Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

Denne protokol udgør en in vitro- live imaging fagocytose assay for at måle astrocytter fagocyterende kapacitet. Renset rotte astrocytter og mikroglia bruges sammen med pH indikator-konjugeret synaptosomes. Denne metode kan registrere real-time engulfment og nedbrydning kinetik og giver en passende screening platform til at identificere faktorer modulere astrocyte fagocytose.

Abstract

Astrocytter er den største celletype i hjernen og direkte kontakt synapser og blodkar. Selvom microglial celler har været betragtet som den store immunceller og kun fagocytter i hjernen, har nylige undersøgelser vist, at astrocytter også deltage i forskellige fagocyterende processer, såsom udviklingsmæssige synapse eliminering og regnskabsafslutning amyloid beta plaques i Alzheimers sygdom (AD). Trods disse resultater er effektivitet af astrocyte engulfment og forringelse af deres mål uklare sammenlignet med mikroglia. Denne mangel på oplysninger er for det meste på grund af manglende en assay system hvor kinetik af astrocyte - og mikroglia-medieret fagocytose er let sammenlignelige. For at nå dette mål har vi udviklet en langsigtet live imaging i vitro fagocytose assay for at evaluere renset astrocytter og mikroglia fagocyterende kapacitet. I denne analyse er real-time detektering af engulfment og nedbrydning muligt ved hjælp af pH indikator-konjugeret synaptosomes, som udsender lys rød fluorescens i sure organeller, såsom lysosomer. Vores nye assay giver enkel og effektiv påvisning af fagocytose gennem live-imaging. Derudover kan denne in vitro- fagocytose assay bruges som en screening platform til at identificere kemikalier og stoffer, der kan fremme eller hæmme astrocytter fagocyterende kapacitet. Som synaptic beskæring funktionsfejl og patogene protein ophobning har vist sig at forårsage psykiske lidelser eller neurodegenerative sygdomme, bør kemikalier og stoffer, der modulerer gliaceller fagocyterende kapacitet være nyttige i behandling af forskellige neurologiske lidelser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glial celler, som refererer til ikke-overgearet celler i hjernen, er den største celletype i centralnervesystemet (CNS). Tidligere blev glial celler betragtet som blotte støtte celler, der hovedsageligt spiller en passiv rolle i opretholdelse af neuronal overlevelse og basal synaptic egenskaber. Imidlertid har nye beviser afsløret at glial celler spiller en mere aktiv rolle i forskellige aspekter af neurobiologi, såsom opretholdelse af hjernen homøostase, mægle synapse dannelse1,2,3 og synapse eliminering4,5, og modulerende synaptisk plasticitet6,7. Gliaceller i CNS omfatter astrocytter, mikroglia og oligodendrocytes. Blandt disse celler, astrocytter og mikroglia har vist sig at spille fagocyterende roller af oversvømmer synapser4,5, apoptotiske celler8, neurale vragrester9og patogene proteiner, såsom amyloid beta plaques10,11. I udvikle hjernen fjerne astrocytter synapser i den dorsale laterale geniculate kerne (dLGN) gennem MERTK - og MEGF10-afhængige fagocytose4. Ligeledes mikroglia også fjerne C1q-belagt synapser under udviklingsstadier gennem den klassiske supplement cascade5. Interessant, er det blevet foreslået, at defekter i synapse beskæring kan være en af initiativtagerne til flere neurologiske lidelser. For eksempel har været vist, at mutationer i komplement komponent 4 (C4), hvilket øger komplement-medieret synapse beskæring af mikroglia, er stærkt forbundet med forekomsten af skizofreni hos mennesker12. Et nyligt papir har også vist, at den klassiske supplement pathway er hyperactivated i indledningen stadier af AD og inducerer tidlig synapse tab i denne sygdom13.

Sammenlignet med mikroglia-medieret fagocytose, er om astrocyte-medierede fagocytose bidrager til indledningen og progression af forskellige neurologiske lidelser mindre klar. Dog, et nyligt papir tyder på, at faktorer, der ændrer satsen for normale synapse beskæring af astrocytter kan forstyrre hjernen homøostase og bidrage til AD modtagelighed og patologi14. Satsen for synapse beskæring af astrocytter er stærkt kontrolleret af ApoE isomerer, med en beskyttende allel for annonce (ApoE2) stærkt øge hastigheden og en risiko allel for annonce (ApoE4) betydeligt sænke satsen. Derudover akkumuleret Transgene mus udtrykker ApoE4 meget mere synaptic C1q end kontrol eller ApoE2 mus14. Disse data tyder på, at nedsat astrocyte-medieret fagocytose i de tidlige AD hjernen kan fremkalde ophobning af senescent C1q-belagt synapser/synaptic vragrester, der aktiverer komplement-medieret microglial fagocytose, kørsel synaptic degeneration . Astrocytter i ApoE4 luftfartsselskaber nedsat fagocyterende kapacitet kan også bidrage til den ukontrollerede ophobning af amyloid beta plaques i AD-ramte hjerner.

Desuden har det vist at glial celler i alderen Drosophila hjernen mister deres fagocyterende kapacitet på grund af nedsat oversættelse af Draper, en homolog af Megf10 , astrocytter bruger til phagocytosing synapser. Genoprette Draper niveauer reddet glial celler, som effektivt ryddet beskadigede cytoskeletale vragrester i alderen hjernen til en lignende omfang som i den unge hjerne, der angiver, at aldring-induceret fagocyterende kapacitet ændringer i fagocyterende kapacitet astrocytter kan bidrage til forstyrrelser af hjernen homøostase15.

Baseret på disse nye resultater, kan modulerende astrocytter fagocyterende kapacitet være en attraktiv terapeutisk strategi til forebyggelse og behandling af forskellige neurologiske lidelser. I denne forbindelse har der været flere forsøg på at forbedre astrocytter, eksempelvis fagocyterende kapacitet ved overtalelse forsuring af lysosomer med sure nanopartikler16 og overekspression transkriptionsfaktor EB (TFEB), som kan forbedre lysosomet Biogenese17. Trods disse forsøg er det stadig uklart, hvordan astrocytter og microglial celler afviger i deres fagocyterende kinetik og om vi skal øge eller mindske deres fagocyterende kapacitet i forskellige sygdomme.

I dette papir præsenterer vi en roman i vitro assay til påvisning af astrocytter fagocyterende kapacitet i realtid. Dataene viser forskellige kinetik af engulfment og nedbrydning i astrocytter og mikroglia. Astrocyte-aircondition medium (ACM), som indeholder udskilles faktorer fra astrocytter, er afgørende for effektiv fagocytose af både astrocytter og mikroglia. Derudover spiller Megf10, en fagocyterende receptor i astrocytter og en homolog Ced-1 og Draper, vigtige roller i astrocyte-medieret fagocytose8,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af The Korea Advanced Institute of Science og Technology institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome rensning

Bemærk: Disse procedurer er tilpasset fra en tidligere udgivne papir19 med flere ændringer til at forbedre udbyttet af renset synaptosomes (figur 1).

  1. Forberede diskontinuert tæthed gradient medier.
    1. Placer følgende på is: 3%, 10% og 23% tæthed gradient løsninger i gradient buffer (bringe til 250 mL vand med 109.54 g saccharose, 606 mg af Tris og 5 mL 0,2 M EDTA, pH 7,4); homogenisering buffer (tilsættes 25 mL 4 x gradient buffer og 500 µL af 50 mM DTT i 74.5 mL vand); homogeniseringsapparat morter og pistil.
      Bemærk: Tæthed gradient løsning og forberedelse er præsenteret i tabel 1. For at forberede 3%, 10% og 23% tæthed gradient løsninger, bruge rå tæthed gradient løsning.
    2. Forberede seks Ultraklart centrifugeglas pr. tre voksne mus.
    3. Tilføj 3 mL af 23% tæthed gradient løsning på bunden af hver centrifugeglasset med 1 mL pipette. Langsomt gør derefter et lag med 3 mL 10% tæthed gradient opklaring oven på 23% tæthed gradient løsningen med græs pipette og 1 mL pipette. Endelig tilsættes 3 mL 3% tæthed gradient på toppen. I dette trin, forsigtig til at undgå at indføre bobler.
    4. Dække centrifugeglas med plastfolie og holde rør på is.
  2. Precool en højhastigheds centrifuge og ultracentrifuge til 4 ° C.
  3. Sterilisere kirurgisk udstyr (drift saks, Castroviejo foråret saks og buet pincet) med 70% ethanol. Forberede et lille glas bægerglas med 25 mL af homogenisering buffer på is og vejer bægerglasset.
  4. Uddrag hjerne fra tre voksne (ca. 12 uger gamle) mand mus.
    1. Splitte den halshvirvel og skære halsen med opererer saks. Skrælle huden på hovedet og kraniet langs midterlinjen ved hjælp af operationelle saks og buet pincet. Punktafgifter olfaktoriske pærer og lillehjernen med Castroviejo foråret saks.
  5. Sætte de resterende hjerner i bægerglasset med buet pincet og vejer hjerner. Skyl hjerner flere gange med iskold homogenisering buffer til at fjerne blod på overfladen af hjernen.
    Bemærk: Tidligere, 9 mL homogenisering buffer til 1 g af hjernens væv blev anbefalet.
  6. Der tilsættes 4 mL homogenisering buffer og 1 g af hjernens væv til homogeniseringsapparat mørtel. Mens homogenisering hjerner, tilføje homogenisering buffer op til 8 mL.
  7. Opdele homogenatet i to 50 mL højhastigheds centrifugeglas. Vaske mørtel med 1 mL frisk homogenisering buffer og tilføje det til rør.
    Forsigtig: Fortsæt gennem trin 1.3-1,7 så hurtigt som muligt. Mindre end 20 min. anbefales.
  8. Der centrifugeres homogeniseret i high-speed centrifugeglas på 1.000 x g i 10 min. ved 4 ° C med langsommere bremser.
    Bemærk: Indstille deceleration sats (bremse) på to eller tre når den maksimale deceleration er ni.
  9. Forsigtigt tilføje supernatanten til en ny 50 mL tube og tilføje op til 12 mL homogenisering buffer.
  10. Forsigtigt og langsomt afpipetteres 2 mL fortyndet supernatanten over 3% tæthed gradient løsning med 1 mL pipette og placere rør på is.
  11. Der centrifugeres ved 31.000 x g i 5 min. ved 4 ° C med ingen bremser.
    Bemærk: Indstiller hastigheden, deceleration på en (nul) eller kyst.
  12. Sted rør på is og indsamle synaptosome fraktion mellem 23% tæthed gradient løsning og 10% tæthed gradient løsning med 2 mL pipette til en 50 mL tube. Tilføje iskold saccharose/EDTA buffer op til 80 mL og opdele den i fire 50 mL højhastigheds centrifugeglas.
    Bemærk: Se figur 3 for fraktionerede synaptosomes med mærket forløb.
  13. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 30 min. ved 4 ˚C med færre pauser.
    Bemærk: Indstil deceleration hastigheden på to eller tre når den maksimale deceleration er ni.
  14. Forsigtigt fjerne supernatanten med 1 mL pipette, resuspenderes synaptosome med 1 mL isotonisk fysiologiske buffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES og 10 mM glucose, pH 7,4)20. Der tilsættes 1 mL af 10% DMSO i isotonisk fysiologiske buffer (endelig koncentration af DMSO: 5%) og indsamle synaptosomes i en 50 mL højhastigheds centrifugerør.
  15. Alikvot 1 mL i 1,5 mL rør. Måle proteinkoncentration af synaptosomes ved hjælp af Bradford assay.
  16. Hurtigt fryse rør og gemme rør i et-80 ° C dybfryser indtil pH indikator konjugering.

2. pH indikator konjugation

  1. Centrifugeres 1,5 mL rør med synaptosomes på 21,092 x g i 3-4 min. ved 4 ° C.
  2. Fjern supernatanten, tilføje 200 µL af 0,1 M Na2CO3 og bland godt ved pipettering.
    Bemærk: Na2CO3 blev tilføjet for at hæve pH som succinimidyl ester mest effektivt reagerer med primære aminer på en svagt basisk pH.
  3. Tilsæt 2 µL af pH indikator til tube og forsigtigt vortex.
    Forsigtig: Brug 1 µL af pH indikator pr. 0,3 mg af synaptosome løsning.
  4. Minimere lys eksponering ved at dække rør med aluminiumsfolie og inkuberes dem i 1-2 timer ved stuetemperatur (RT) i en twist shaker med blid agitation på 30-40 rpm.
  5. Stop agitation og tilsættes 1 mL DPBS.
  6. Der centrifugeres rør ved 21,092 x g i 1-2 min.
  7. Fjern supernatanten og tilsættes 1 mL DPBS til resuspenderes af blid pipettering.
  8. Gentag trin 2.6-2.7 mindst syv gange for at fjerne ubundne pH indikator.
  9. Fjern supernatanten og resuspenderes med 200 µL af DPBS med 5% DMSO.
    Bemærk: på dette punkt, alle synaptosomes er ikke-funktionelle. Vi har bekræftet, at Phosphatidylserin (PS) har været udsat for den ydre membran af synaptosomes, der fungerer som en "spise-mig" signal (figur 4).

3. astrocytter og mikroglia rensning

Bemærk: Denne protokol for astrocyte rensning er tilpasset fra en tidligere udgivne papir21. I denne protokol, er rensning af rotte astrocytter og mikroglia beskrevet. Særlige procedurer for rensning af musen astrocytter og mikroglia er også beskrevet i noterne.

  1. Dagen før rensning
    1. Forberede præ-coatede celle kultur retter og løsninger.
    2. Udarbejde fem 145 mm x 20 mm petriskåle med 25 mL af 50 mM Tris-HCl (pH 9.5). Placer primær eller sekundær antistof behandling i Petriskålene separat som beskrevet nedenfor. Inkuber retter i fryseren natten over.
      BSL-1 fad: 20 µL af 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifola lektin)
      Sekundær-kun parabol: 60 µL af 2,4 mg/mL ged anti-mus IgG + IgM (H + L)
      CD45 parabol: 60 µL af 2,4 mg/mL ged anti-mus IgG + IgM (H + L)
      O4 parabol: 60 µL af 2,4 mg/mL ged anti-mus IgM (µ-kæde specifikke)
      Itgb5 (Integrin β5) parabol for rotte astrocytter: 60 µL af 2,4 mg/mL ged anti-mus IgG + IgM (H + L)
      Bemærk: For at vedhæfte sekundær antistof petriskålen hydrofobe overflade, langsom udlæg ved lave temperaturer kan anbefales. Det er dog muligt at belægge petriskål med sekundær antistof i 2 timer ved 37 ° C. Antistoffer for astrocyte panorering bruges forskelligt afhængigt af dyrearter; for eksempel, HepaCAM parabol for musen astrocytter: 60 µL af 2,4 mg/mL ged anti-mus IgG + IgM (H + L)
  2. Dag af rensning
    1. Forberede immunopanning.
    2. Forberede 50 mL rør og tilføje bestande til rør. Detaljerede stamopløsning forberedelse er præsenteret i tabel 1.
      1. Forberede Tube 1 (enzym): 22 mL af enzymet stock (enzym lager: 1 x Earles afbalanceret saltopløsning (EBSS)+0.46% D (+)-glucose + 26 mM NaHCO3 og0,5 mM EDTA).
      2. Forberede Tube 2 (lav Ovo): 42 mL af inhibitor stock (hæmmer lager: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glucose + 26 Mm NaHCO3).
      3. Forberede rør 3 (høj Ovo): 10 mL af inhibitor lager.
    3. Vedhæfte 0,22 µm sprøjte filtre til spidsen af 2-mL pipetter tilsluttet et CO2 (95% O2 og 5% CO2) tank. Boble CO2 i rør 1-3. Stop boblende når løsningerne vende orange.
    4. Totalløsninger.
      Forsigtig: Komplet og inkuberes løsning i Tube 1 på 34 ° C i 15 min før du bruger til aktivering af enzymet.
      1. Forberede Tube 1 (enzym): 22 mL af enzymet lager + 180 U papain + 0.004 g L-Cystein.
      2. Forberede Tube 2 (lav Ovo): 42 mL af inhibitor lager + 3 mL af lav Ovo + 200 µL af DNase.
      3. Forberede rør 3 (høj Ovo): 10 mL af inhibitor lager + 2 mL af høj Ovo + 20 µL af DNase.
      4. Forberede Tube 4 (0,2% BSA): 19 mL af 1 X DPBS + 1 mL af 4% BSA + 8 µL af DNase.
      5. Forberede Tube 5 (0,02% BSA): 45 mL af 1 X DPBS + 5 mL Tube 4 + 50 µL af DNase.
    5. Forvarm et vand bad og varme blok på 34 ° C.
  3. Uddrag den rotte cortex.
    1. Sterilisere kirurgisk udstyr med 70% ethanol og forberede 100-mm petriskåle med DPBS.
    2. Forberede en akryl boks. Sætte to til tre lag af væv i bunden af boksen og tilsættes 1 mL af isofluran ind i boksen.
    3. Bedøver hvalpe til 20-40 s i boksen og bekræft anesthetization ved foden knivspids med pincet. Udsætte hjerte22 og perfuse unger ved hjælp af en 10-mL sprøjte med DPBS.
      Bemærk: Perfusion bruges til at undgå blodlegemer forurening under trinnet mikroglia panorering.
    4. Skær den pup øvre cervikale linje af halsen med drift saks og incise hoved huden langs midterlinjen. Gøre et snit på kraniet langs midterlinjen og åbne kraniet med buet pincet.
    5. Punktafgifter lillehjernen med Castroviejo foråret saks. Tag de resterende hjernen og placere det i et 100-mm petriskål fyldt med DPBS.
    6. Fjerne andre områder såsom midthjernen og hippocampus fra cortex med Castroviejo foråret saks under mikroskop. Fjerne meninges med fine pincet.
    7. Overføre cortex ind i en ny 60-mm parabol og fjerne de resterende DPBS i fadet. Hak væv med en No. 10 blade.
  4. Adskille cortex i en enkelt cellesuspension
    1. Hæld den filtrerede Tube 1 løsning i en 60-mm skål og tilsæt 50 µL af DNase1. Slyng løsningen i fadet.
      Bemærk: DNase bruges til at hæmme sammenlægning af DNA fra bristet celler.
    2. Placer fadet i en 34 ° C varme blok og dække det med et låg, der har et hul i midten. Brug en loddekolbe til at gøre hullet i låget af petriskålen 60-mm.
    3. Tilsluttes et CO2 tank rør 22-µm sprøjte filtre og Placer filteret spidsen i hullet.
    4. Inkuber parabol på 34 ° C til 45 min. Swirl løsning i skålen hver 10-15 min.
  5. Afslutte forberedelsen af de panorering retter.
    1. Fjerne de panorering retter, der har været belagt med sekundære antistoffer fra fryser om dagen før tid. Forlade BSL-1 skål og sekundær antistof-kun parabol på RT.
    2. Vaske op tre gange med 20 mL af DPBS.
    3. Hæld en passende mængde af 0,02% BSA i opvasken. Placer specifikke primære antistoffer i de tilsvarende retter:
      CD45 parabol: 12 mL 0.02% BSA + 20 µL af 0,5 mg/mL rotte anti-mus CD45
      Itgb5 parabol: 12 mL 0.02% BSA + 20 µL af 0,5 mg/mL Itgb5
      O4 parabol: 8 mL 0.02% BSA og 4 mL O4 antistof
      Bemærk: For mus immunopanning, bruge musen anti-rotte CD45 (0,5 mg/mL) for mikroglia og HepaCAM (0,5 mg/mL) for astrocytter.
    4. Forberede 30 mL 30% FBS med neurobasal medier og 10 mL af 1 X EBSS. Varm op begge løsninger i en 34 ° C vandbad.
  6. Hæmme papain reaktion.
    1. Overføre papain-behandlede væv til en ny 50 mL tube. Vente på væv til at bilægge. Opsug væske af suge.
    2. Tilsættes 4 mL lav Ovo til glasset og slyng løsningen at vaske cellerne.
    3. Gentag trin 3.6.1-3.6.2 tre gange for at stoppe enzym reaktion.
  7. Hakkede cortex væv.
    1. Tilføje 6 mL af lav Ovo til karret. Opsug og frigive væv hurtigt med 5 mL pipette.
      Forsigtig: Ikke indføre bobler.
    2. Forberede en ny 50 mL tube og tilsættes 5 mL af lav Ovo. Indsamle enkelt celler i en ny tube.
    3. Gentag trin 3.6.1-3.6.2 to gange og ændre 5 mL pipette til 1 mL pipette.
    4. Gentag ændring, indtil mere end 95% af væv ikke er synlige.
    5. Gør et lag af høj Ovo løsning fra tube 3 med en 10-mL pipette under lav Ovo-holdige dissocieres celler.
    6. Der centrifugeres ved 190 x g for 6 min med par bremser.
      Bemærk: Indstil deceleration hastigheden på én eller to, når den maksimale deceleration er ni.
  8. Filtratet enkelt celler.
    1. Omhyggeligt Aspirér supernatanten ved sugning, så resuspenderes med 3 mL 0.02% BSA løsning med 1 mL pipette.
    2. Tilsættes 0,02% BSA opløsning op til 9 mL.
    3. Forberede en ny 50 mL tube og 20 µm celle si oven på rør. Våd celle si med 1 mL 0.02% BSA løsning.
    4. Overføre enkelt cellesuspension til celle si. Filtrer 1 mL ad gangen.
    5. Vask celle si med 3 mL 0.02% BSA løsning. Gør ikke mere end 15 mL af den filtrerede enkelt cellesuspension.
    6. Inkuber røret i vandbad 34 ° C i 45-60 min. for celle opsving. Celle opsving trin giver mulighed for relocalization af celle overflade proteiner til membranen.
  9. Udføre panorering af celler.
    1. Vask CD45 panorering parabol tre gange med 20 mL af DPBS. Vask hver ret tre gange med 20 mL af DPBS umiddelbart før brug.
    2. Hæld den enkelt cellesuspension til CD45 panorering parabol. Forlader parabol for 28 min og ryst fadet for 14 min. Hvis du vil fjerne ubundne celler fra bunden, omhyggeligt Ryst fadet.
    3. Overføre cellesuspension til fadet, sekundær-only. Vente 20 min og forsigtigt ryst fadet i 10 min. For at opnå mikroglia fra CD45 parabol, skal du gå til trin 3.9.2.
    4. Overføre cellesuspension i BSL-1 skål. Forlade skålen i 10-12 min.
    5. Overføres til O4 parabol. Vente 20 min og rystes i 10 min.
    6. Overføres til Itgb5 parabol. Forlader parabol i 40 min. og Ryst forsigtigt hver 10 min.
      Bemærk: Til musen panorering, overføre cellesuspension i HepaCAM parabol.
  10. Frigør celler fra fadet.
    1. Mix 400 µL af trypsin (30.000 U/mL i EBSS) med forud inkuberet 8 mL af 1 X EBSS.
    2. Hæld den fritliggende cellesuspension i skålen i en affald spand.
    3. Vask skål otte gange med DPBS.
    4. Hæld 8 mL EBSS med trypsin i fadet.
    5. Inkuber fad i 5-10 min i 37 ° C inkubator. Der inkuberes i 10 min. for CD45 parabol og 5 min til Itgb5 og HepaCAM retterne.
    6. Tryk på skålen og observere fadet under et mikroskop.
      Bemærk: Hvis de fleste af astrocytter ikke er skilt, sæt fadet tilbage i inkubatoren for en anden 5 min.
    7. Hæld 10 mL 30% FBS i skålen til at neutralisere trypsin.
    8. Pipetteres op og ned i hele fadet at løsrive astrocytter eller mikroglia.
    9. Opløsningen overføres til en 50 mL tube.
    10. Der tilsættes 10 mL 30% FBS og 200 µL af DNase i skålen. Frigør cellerne igen. DNase bruges til at hæmme sammenlægning af DNA fra bristet celler.
    11. Opløsningen overføres til røret. Hvis celler forbliver i skålen, tilføjer en anden 10 mL 30% FBS og frigøre cellerne igen.
  11. Plade cellerne.
    1. Der centrifugeres rør ved 213 x g i 10 min.
    2. Opsug supernatanten og resuspenderes celle med medier.
      Bemærk: Brug immunopanned astrocyte grundlæggende medier (IP / ABM) for astrocytter og retinal mikroglia grundlæggende medier (kød-og benmel) med immunopanned astrocyte-aircondition medier (IP-ACM) for mikroglia. IP-ABM og kød-og benmel kompositioner er præsenteret i Tabel af materialer.
    3. Tælle celler med en hemocytometer.
    4. Plade astrocytter og mikroglia separat i PDL-belagte plader.
      Bemærk: Forberede PDL-belagt pladen før brug. Tilsæt 50 µL af 1 mg/mL poly-D-lysin i 5 mL destilleret vand for at forberede PDL-belagte plader, hæld en passende mængde af løsning i den godt tallerken/fad, og vente på 30 min. vask tallerken/fad tre gange med destilleret vand.
    5. Inkuber pladen. Ændre halvdelen af medierne hver 7 dage for astrocytter og 3 dage for mikroglia.

4. indsamle IP-ACM

  1. Udarbejde en 100-mm ret når astrocytter er overdrevent sammenflydende.
  2. Kassér mediet og vask skål tre gange med 10 mL af DPBS.
  3. Hæld 15 mL af lavt proteinindhold medier i fadet.
    Bemærk: Lavt proteinindhold media sammensætning er præsenteret i Tabel af materialer.
  4. Inkuber fadet i 7 til 10 dage i 37 ° C inkubator.
  5. Indsamle og koncentrere medier med 10k (eller 30k) centrifugal filter rør.
  6. Centrifugeres rør på 851 x g ved 4 ° C.
    Bemærk: Centrifugeres rør indtil de resterende medier er mindre end 1 mL.
  7. Indsamle koncentrerede medier (IP-ACM) ind i en ny 1,5-mL-rør.
  8. Mål koncentrationen af IP-ACM ved hjælp af kvantitative analyse

5. fagocytose Live imaging Assay (figur 2)

  1. Forberede en 24-godt plade (eller enhver tallerken/fad, der er forberedt til live imaging) i hvilken astrocytter er sammenflydende (generelt, 7 til 10 dage efter inkubation efter rensning er ideel til stabiliserende cellerne).
  2. Fjern mediet i hver brønd og brøndene vaskes med 1 mL DPBS, tre gange. For at minimere luft eksponering, brøndene vaskes hurtigt.
  3. Tilsæt 300 µL af IP-ABM med 5 µL af pH indikator-konjugeret synaptosomes og yderligere faktorer såsom IP-ACM, der kan modulere glial celler fagocytose.
  4. Inkuber plade i en CO2 inkubator i 40 min. Dette trin giver mulighed for pH indikator-konjugeret synaptosomes til at bilægge til bunden af pladerne.
  5. Fjerne medier med ubundne pH indikator-konjugeret synaptosomes og vaske hver brønd med 1 mL DPBS, tre gange.
    Forsigtig: Ikke vaskes hårdt. For at minimere luft eksponering, brøndene vaskes hurtigt.
  6. Tilsættes 500 µL af IP-ABM med ekstra faktorer til at teste i brøndene.
  7. Tag pladen til en live-imaging instrument og vælge positioner. Justere fokus, eksponeringstid, lysstyrke og LED magt.
    Bemærk: Indstillingerne for eksponeringstid, lysstyrke og LED power er variabel afhængig af fluorescens intensitet og formålet med forsøget. I live-imaging assay med pH indikator-konjugeret synaptosomes, vi normalt angive disse værdier som følger: eksponering: ~ 150-200 ms, lysstyrke: 15, og LED power: 4-6.
  8. Indstille billedformatet, tidsinterval og det samlede antal cyklusser for live imaging. Angive tidsintervallet til 1 eller 2 timer alt efter hvor mange positioner er valgt. 2 timers mellemrum anbefales når mere end 150 positioner er valgt for live imaging.
  9. Start live imaging eksperimenter.
  10. Analysere dataene.
    1. Åbn programmet Fiji.
    2. Importere en billedsekvens. Konverter billeder til 8-bit gråtoner.
    3. Udføre baggrund subtraktion med en rullende bar radius på 50 pixel.
    4. Start tid serien analyzer V3 plugins.
      Bemærk: Adresse for tiden serie analyzer V3 plugins er præsenteret i Tabel af materialer.
    5. Træk region af interesse (ROI) i billedet, og klik tilføjer i Investeringsafkastet manager.
    6. Klik på "Get samlede intensitet" i tidsserier V3_0.
    7. Gem resultaterne og integrere data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette in vitro- fagocytose assay med langsigtede live-imaging brugte vi synaptosomes fra voksne mus hjernen homogeniseret, som var adskilt i den gradient løsning mellem 23% gradient løsning og 10% gradient løsning af ultracentrifugering ( Figur 3). Efter tilberedning udsat synaptosomes PS i deres ydre membran (figur 4), hvilket tyder på, at de mistede deres funktion og kunne blive anerkendt af PS receptorer i astrocytter og mikroglia. Som vist i figur 5, udsendes pH indikator-konjugeret synaptosomes lyse røde fluorescens, når de blev opslugt af astrocytter. Realtid sammenligning af gliaceller engulfment og nedbrydning kapacitet er muligt ved at tage flere billeder af en ROI hver 1 eller 2 h (supplerende film 1, supplerende Movie 2). Med denne metode viste vi forskellige kinetik af astrocyte - og mikroglia-medieret fagocytose (figur 6). For at kvantificere fagocytose af gliaceller, område (µm2) rød fluorescens signal blev målt, som er videregivet til phagocytic indeks i fig. 6B og figur 7. Selvom astrocytter syntes at være effektiv i phagocytosing store mængder af pH indikator-konjugeret synaptosomes, mikroglia var hurtigere på oversvømmer og nedværdigende synaptosomes (fig. 6B). Mikroglia viste maksimale pH indikator intensitet på 26 h efter pH indikator-konjugeret synaptosome behandling, mens astrocytter viste deres maksimum på 45 h (p-værdi < 0,05, to-vejs ANOVA mellem astrocyte med 1 X ACM og mikroglia med 1 X ACM). Ligeledes, microglial celler viste en 20,7% reduktion i samlede pH indikator intensitet 40 h efter det højeste punkt, mens astrocytter viste en 17% reduktion i samlede pH indikator intensitet i den samme periode. Det er interessant, viste vores data, at astrocyte-udskilles faktorer, som var indeholdt i ACM, er afgørende for at øge både astrocyte - og mikroglia-medieret fagocytose (figur 6B). Astrocytter har vist at frigive passerelle molekyler, såsom MFGE8, GAS6 og proteiner, som kan bygge bro og fremkalde interaktioner mellem fagocyterende receptorer og "spise-mig" signaler som PS23. Som nævnt ovenfor, fjerne astrocytter synapser via MERTK og MEGF10 veje4. MEGF10 er kun udtrykt ved astrocytter i hjernen og deltager i synapse engulfment gennem erkendelse "spise-mig" signaler med ukendte identiteter. I samarbejde med tidligere resultater viste analysen, at sammenlignet med wild-type (WT) mus astrocytter, Megf10 knock-out (KO) mus astrocytter besat betydeligt nedsat fagocyterende kapacitet (figur 7). Sammenlignet med WT astrocytter, Megf10 KO astrocytter viste en ca 40% reduktion i samlede pH indikator intensitet på det højeste punkt (31 h) (figur 7).

Figure 1
Figur 1. Skematisk astrocyte rensning ved hjælp af immunopanning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Skematisk af fagocytose live imaging assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentative hjernen homogenatet fraktionering i de gradient løsninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Repræsentative billeder af PS-udsat synaptosomes. (A) A lysfelt billede af astrocytter med synaptosomes. Synaptosomes er knyttet til astrocytter. (B) en fluorescerende billedet af tdTomato-positive synaptosomes, som er renset fra tdTomato-udtrykker mus brains. (C) pSIVA binder til PS, der er udsat for ydre membran af synaptosome, og udsender grønne fluorescens. (D) PS opdaget af pSIVA (grøn) er co lokaliseret med tdTomato-positive synaptosomes (rød). Skalalinjen: 20 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Repræsentative lysfelt og fluorescerende billeder af astrocytter med pH indikator-konjugeret synaptosomes på to tidspunkter. På 11 h efter behandling (nederste panel), pH indikator-konjugeret synaptosomes er opslugt af astrocytter og udsender røde fluorescens, der henviser til, at de gør ikke på 1 time efter behandlingen (øverste panel). Skalalinjen: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Fagocyterende kinetik af rotte astrocytter og mikroglia gennem langsigtede live-imaging. (A) A skematisk diagram af en in vitro- fagocytose analyse ved hjælp af renset astrocytter og mikroglia sammen med pH indikator-konjugeret synaptosomes. Bemærk, at før levende billeder er taget, ubundne synaptosomes er skyllet væk efter 40 min inkubation. (B) repræsentative grafer viser engulfment og nedbrydning kinetik af astrocytter og mikroglia. ACM, som indeholder astrocyte-udskilles faktorer, væsentligt forbedrer både astrocyte - og mikroglia-medieret synaptosome udbredelse. Astrocyte: Kontrol vs. Astrocyte med ACM 1 X, ***, Tukey's flere sammenligninger test. Mikroglia: Kontrol vs. mikroglia med ACM 1 X, ***, Tukey's flere sammenligning test. Fejllinjer angive S.E.M. *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, to-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Nedsat fagocyterende kapacitet på Megf10 KO mus astrocytter med 1 X ACM sammenlignet med WT mus astrocytter med 1 X ACM. WT vs Megf10 KO astrocytter med 1 X ACM, ***, to-vejs ANOVA. Fejllinjer angive S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 to-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: løsning opskrifter. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 1. En repræsentativ live imaging video viser fagocytose af pH indikator-konjugeret synaptosomes af astrocytter. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 2. En repræsentativ live imaging video viser fagocytose af pH indikator-konjugeret synaptosomes af microglial celler. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne artikel præsenterer vi metoder for en langsigtet live imaging i vitro fagocytose assay ved hjælp af renset glial celler og pH indikator-konjugeret synaptosomes. Vi viser, at sammenlignet med mikroglia, astrocytter besidder forskellige engulfment og nedbrydning kapacitet under fagocytose af synaptosomes. Derudover tyder vores data på, at astrocyte-udskilles faktorer, som indeholder passerelle molekyler som GAS6, proteiner og MEGE8, er afgørende for effektiv PS-afhængige fagocytose af glial celler i hjernen. Desuden viser Megf10 KO astrocytter defekte fagocytose af synaptosomes.

For at kunne udføre dette eksperiment, skal medier og DPBS være omhyggeligt udveksles under vask trin (afsnit 5). Primære kulturperler astrocytter og mikroglia, især mikroglia, er sårbare over for air eksponering. Derfor, at reducere tidsintervaller mellem vask trin er afgørende for at opretholde levende celler. Manuel fokus anbefales for opsætning af langsigtede live-imaging med live imaging instrumenter, da autofokus kan øge laser/LED eksponeringstid, som kan skade cellerne.

I denne metode, er synaptosome rensning protokol19 ændret en smule. Det oprindelige papir adskiller gradient løsninger i 3%, 10%, 15% og 23%. Men vi oprettet 3%, 10% og 23% gradient løsninger til at øge udbyttet af renset synaptosomes. Vejledningen for immunopanning astrocytter og microglial celler er også ændret i denne metode. Målet med den oprindelige panorering protokol21 er at rense kun astrocytter og bruge BSL-1, sekundær-only, CD45, O4 og Itgb5 (HepaCAM for mus) som immunopanning ordren. Da BSL-1 og kun sekundært-plader vil fjerne endothelceller samt mikroglia, vi ændret rækkefølge til CD45, sekundær-only, BSL-1, O4 og Itgb5 (HepaCAM for musen) til at øge udbyttet af mikroglia fra CD45 panorering parabol. I denne protokol, vi også perfunderet SD rotte unger (~ P7-P10) med DPBS gennem kredsløbet at fjerne forskellige blodlegemer for at minimere forurening fra CD45-positive ikke-microglial populationer.

Der er flere fordele ved in vitro- fagocytose assay. PH indikator anvendes i synaptosome konjugation udsender kun røde fluorescens i lav pH betingelser. Derfor, når behandling af data, kan vi direkte kvantificere røde fluorescens som et signal om fagocyterende begivenheder uden en quenching procedure til at fjerne baggrunden signaler eller kompliceret imaging analyse for at få Co lokaliserede signaler opslugte materiale inde i fagocytter. Desuden giver denne metode real-time tracking af glial fagocytose ved at tage billeder af pH indikator intensitet inden for en given ROI på flere tidspunkter. Ved at generere en graf med pH indikator intensiteten op til 100 h, engulfment samt nedbrydning kan kapacitet nemt overvåges mellem forskellige celler og betingelser. En anden fordel er brugen af synaptosomes. Da astrocytter ensheathe synapser hele tiden med deres fine processer og har været vist at opsluge synapser i vivo4, ved hjælp af synaptosomes er meget velegnet til måling af in vitro- fagocyterende kapacitet af astrocytter. Endelig, denne in vitro- fagocytose assay har potentiale til at blive udviklet for at studere glial fagocytose af myelin snavs eller amyloid beta, som er forbundet med forskellige neurologiske lidelser.

Med levealder er en dramatisk stigning i antallet af patienter med neurodegenerative sygdomme uundgåelig. Synapse tab gennem gliaceller er en af de førende faktorer i flere neurodegenerative sygdomme13,14. Hertil kommer, kan unormale synapse beskæring og en ubalance i hjernen homøostase være forbundet med glial fagocytose defekter. Derfor, at identificere faktorer og stoffer, der kan styre engulfment og nedbrydning kapaciteter i astrocytter kan være kritisk for at finde vellykkede behandlinger for forskellige neurologiske lidelser. Da denne i vitro fagocytose assay kan let skaleres op med flerhulsplader, kan denne metode bruges som en egnet platform for forskellige screeninger til at identificere sådanne faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Yeon-Joo Jung for hendes eksperimentelle støtte under synaptosome rensning og Jungjoo Park for billeder af synaptosomes med PS eksponering. Derudover takker vi alle medlemmer i Chungs laboratorium for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af Danmarks Grundforskningsfond i Korea (NRF) tilskud finansieres af den koreanske regering (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 og NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164, (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486, (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13, (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504, (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539, (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155, (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36, (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28, (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8, (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160, (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530, (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352, (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34, (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96, (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, (1), 264-278 (2008).
En roman <em>In Vitro</em> Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter