이 문서에서는 설명 합니다 인간의 myometrium의 수축 비보 전 약물 발견. 에 그들의 응용 프로그램을 공부 하 고 실험 프로토콜을 이 기술은 myometrial 생리학과 소설 연구 조사에서 약리 데이터 유효성 검사로 이상 뿐만의 이해를 개선 하는 데 사용 됩니다 또는 마약 리드.
발견과 새로운 제약 화합물 또는 생 화 확 적인 프로브의 강력 하 고 순수 관련 분석 결과 시스템에 의존합니다. Ex vivo myometrium 수축 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 요소를 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 및 분자 변조 myometrial 수축 및 그들의 흥분 성의 또는 금지 행동을 결정 하 고 따라서 그들의 치료 가능성 비보. Biopsies는 cesarean 섹션 배달을 동의 받은 여성에서 얻을 수 있습니다. 좋은 스트립 myometrium의 해 부, 클립 및 1 mL 기관 탕 37 ° c.에 생리 식 염 수 솔루션 superfused 이내 힘 변환기에 연결 된 스트립 세트 긴장에서 2-3 h 이내 자발적 수축 개발 하 고 많은 시간 동안 안정적으로 유지 (> 6 h). 스트립 또한 같은 내 생 호르몬 옥 시 토 신과 vasopressin, 수축 주파수의 농도 의존 변조 발생, 강제 하 고 기간 더 많은 유사한 수축 노동에서 계약을 자극 수 있습니다. 따라서, 자연과 주 작동 근 유도 수축에 알려진된 새로운 약물 리드의 효과 테스트할 수 있습니다.
이 프로토콜은 특히이 분석 결과 사용 하 여 인간 myometrial 수축의 다양 한 매개 변수에 대 한 그들의 효과 측정 하 여 알려진된 소설 대리인의 힘을 결정 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 우리 옥 시 토 신 및 V1a 수용 체 길 항 제, atosiban 및 SR49059 옥 시 토 신 그리고 vasopressin 유도 수축 억제 하 고이 메서드를 사용 하 수 보완 하 고 유효성을 검사 하는 방법을 설명 하는 알려진된 화합물의 예를 사용 하 여 약리 데이터 약물 개발 원조 세포 기반 분석 실험에서 얻은. 옥 시 토 신과 vasopressin에 비해 소설 촉진제의 효과 특징 또한 있습니다. 우리는 oxytocin의 예제를 사용 하는 동안 바소 시스템,이 방법은 또한 수 / 다른 수용 체 및 자 궁 수축과 이완을 인간의 자 궁 생리 및 병 태 생리학의 이해를 사전에 역할을 재생 하는 이온 채널을 연구 하는 데 사용.
약물 발견의 목표 생산 소설, 강력한, 그리고 매우 선택적 ligands 활성화 하거나 세포 신호 경로 억제 하 여 치료 응답을 생성 하는 것입니다. 이는 안정적이 고 강력한, 관련 결과1리드 화합물을 테스트 하는 적절 한 분석 결과 시스템이 필요 합니다. 리간드-수용 체 바인딩 및 기능적인 분석 실험 등 약리 기법 자주 분리 셀 기반 시스템, overexpress 수용 체는 존재2되지 않을 것 이라고 설계를 사용 합니다. 이러한 기술을 수용 체의 약리학 및 초기 신약 개발에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 하는 동안 가져온 데이터 진정한 vivo에서 시나리오를 반영 되지 않을 수 있습니다. 그러므로 세포 기반 분석 실험에서 약리 데이터 순수 관련 모델 또한 유효성 중요 하다.
자 궁 평활 근 (myometrium) 조부 자 궁 경부 팽창 하 고 태아3를 제공 하는 노동 하는 동안 수축에 책임 있는 자 궁의 근육 층을 구성 합니다. 축의 myometrium은 자연 스러운; 그것은 호르몬 또는 신경 입력4계약 필요 하지 않습니다. 수축에 대 한 전압 운영 캘리포니아2 +의 개통에 지도 하는 myometrial 세포 막의 자발적인 도발은 가져온 있습니다-채널 (L 형 채널) 및 캘리포니아2 + 셀5으로 유입. 칼슘 calmodulin와 단지 차례로 myosin 말라와 수축과 교차 다리 주기 형성을 활성화 phosphorylates myosin 경 쇄 키 활성화. 휴식은 myosin, myosin 인산 가수분해 효소와의 셀 또는 격리 sarcoplasmic 그물에 (SR)5,6의 압출을 통해 캘리포니아2 + 농도 감소의 탈 인 산화에 의해 일반적으로 중재 ,7.
Myometrial 기능 부전, 자궁내 압력 카 테 터, vivo에서 내부 및 외부 tocography를 myometrial 근원8의 변형 또는 불멸 하 게 세포의 생성을 공부 하 고 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. ,,910,,1112. 세포 배양 시스템 물질 세포 수준에서 역할을 할 수 있는지 여부를 감지할 수 있습니다, 하는 동안 조직 기관 탕 내에서 스트립 약리 약 전체 조직의 기능 응답 측정을 도구로 사용할 수 있습니다. 전통적인 기관 목욕 일반적으로 생리 식 염 수 (PSS)의 5와 50 mL 사이 지주 수 있는 대형 온수 유리 챔버입니다. 이러한 큰 챔버 내 스트립은 일반적으로 산소와 대량의 PSS 통 기 통풍이 필요합니다. 직물의 스트립은 해 부 챔버 내에 입욕 중단 고 수축 하는 동안 같은 긴장에 있는 변화를 측정 하는 힘 변환기에 연결 된. 17,18myometrium 인간을 포함 하 여, 기니 돼지13, 마우스14, 쥐15,16, 토끼 등 동물의 제거, 검사 연구 그룹의 숫자에 의해 사용 되었습니다 myometrial 생리학과 병리학, preterm와 기능 장애 노동력을 포함에 관련 된 많은 질문. 예를 들어 myometrial 스트립 규제 및 조직적 활동19,,2021수정, SR22등의 세포 기관이 함수를 결정 하는 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다 뿐만 아니라 이온의 변조기를 조사23,,2425,26, 펌프와 교환기27 myometrial 생리학에 있는 그들의 역할을 결정 하는 채널.
이 비보 전 기술 있게 조직 수축 성능 평가 및 수축 매개 변수에서 다른 대리인의 직접 효과 측정 등, 수축 힘 (강도), 주파수 및 기간, 뿐만 아니라 총 일 (평균 정수 힘 또는 AUC 곡선 아래의 영역)의 인덱스를 생성 하기 위해 이러한 값의 통합입니다. 격리 된 조직 스트립 준비 하나 이상의 셀 형식의 모델 구성, 전체 조직의 생리 적인 응답을 측정할 수 있습니다. 기관 목욕 및 고립 된 조직 스트립 따라서 셀 문화 작업 및 전체 동물 사이 다리를 제공 하는 유용한 도구는vivo에서 작동 /. 따라서, 약물 발견, 그들의 흥분 성의 측면에서 새로운 대리인의 효과의 분야에서에서 (즉, 자극) 또는 금지 (즉, 휴식) 잠재적인 vivo에서 평가 될 수 있다 더 밀접 하 게. 이 기술은 성공적으로 옥 시 토 신-과 V1a의 개발에 사용 되었다-진통 수축 억제 및 지연 조산 tocolytic 요원으로 (OTR 및 V1aR) 수용 체 길 항 근 atosiban. 옥 시 토 신 (OT)을 크게 줄일 수 적에 게 발견 생체 외에서 myometrial 지구에 atosiban의 테스트-수축28,,2930유도. 중요 한 것은 이러한 연구 atosiban의 변환 값의 유효성을 검사 하는 데 도움이 하 고 필요한 데 앞으로 임상 시험31,,3233,34-의 증거-개념 데이터 생성 . Atosiban는 지금 널리 이용 된다 선택의 약으로 유럽에서 노동 지연. 비슷한 개념 증명 연구 산 후 출혈35,,3637예방 치료 잠재력을 보여 oxytocin 아날로그 carbetocin에 대 한 실시 했다. 이 분석 결과 함께 개발 중인 현재 다른 리드 화합물38 retosiban (GSK221149A) 및 nolasiban (되지 않은 데이터)를 포함 합니다. 이러한 메서드는 또한 환자 그룹39,40,41,,4243,44, 사이 비교를 성공적으로 이용 되었다 45,,4647 내 종 차이 대 한 검사.
우리가 어떻게이 방법을 보완 하 고 약리 데이터 셀 기반 분석 실험에서 얻은 유효성 검사 사용할 수 있습니다 설명 하기 작은 (1 mL) 주문 품 기관 탕 내 임신 인간의 myometrium에서 조직 스트립 절연 ex vivo 의 사용을 설명 하는 여기 . 생 검 조직 것입니다가지고 노출 되지 하 고 그들은 계획 된 수술을 하 고 그러므로 쉽게 생 컬렉션 일정, myometrium에 쉽게 액세스할 미리 노동 선택 제왕 절 개 (CS) 배달을 받은 여성에서 크게 가져온 uterotonic 자극 또는 수술 전에 relaxants입니다. 그러나, biopsies 완전히 환자 동의 충분 한 시간을 제공 하는 노동에서 계획된 (긴급) CS 배달을 받은 여성에서 또한 얻을 수 있습니다. 그러나 그것은 또한 위 세그먼트48,49에서 샘플을 얻을 수 대부분 biopsies의 수술 절 개 사이트에 더 낮은 자 궁 세그먼트에서 수술 하는 동안 얻을 수 있습니다. 몇 가지 경우 다음 질 배달, placental 침대에서 생 검 펀치도 되어 입수50. 그러나, 이것은 대부분의 기존 경로 이며 검색 myometrial 조직 양의 작은. 비 임신 myometrium 양성 부인과 조건에 대 한 자 군 절제를 받은 전 또는 폐 경 후 여성에서 얻어질 수 있다. 전체 두께 생 검, 자 궁 경부에서 낮은 코 퍼스에서 샘플링된 후 병 리 검사 이며 myometrium serosal 자궁내 막 표면 피하 자 궁 벽의 중간에서 가져온 것입니다.
대부분 약물 개발은 인간의 장애의 치료를 위한, 하는 동안 가장 기본적인 연구 동물의 조직에서 주로 수행 됩니다. 여기, 우리는 다양 한 중요 한 질문 자 궁 관련 된 생리학과 병리학, 주소 뿐 아니라 기능적인 응답의 유효성을 검사 하는 사용 될 수 있는 수술에서 얻은 인간 myometrium의 수축 비보 전 을 조사 하는 방법 설명 신약 개발을 돕기 위해 약리 에이전트 알려진 고 소설 특히, 우리는 알려진된 OTR 및 V1aR 경쟁 길 항 근, 임신 myometrial OT 유도 수축에 atosiban 응답 및 수용 체를 확인할의 대립 응답을 조사 하는이 분석 결과 사용 하 여 강조 새로 개발된 된 선택적 V1aR 적, [D-Arg8] 국제의 선택도 시연 EC50 등 IC50 중요 한 pharmacokinetic 매개 변수 계산 수는 잘 약리학 셀 기반 데이터와 함께 정렬 합니다.
동시에 여러 스트립을 사용 하 여 여러 에이전트 효과, 길 항 근, 그리고 적절 한 시간 및 차량 제어 경쟁 실험의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 지구 2, 4, 또는 8의 그룹에서 종종 준비가,이 기술은 적당 한 처리량을, (생 검) 당 6-8 (누적) 농도에서 2-4의 테스트 활성화 제공 합니다. 효과 빨리 평가 될 수 있다 고 프로토콜 조정 될 수 있도록이 메서드는 또한 실시간 데이터를 제공 합니다. 또한,이 기술은 관심 있는 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 myometrial 생리학 및 약물 발견에 초점을 맞춘 연구 그룹의 숫자에 의해 성공적으로 사용 되었습니다. 이 문서에 설명 된 대로 순수 화합물을 분석, 게다가 자 궁 수축 모델 또한 되 고 혼합물에서 소설 uterotonic 화합물과 같은 화면에 성공적으로 이용 될 수 있다7 전통 의학 초본 준비 , 55 , 56.
이 모델은 기술적으로 강력 하 고 좋은 재현성을 보여줍니다, 하지만 몇 가지 제한이 있다: 해 부 그 조직에 익숙하지 어려울 수 있습니다 또는 해 부 장비를 사용 하 여, 따라서 새로운 사용자 필요 합니다 조직을 최적화 하는 데 시간이 준비와 프로토콜입니다. 그것은 그 인간의 myometrium 쥐와 쥐 같은 다른 모델과 외관에서 상당히 다릅니다 주목 해야한다. 대부분 설치류 uteri 두 개의 튜브와 같은 자 궁 뿔의 구성, 각 난소 한쪽 끝에 완전 한 자 궁 경부에 합류 했다. 각 혼은 명확 하 게 분리 될 수 있다 쉽게 해 부에 인간의 myometrium에 다른 섬유 종류 자주 형성 ‘메쉬’ 얽혀있다 동안 경도 원형 근육 층을 정의 했다. 또한, 인간의 myometrium의 수축 프로필 설치류에 매우 다르다. 특히, 인간의 myometrium에 수축 기간에 덜 자주 하지만 더 있습니다. 인간의 myometrium 작업에 대 한 실험 시간 프레임을 따라서 자주 많이 설치류 모델 이상. 종 사이 수용 체 식 차이 주 작동 근 응답에 꽤 표시 차이에 기여할 수 있다 그리고이 종에 걸쳐 결과 추정 하는 경우 마음에 부담 한다.
이 시스템에서 출력을 극대화 하기 위해 고려를 해야 하는 단계 수 있습니다. 중요 한 단계는 조직의 생존을 절 개 하는 동안 불필요 한 손해를 피하기 위해 조직을 처리 하거나 장착을 돌보는 등의 보존을 포함 합니다. 숙련 된 눈은 자 궁 근육, 근육 섬유의 방향에는 경도 방향 및 조직, 비행기 다음으로 흉터 조직, decidua, 및 작은 혈관을 피하는 보장의 정밀한 스트립을 해 부 합니다. 일단 표본 실험실에 오리엔테이션 목적을 투입, 그것은 decidual 가장자리에서 serosal 가장자리 윤곽을 그리 다 생의 1 개의 측에 컬렉션의 시간에 (작은 수술 스티치) 같은 태그를 추가할 수 있습니다.
조직 유지 되어야 한다 안정 36-37 ° C에서 실험 중 온도 변화에 따라 조직 기능으로. 이 실험실 내에서 강력한 공기 조화 단위 달성 될 수 있다. 따뜻하게 PSS의 지속적인 관류 수축에서 폐기물 제품 홍 조 뿐만 아니라 온도 유지 보장 합니다. 기관 욕조 내 온도 유량을 변경 하거나 물 목욕 온도 직접 조정 하 여 변경할 수 있습니다. 전통적인 5-50 mL 탕에 비해 작은 욕조 크기 PSS의 상대적으로 빠른 회전율과 시 약의 희미하게 보장 합니다. 소형된 기관 목욕 여기에 설명 된 대로 또한 감소 시킨다 PSS의 볼륨 및 관심 필요, 따라서 비용을 최소화 하 고 소중한 살려주는, 새로 개발 된 화학 시 약. 또한, 때문에 작은 욕조 크기와 HEPES 기반 버퍼를 사용 하 여,이 시스템 요구 하지 않는다 산소 예를 들어, carbogen와 PSS를 버블링 하 여. 스트립에 적용 되는 긴장의 표준화도 중요 하다. 이 크기 (5 m m x 2 m m x 1 m m)의 스트립,이 약 2 mN (~0.2 g에 해당) 해야 합니다. 대체 방법은 최대한 수축과 수축이 최대의 절반으로 유도 하는 높은 칼륨 솔루션의 응용 프로그램을 포함 합니다. 그러나 주의 되어야 한다, 그 긴장 적용 vivo에서 다를 수 있습니다.
주요 과제는 인간의 과목에서 조직 취득 포함 하지만 부담 스러운, 비록 인간의 조직 명확 하 게 나타내는 가장 순수 인간의 질병 및 약물 발견에 자 궁 수축 공부 관련 (고 보람) 모델. 그러나 스트립 할 하지 반드시 동일시 vivo에서 조직에 그들은 예를 들어 호르몬의 면제 및 신경 입력, 수축에 대 한 중요 하지 비록 격리 된 조직 수축 비보변조 됩니다. 그러나이 분석 결과 myometrial 수축 제어 방식으로, 이러한 영향에서 분리 분석 하는 기회를 제공 한다. 그것은 또한 수 있습니다 (예를 들어, OT, 부사장, prostaglandins, 등을 통해) 수축 호르몬 제어 같은 요인의 영향에 대 한 조사를 myometrial 기능의 규정에 단서를 제공 하. 으로 조직의 다른 여성, 자연스럽 게 표본 간의 자발적 수축 프로필에 약간 변이 이다. 따라서 그것은 종종 많은 수에서 실험을 수행 하는 데 필요한 (~ n = 10) 일부 데이터 집합53에 편차를 최소화 하기 위해 샘플의. 이 때 가장 중요 한 다른 환자 그룹 사이의 수축 활동을 비교. 표준화 활동을 제어 주 작동 근 길 항 근의 응답 (즉, 제어 활동 또는 높은 K+의 비율로 표현)이 변화의 일부를 감소 시킨다. 또한, 간 스트립 편차를 줄이기 위해, 데이터 그들의 길이 무게 게시물 실험41를 측정 하 여 크로스 단면적을 제거 하기 위해서 정규화 될 수 있습니다. 다른 환자 그룹 사이의 수축 패턴을 비교할 때 특히 유용 합니다.
이 기술의 한계는 또한 병원 직원 들, 특히 극장 직원 들과 좋은 작업 관계를 요구 하는 신선한 조직에 액세스를 포함 하 고 그 동의 과정에 참여. 지역 연구 윤리 위원회 및 연구소 또는 병원 검토 위원회에서 윤리적인 사용 권한을 또한 장소에 있이 필요 합니다. 인간의 myometrium의 컬렉션은 가장 가능성이 기증자는 수술 때 CS 전달 중 수행 합니다. 생 검 아기를 전달 하기 위해 만든 같은 자 궁 절 개 사이트에서 가져온 것입니다 하 고 따라서 환자를 더 추가 절차를 받아야 필요 하지 않습니다. 극장 직원 및 생 검을 수행 하는 외과 의사는 조직의 후속 사용 알게 될 필요가 그리고 그들은에 배치 될 통 솔루션 같은 병 리 부서에 보내는 서 하지 않습니다. 긴 실험 기간 또 다른 고려 사항이 다. 인간의 조직 실험 걸릴 많은 시간 (일반적으로 > 6 h) (2-3 h 쥐 또는 마우스의 자 궁에서 비슷한 실험에 대 한), 반대로 수축 및 조직 설치와 자연의 설립 사이 2-3 h 지연 시간 느린 주파수 때문 수축입니다. 그러나, 우리 같이, 인간의 조직 수축은 강력한, 그리고 때 상당한 피로40없이 많은 시간 동안 계약 하실 수 있습니다.
이 시스템은 또한 다른 도전의 vivo에서 작업 임신 조직에 제약 시 약을 테스트 하는 기능을 포함 하 여 극복할 수 있습니다. 이 기술은 다른 종 마우스 초기 결과 진행 하기 전에 확인 하는 수 있다 그것에 의하여를 포함 하 여 쉽게 추정 될 수 전체 동물 연구에서 더. 온도 제어 변경, superfusate (PSS), 그리고 pH의 구성 다른 시나리오에 vivo에서 모방 복합 행동에 이러한 변경의 효과 분석을 쉽게 만들 수 있습니다. 있으 나 myometrial 스트립에서 아이소메트릭 긴장 측정의 기본 원리 형광 Ca 또는 pH (H+) 지표 및 장비 검색을 사용 하 여 동시 세포내 칼슘 농도 또는 pH 변화를 측정 하는 것 또한 확장 될 수 있다 고 형광57,,5859,60을 기록 합니다.
전반적으로, 인간의 myometrium을 특성화 하 고 소설 치료 화합물 신약에 강력 하 고 순수 관련 모델을 나타냅니다-순수 화합물 및 혼합물. 우리 OT/부사장 시스템에 관하여 약물 발견에 그것의 사용의 예를 제공 하 고 OTR과 v 1는는R 길 항 근이이 모델을 사용 하 복합 효능와 정의 된 목표에 힘을 결정 하 고 리간드 선택도 유효성을 검사 하는 방법을 보여에 초점을 맞춘. 그러나,이 기술은 관심 또는 myometrial 수축 (이완)로 이어지는 통로의 어떤 표적 든 지 공부 하로 새로운 목표와 경로의 약물 발견을 돕기 위해 사용할 수 있는 myometrial의 우리의 이해를 미리 마음에 부담 한다 생리학 그리고 이상입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구 프로젝트 I3243 통해 오스트리아 과학 기금 (FWF) 및 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 계약 아니오 714366)에서 유럽 연구 회의 (ERC)에 의해 지원 되었습니다. CWG 오스트레일리아 연구 위원회 (아크) 미래 친교 (FT140100730)에 의해 및 m M 아크 발견 초기 경력 연구원 (DECRA) 친교 (DE150100784)에 의해 지원 되었습니다. SA는 여성 웰빙, 영국에 의해 관리 해리스-웰빙 Preterm 출생 연구 센터 그랜트에 의해 지원 됩니다.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |