicht unbedingt auf Gewebe in Vivo gleichsetzen wie sie z. B. von hormonellen befreit sind und nervös, die geben zwar nicht unbedingt erforderlich für die Kontraktion, werden Kontraktionen in Vivomodulieren. Dieser Test bietet jedoch die Möglichkeit, Myometrial Kontraktionen kontrolliert, von solchen Einflüssen getrennt analysieren. Es ermöglicht auch die Wirkung von Faktoren wie hormonelle Steuerung der Kontraktion (z. B.über OT, VP, Prostaglandine, etc.) untersucht werden, mit Hinweisen auf die Regulierung der Myometrial Funktion. Wie Gewebe von verschiedenen Frauen bezogen werden, gibt es natürlich einige Unterschiede in den spontanen kontraktilen Profilen zwischen Proben. Daher ist es oft notwendig, Experimente auf eine große Anzahl (~ n = 10) der Proben, die Variation in einige Datensätze53zu minimieren. Dies ist am wichtigsten, wenn kontraktilen Aktivität zwischen verschiedenen Patientengruppen zu vergleichen. Normalisieren die Reaktion des Agonisten und Antagonisten, Aktivität zu kontrollieren (d.h., zum Ausdruck zu bringen als ein Prozentsatz der Kontrolltätigkeit oder hohe K+) einige dieser Variante reduziert. Um Inter Streifen Variante zu reduzieren, können darüber hinaus Daten normalisiert werden, um Querschnittsfläche Streifen durch die Messung ihrer Länge und Gewicht Post Experimente41. Dies ist besonders nützlich, wenn Sie Kontraktion Muster zwischen den verschiedenen Patientengruppen zu vergleichen.
Einschränkungen dieser Technik auch Zugang zu frischem Gewebe erfordert gute Arbeitsbeziehungen mit Krankenhauspersonal, vor allem Theater Personal und an die Einwilligung-Prozess Beteiligten. Außerdem müssen ethische Berechtigungen aus der lokalen Ethik-Forschungsethikkommission und Institute oder Krankenhaus Review Board vorhanden sein. Sammlung der menschlichen Gebärmutter ist am ehesten während CS Lieferung durchgeführt, wenn der Spender operiert wird. Die Biopsie ist aus dem gleichen uterinen Schnittführung-Ort für die Bereitstellung des Babys gemacht und der Patient muss daher keine weitere zusätzlichen Verfahren zu unterziehen. Theater Personal und der Chirurg, die Durchführung der Biopsie müssen für die spätere Nutzung des Gewebes sensibilisiert werden und dass sie nicht in Fixativ Lösungen so platziert werden, wie bei einer Pathologie Abteilung senden. Der lange experimentelle Zeitrahmen ist ein weiterer Aspekt. Experimente mit menschlichen Geweben viele Stunden dauern (in der Regel > 6 h) (im Gegensatz zu 2 – 3 h für ein ähnliches Experiment in Ratte oder Maus Gebärmutter), aufgrund der langsamer Frequenz der Kontraktion und der 2 – 3 h Zeitabstand zwischen Gewebe Montage und Einrichtung von spontan Kontraktionen. Aber, wie wir gezeigt haben, menschliches Gewebe Kontraktionen sind robust, und können viele Stunden ohne erhebliche Müdigkeit40Vertrag.
Dieses System erlaubt auch andere Herausforderungen für die in-Vivo -Arbeit überwunden werden, einschließlich der Fähigkeit, pharmazeutische Reagenzien auf Schwangere Gewebe zu testen. Diese Technik kann leicht auf andere Tierarten einschließlich Maus, wobei die ersten Ergebnisse werden, bevor Sie fortfahren bestätigt können, extrapoliert werden im gesamten tierexperimentellen Studien weiter. Kontrollierte Änderungen in der Temperatur, Zusammensetzung des Superfusate (PSS) und pH kann leicht gemacht werden verschiedene Szenarien in Vivo zu imitieren und analysieren die Auswirkungen dieser Änderungen auf zusammengesetzte Verhalten. Die grundlegenden Prinzipien des Messens isometrischen Anspannung in Myometrial Streifen auch erweiterbar um gleichzeitige Änderungen im intrazellulären Calcium-Konzentration oder pH-Wert Messung durch die Verwendung von fluoreszierenden Ca oder pH (H+) Indikatoren und Ausrüstung zu erkennen und Rekord Fluoreszenz57,58,59,60.
Insgesamt repräsentiert der menschlichen Gebärmutter eine robuste und physiologisch relevante Modell zu charakterisieren und neuartige therapeutische Substanzen in der Drogeentdeckung validieren – reine Verbindungen und Mischungen. Wir haben Beispiele seines Gebrauches in der Wirkstoffforschung im Hinblick auf die OT/VP und konzentrierte sich auf OTR und V1einR Antagonisten zu zeigen, wie dieses Modell verwendet werden kann, um zusammengesetzte Wirksamkeit und Potenz auf definierte Ziele bestimmen und Liganden Selektivität zu validieren. Dennoch sollte es berücksichtigt werden, beachten Sie, dass diese Technik kann verwendet werden, um jedes Ziel von Interesse oder Fußweg Myometrial Kontraktion (oder Entspannung) zu studieren, sowie Wirkstoffforschung neue Ziele und Wege zu helfen und unser Verständnis von myometrial Physiologie und Pathophysiologie.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde unterstützt durch die Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) durch Projekt I3243 und der European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (Finanzhilfevereinbarung Nr. 714366). CWG wurde durch ein Australian Research Council (ARC) Zukunft Fellowship (FT140100730) und MM ein ARC Entdeckung frühen Karriere Forscher (DECRA) Fellowship (DE150100784) unterstützt. SA stützt sich auf ein Harris-Wohlbefinden Preterm Geburt Zentrum Forschungsstipendium vom Wohlbefinden der Frauen, UK.
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GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
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Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
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Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
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