Summary
プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。
Abstract
ペプチドは、N-アルキル グリシン ユニットで構成されるシーケンス制御ペプチド模倣オリゴマーです。多くの潜在的なアプリケーション間で、ペプチドは、分子情報ストレージの種類としての考えられてきました。質量分析は、配列ペプチドの選択の方法を考えられています。ペプチドは、繰り返し 2 段階反応サイクルを用いた固相化学経由で合成できます。タンデム質量分析 (MS/MS) 技術を用いたペプチドの順序を分析する手動でオリゴ ペプチドを合成する方法をご紹介します。サンプル peptoid は、n-(2-アミノエチル) グリシン (ナエ) N 末端と同様に n-(2-methyloxyethyl) グリシン (Nme) と n-(2-フェニルエチル) グリシン (Npe) を交互に構成される nonamer です。Peptoid のシーケンス式は Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2Ac がアセチル基であります。合成は、市販の固相反応容器で行われます。スケート リンクのアミド樹脂は C 末端にアミド基をもつ peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。結果の peptoid 製品は、エレクトロ スプレー イオン化ソースに結合トリプル四重極質量分析計を用いたシーケンス解析を受けます。MS/MS 測定は、充電 peptoid の解離から生じるフラグメント イオンのスペクトルを生成します。フラグメント イオン質量電荷比 (m/z) の値を基に並べ替えられます。フラグメント イオンの m/z 値は peptoid 断片化のスキームに従って理論的に予測されたフラグメント イオンの名目の固まりと比較されます。分析は、充電 peptoid のフラグメント パターンを生成します。断片化パターン中立的な peptoid のモノマー シーケンスに相関しています。この点で、質量分析は、ペプチドのシーケンス情報を読み出します。
Introduction
ペプチドは、ペプチドの構造を模したバックボーン構造を持つシーケンス制御された高分子のクラスです。ペプチド合成できる多様なアミンから高度可変プロパティ1,2を展示するペプチドを可能にします。ペプチドは、生物物理学的研究、治療薬として考えられている、タンパク質3,4,5,6配位子として設計されて分子モデルとして使用されています。ペプチドは、防汚と抗体ミメティック材料、抗菌薬、酵素阻害剤7,8,9などの生理活性物質の多様性に開発されています。高い順序と可変自然とペプチドも考えられたの分子情報ストレージ10の種類として。シーケンスとペプチドの構造を特徴付けるため効率的な分析法の開発のためのこれらの多様なアプリケーション呼び出しの発見。タンデム質量分析を用いた手法は、ペプチド11,12,13を含む、シーケンス制御された高分子のシーケンスのプロパティを分析するための選択の方法として約束を示しています。 14,15。しかし、体系的な研究から生じる peptoid イオン断片化パターンを関連付ける質量分析研究、ペプチドの構造情報が非常に限られました。
ペプチドは、固相メソッドを使用して容易に合成することができます。よく発達したメソッドには、2 段階モノマー添加サイクル16,17のイテレーションが含まれます。またサイクルごとに樹脂連結アミンはハロ酸 (通常ブロモ酢酸、BMA)、によってアセチル化し、第一次アミンの置換反応が続きます。標準化学研究所16,18,19、で優秀な利回りとペプチドを手動で合成できる自動合成プロトコルは、peptoid 合成の日常的に適用されているが20。
当研究室は、手動 peptoid 合成法を採用したあり、既存のメソッドで使用される装置を簡略化します。ペプチド ・ MS/MS テクニック21,22,23を使用して一連の分裂パターンは学んだこともあります。衝突誘起解離 (CID)21,23にさらされるまたは電子捕獲解離 (ECD)22実験時、ペプチドが特徴的な分裂を生成することが分かった。この記事では、標準的な化学実験室でのオリゴ ペプチドの合成方法、トリプル四重極の質量分析計を用いた CID 実験を実行する方法およびスペクトル データを分析する方法を示しています。合成して特徴付けられる peptoid は、N 末端アセチル化、C 末端アミド化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と nonamer です。Peptoid の構造を図 1に示します。
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Protocol
1. Peptoid の合成
注: 合成樹脂の樹脂を膨潤・保護グループを削除するアクティブにするから始まります。樹脂モノマー添加サイクルの繰り返しで上に peptoid チェーンの成長が続きます。樹脂と結合した最初の単量体は、C 末端残基です。Peptoid は N 末端から C 末端細長い。目的の peptoid シーケンスを達成すると、樹脂はオフ切断、peptoid 製品を精製します。
- 試薬の調製
注: 液体の試薬、マイクロ ピペットを使用して測定したで、固体試薬分析用天秤を用いています。- ミックス 6.2 mL の n、N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) と n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) DIC/DMF 溶液の 0.8 M を準備する 43.8 mL。
- 0.8 M BMA/DMF 溶液を調製する DMF の 50.0 mL に BMA の 5.56 g を溶解します。
- 2 mL ピペリジン (Pip) の 20% DMF Pip/ソリューションを達成するために DMF の 8 mL を混ぜます。
- 1.9 mL Npe の 1.0 を達成するために DMF の 13.1 mL に溶解 M Npe/DMF。
- 13.7 mL 1.0 を達成するために DMF に Nme の 1.3 mL を溶かす M Nme/DMF。
- 0.32 mL ナエの 1.0 を達成するために DMF の 2 mL に溶解 M ナエ/DMF。
注意: 合成に使用される化学物質のほとんどは、危険です。トリフルオロ酢酸 (TFA) や DIC、Pip、BMA は、皮膚、目、呼吸器に有害な。DMF、ジクロロ メタン (DCM) は、発がん性を疑われています。ヒューム フードすべての反応を実行して、適切な個人用保護具を使用する必要があります。合成で使用されるすべての化学物質の化学物質等安全データシート (MSDS) をご確認ください。
- 樹脂活性化
- 84 mg 場アミド樹脂 (樹脂、0.047 ミリ モル 0.56 ミリ モル/g の読み込み) を測定し、10 mL のポリプロピレンの固相反応容器に追加。プランジャーを容器に挿入します。
- 反応容器に DMF の 2 mL を加えて圧力キャップと容器のキャップします。シェーカーに容器を置き、キャップを取り外し、反応容器のプランジャーを押すことによって廃棄物コンテナーに約 12 度と 385 振動/分 30 分排水ソリューションのための動きの角度で常温で容器を揺り動かしなさい。
- 容器に 20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加えて、容器のキャップします。2 分、シェーカーの扇動し、ドレインの廃棄物コンテナーにソリューション。
- 20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加える容器、キャップ、容器とキャップ 12 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄容器への解決策をドレインします。
- DMF、キャップ、容器の 1 つの mL を追加することによって樹脂を洗い、キャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレイン 1 分の容器を攪拌します。4 追加回 DMF と樹脂を洗浄します。
- モノマーを添加し、N 末端のアセチル化
注: 各モノマー添加サイクルは、2 つの反作用のステップ、bromoacetylation、変位を伴います。- Nme 樹脂フォーム最初のモノマー添加サイクルを実行します。
- Bromoacetylation 反応を実行します。0.8 M BMA/DMF 溶液の 1 mL のビーカーに 0.8 M DIC/DMF 溶液 1 mL を混ぜます。樹脂を含む反応容器に混合物を転送し、容器のキャップします。シェーカーに容器を置くとキャップ 20 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄物コンテナーにソリューションをドレインします。
- DMF の 1 mL を追加する、容器のキャップ、1 分攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水によって樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。もう一度、DCM の樹脂を洗浄し、DMF で 2 回洗ってください。
- 置換反応を行います。1.0 M Nme/DMF 溶液の 1 mL を追加し、容器のキャップ、キャップ 60 分削除のため室温で容器を扇動、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインします。
- 1 mL DMF を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。1 ml の DCM、1 分攪拌を描画し、排水ソリューションにより樹脂を洗浄します。DMF で 2 回洗浄後もう一度、DCM を洗います。
- 1.3.2 に 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4を形成するための手順からモノマー添加サイクルを繰り返す-樹脂。置換反応 (1.3.4) の手順を繰り返し、peptoid 順序に従って特定アミン溶液を使用します。
注: peptoid チェーンが伸長する C 末端から N 末端に樹脂にバインドされている C 末端残基を持つ。 - Ac-Nae-(Npe-Nme)4を形成する N 末端アセチル化を実行-樹脂。
- ミックス 92年 μ L の酢酸無水、43.5 μ N、N diisopropylethylamine (DIPEA)、ビーカーに DMF の 2 mL、約 2 mL のアセチル化をカクテルを作る。
- 樹脂を含む容器に 2 mL のアセチル化のカクテルを追加、キャップ、容器および 60 分のキャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインの室温でそれを扇動します。
- DMF の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。DCM、一度より多くの樹脂、さらに 2 回 DMF で洗浄洗浄を繰り返します。
- DCM の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM で 2 回洗浄を繰り返します。キャップをはずし、10 分間反応容器内空気乾燥させる樹脂。
- 胸の谷間と浄化
- TFA、triisopropylsilane (ヒント) を 100 μ l 添加 HPLC グレード H2O ビーカーに 100 μ L の胸の谷間の 4 mL のカクテルを作るための 3.8 mL を混ぜます。
- 4 mL の新鮮な作った胸の谷間カクテル樹脂を含む容器に追加、容器、キャップ、2 時間室温で攪拌します。
- キャップをはずし、50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液ソリューションを収集します。容器に TFA の 1 mL を追加、キャップ、および 1 分同じ遠心管に収集濾液ソリューションを扇動します。
- 粘性解は左が約 1 mL まで窒素ガスのストリームで優しく吹いて TFA を蒸発させます。
- 残りの溶液にジエチル エーテル 15 mL を追加、遠心分離機管のキャップ、一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーでそれを孵化させなさい。原油の peptoid は、白色固体として析出します。
- 遠心分離機管のキャップ 10 分削除 4,427 × g で遠心分離機を用いた固体のペレットし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカントします。
注意: ジエチル エーテルは可燃性の有機溶剤です。ジエチル エーテルの安全なの遠心分離機を使用してください。 - 洗浄は遠心分離機に冷たいジエチル エーテル 10 mL を加えることによって固体管、固体を含むチューブをキャップと遠心分離機で配置すること。10 分間遠心遠心分離機からチューブし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカント削除 4,427 × g で遠心分離を行います。
- 固体を乾燥するには、窒素ガスのストリームでやさしく吹いて。
- HPLC グレード H2O 乾燥した固体を溶解するための 10 mL を追加します。ソリューションを孔径 0.45 μ m のナイロン シリンジ フィルターを通過し、前加重 50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液を収集します。
- シェル固定ソリューションを配置し、液体窒素で満たされた 12 オンス、ダブル スタック拡張ポリスチレン カップに 1/3 peptoid ソリューションを含む遠心管を回転します。固体 peptoid を生成するため冷凍ソリューション一晩を凍結乾燥します。
- HPLC グレード H2O の mL の 10 に固体 peptoid を溶解して凍結 1 つより多くの時間を繰り返し、液体窒素で凍結し、一晩を lyophilizing をシェルします。結果として得られる peptoid は、質量分析法による配列解析のために十分に純粋です。
2. MS 測定と解析
注: MS/MS 実験はエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) ソースに結合トリプル四重極質量分析計で実施です。データ コレクションは、楽器を伴うデータ集録ソフトウェアを使用して制御されます。一般的な手順が含まれています 1) フル スキャン質量分析実験を行うと実験 2) MS/MS シドを実行する質量スペクトルを記録、MS/MS スペクトルを記録し、3) 理論 MS/MS スペクトル データを比較します。フラグメント化スキームは、peptoid の構造的特徴に基づく予測します。
- 試料溶液の調製
- 3-5 mL のガラス瓶で 1.0 2.0 mg 固体 peptoid を重量を量る。溶解、peptoid に 1 mL 混合溶剤のアセトニ トリルと水 (ACN/H2O、1:1、v/v) を追加します。これは約 10-3 M の濃度でストック サンプル ソリューションを提供します。
- 1.5 mL 遠心チューブに 20 μ L の原液を転送し、ACN/H2O 約 10-5 M の希釈試料溶液を生成するための 1 mL 混合溶媒を追加します。
- 3 分別 1.5 mL 遠心にソリューションのトップの部分の約 700 μ L を転送の 4,427 × g で遠心分離を実行することによって希釈試料溶液の任意の可能な不溶性粒子 peptoid MS の実用的なソリューションを作るにチューブを削除約 10-5 M の濃度。
- 質量分析法による測定では, 観測信号強度に基づく MS 作業溶液の濃度を調整します。
- 0.20 μ m シリンジ フィルターを試料溶液を通過し、濾液を収集 peptoid MS 約 10-5 の実用的なソリューションを作るに 1.5 mL 遠心チューブには希釈試料溶液の任意の可能な不溶性の粒子を除去する方法M。
- 質量スペクトルを記録
- エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 源によって ACN/H2O (1:1、v/v) の混合溶媒を実行し、標準的な肯定的なイオンの計測器、質量電荷比 (m/z) 100-1500 の範囲と完全なスキャン質量分析モードを設定します。
メモ:
典型的な動作パラメーター:
ESI 針電圧 5 kV
キャピラリー電圧 40 V
乾燥ガス (窒素ガス) の温度は、200 ° C - 500 μ L または 1 mL の注射器に peptoid MS 作業ソリューション (約 10-5 M) の約 300 μ L を追加し、キャピラリー ポリエーテル エーテル ケトン (ピーク) チューブを用いた ESI 入口に注射器を接続します。シリンジ ポンプに注射器を置き、ESI 入口に試料溶液を注入する 10 μ L/分の流量を設定します。
- ESI プロセスをアクティブに ESI 針電圧をオンにし、検出器の電源を入れます。プロフィール モードで 100-1,500 の m/z 範囲表示を設定します。プロファイル ウィンドウに示すように質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 (m/z 1,264.6 のとして表示) でピークは peptoid イオンまたはプロトン化 peptoid に対応します。
- 2 分の MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。
注: 結果の質量スペクトルは図 3に示すです。 - M/z 1,265 のピークの強度を最適化します。1,150 1,350 m/z 範囲を設定し、プロフィール ウィンドウに表示される mV でピーク強度を表示しながら毛細血管の電圧を調整します。たとえば、増加するキャピラリー電圧 50 V をまたはより高いピーク強度の変化を見ると。最適なピーク強度は 150-200 mV。
注: キャピラリー電圧を調整すると、特定イオンの豊かさが大きく変わる。キャピラリー電圧を増加 peptoid イオンの強度を高めることができます。しかし、高キャピラリー電圧がイオン源の peptoid イオンの解離を引き起こすも、観測強度を減少します。M/z 1,265, ピークの強度を高めることができるガスを乾燥の温度を調整するキャピラリー電圧を調整するよりも効果的です。M/z 1,265 でピークが最適な強度が到達しない場合は、サンプルの濃度 (または二重 MS 作業溶液の濃度など) を調整します。 - 楽器を MS/MS モードに切り替えます。M/z 1,265 前駆イオンを設定し、MS/質量質量 100 1,400 の m/z の範囲。「メソッド ウィンドウ」で「第 1 四半期最初のミサ」として m/z 1,265 を使用し、、「第 1 四半期最後のミサ」を空白のままにします。「Q3 最後質量」として「第 3 四半期最初のミサ」、m/z 1,400 m/z 100 を使用
注: MS/MS モード、前駆イオンと peptoid イオンを分離する質量フィルターとして最初の四重極ユニット (Q1) 機能で第 2 四重極ユニット (Q2) は衝突セルと 3 つ目の四重極ユニット (Q3) 機能質量分析器として。 - 1.5 mtorr 圧 40 eV で衝突エネルギーと衝突ガス (アルゴン、この場合) セットします。
- プロファイル ウィンドウに表示質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 のピークは peptoid イオンに対応し、m/z 値の低いピークは peptoid イオンからフラグメントを表します。
- 断片化スペクトルの表示を最適化するために衝突エネルギーを調整します。45 eV に衝突エネルギーを増やすなど、スペクトルの変化を表示します。
注: 一般的に、衝突エネルギーを増加強化フラグメント イオンの豊富なし peptoid イオンの豊かさを減らします。衝突ガス圧力を増加させると、フラグメント イオンの豊かさをまた高めます。
注意: 2 mTorr を超えて衝突ガス圧を増やさないでください。 - 2 分の MS/MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。
- 1-2 回の記録を繰り返します。
- エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 源によって ACN/H2O (1:1、v/v) の混合溶媒を実行し、標準的な肯定的なイオンの計測器、質量電荷比 (m/z) 100-1500 の範囲と完全なスキャン質量分析モードを設定します。
- Peptoid シーケンス解析
注: CID の条件の下で一連の B イオンと呼ばれる N 末端フラグメントと Y イオンと呼ばれる C 末端フラグメントのシリーズを生成する peptoid バックボーンに沿ってアミド結合でフラグメントは peptoid イオン- 左側と右側に、C 末端に N 末端を置くことによってアセチル化 peptoid の化学構造を描画し、フラグメント化スキームを図 2 aに示すように、生成する各アミド結合で破線を描画します。電荷キャリアを示す破線の円内でプロトンを描画します。構造体の左側から開始して、B1B2B8として N 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。右側から始まって、Y1Y2Y8として C 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。
注: 化学ソフトウェアの描画は、peptoid 構造を描画する使用できます。 - 左から 4番目のアミド結合での断片化を想像して、N 末端フラグメントと図 2 bに示すように、適切な正式な料金と C 末端フラグメントの構造を描きます。N 末端フラグメントで B4のラベルを配置し、C 末端フラグメントの Y5のラベルを配置します。580 の値を生成するための構造の要素の公称質量を合計することによって B4の m/z 値を計算し、N 末端フラグメントで 580 m/z を配置します。Y5 m/z 値を計算し、C 末端フラグメントの 685 m/z を配置します。
- すべて 8 B イオンおよびすべての 8 Y イオンの m/z 値を計算し、表 1に示すように、テーブルでは、それらを組み立てます。
注: フラグメントの m/z 値は描画ソフトウェア化学を使用して計算できます。 - 楽器を伴うデータ レビュー ソフトウェアを使用して peptoid の記録の MS/MS スペクトルを開きます。「イオンのラベルを表示する」にラベル設定とラベルしきい値を 3% に設定します。これはピークのラベルの付いた m/z 値の MS/MS スペクトルを生成します。
- MS/MS スペクトル データを csv ファイル形式のテキスト ファイルとして書式設定し、データ処理ソフトウェアを使用してスペクトルを再構築をエクスポートします。ピークの m/z 値を配置します。結果の MS/MS スペクトルを図 4に示します。
メモ: いくつかの質量分析計は、MS/MS スペクトルを生成するデータ処理ソフトウェアが装備されています。この場合、MS/MS スペクトル データをエクスポートする必要はありません。 - 表示、対応する B と Y-イオンを識別するために表 1に示されるように MS/MS スペクトル m/z 値を割り当てます。B4m/z 580 でピークを識別するたとえば、-イオンと 685 m/z が Y5として識別されて-イオン。図 4に示すように、スペクトルに対応する B と Y 記号のピークのラベルを付けます。
- 左側と右側に、C 末端に N 末端を置くことによってアセチル化 peptoid の化学構造を描画し、フラグメント化スキームを図 2 aに示すように、生成する各アミド結合で破線を描画します。電荷キャリアを示す破線の円内でプロトンを描画します。構造体の左側から開始して、B1B2B8として N 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。右側から始まって、Y1Y2Y8として C 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。
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Representative Results
N 末端アセチル化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と 9 mer の peptoid の構造を図 1に示します。Peptoid は、固相によるガラスフリットのポリプロピレン製反応容器に手動で合成されました。スケート リンク アミド樹脂 (0.047 ミリ モル、0.56 ミリ モル/g の読み込みに 84 mg) は、化の C 末端と peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。Peptoid チェーンは、モノマーを添加の複数のサイクルによって構築されます。各モノマー添加サイクルには、2 つの反応の手順、bromoacetylation、変位が含まれます。0.8 M BMA ソリューションと 0.8 M DIC ソリューションを追加することによって、bromoacetylation を実現し、反応は 20 分。1.0 M アミン水溶液をアセチル化製品に追加することで変位を達成し、無水酢酸の 92 μ L、DIPEA、43.5 μ、DMF の 2 mL を含むカクテル ソリューションを追加することによって反応は 1, N 末端アセチル化を行った。Peptoid は樹脂からオフ 3.8 mL の HPLC グレード H2O の 100 μ L、100 μ L のヒント、TFA を含むカクテル ソリューションを追加することによって切断され、約 1 mL 粘性まで窒素ガスのストリームで爆破してボンネットの反応は 2 h. TFA が削除されます。解決策が残っています。Peptoid 製品ジエチル エーテル沈殿物および遠心分離によって分離し、凍結乾燥の 2 つのイテレーションが続きます。その結果 peptoid はタンデム質量分析のために十分に純粋です。
図 2 a、破線の円内のプロトンが CID 実験中に peptoid 断片化を誘導する「モバイル プロトン」を示す、peptoid の予測されたフラグメント化スキームを示します。Peptoid イオンを断片化サイトは破線で示されます。 peptoid バックボーンに沿ってアミド結合のフラグメントします。N 末端フラグメントは B 型イオンとしてラベル付けされて、C 末端フラグメントは Y 型イオンとして表されます。断片化がすべてで発生した場合は、利用可能なアミド結合、B1 B8、8 N 末端フラグメントの合計と Y1 Y8、8 C 末端フラグメントの合計となります。各フラグメントは、フラグメントのすべての要素の公称質量を合計によって計算される対応する m/z 値を持ちます。例, 構造と B4の対応する m/z 値 (公称質量)-イオンと Y5-イオンは図 2 bに示すように。B4イオンの化学式は C31H42N5O6+、質量の公称値を計算するには、式 (12 x 31) + (42 × 1) + (5 × 14) + (6 x 16) = 580。B4が単独でイオンの m/z 値なので 580/1 = 580。図 2 b、4B の構造-イオンが簡略化された (議論については、詳細を参照してください) を形成します。表 1に、すべてのフラグメント イオン B1-B8 Y1Y8から計算される m/z 値 (公称質量) が与えられます。
質量分析には、2 つのプロセスが含まれています。最初のプロセスは、peptoid サンプルの完全スキャン質量分析を行うことです。この結果は、peptoid の測定可能な量とサンプルの相対的な純度がサンプルに含まれているかどうかを示します。Peptoid イオンのフル スキャン質量スペクトルはに示す図 3どこ m/z 値は最も近い整数に丸められます。M/z 1,265 ピーク プロトン化 peptoid する、m/z 1,287 のピークがナトリウム イオンに対応、peptoid の付加物します。M/z 633 と m/z 644 で 2 つのピークはそれぞれ二重プロトン化および混合のプロトン化 sodiated ペプチドに対応します。Peptoid サンプルは MS/MS 分析を遂行するために十分に純粋が示唆されました。
質量分析の 2 番目のプロセスは、m/z 1,265 でプロトン化 peptoid の MS/MS 実験を行うことです。このプロセスでは、最初の四重極ユニット、断片化は CID、peptoid イオンと第三極ユニットで m/z 値によるとフラグメント イオンを並べ替えによる前駆体 peptoid イオンを分離する含まれています。結果として得られるスペクトルはに示す図 4どこ m/z 値は最も近い整数に丸められます。M/z 1,265 のピークは、プロトン化 peptoid に対応します。M/z 値を下げるほどの他のピークは、peptoid イオンからのフラグメント イオンに対応します。フラグメント イオンは、これら予測 (表 1に示されている) (図 2に示すように) peptoid フラグメント化スキームに基づくと、m/z 値を比較することによって B イオンまたは Y イオンとして割り当てられます。7 Y-イオン (Y8Y2 ) および 7 つの B イオン (B1 B7) 観察可能な元素で形成されます。Y イオンの豊富さがほとんどの B イオンのそれよりもはるかに高いことに注意してください。
図 1: peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2の化学構造。Peptoid は、固相のアプローチによって手動で合成しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プロトン化 peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2のフラグメント化スキーム。一連の B イオンと一連の C 末端フラグメント Y イオンと呼ばれると呼ばれる N 末端フラグメントを生成する peptoid バックボーンに沿ってアミド結合で peptoid イオン フラグメント。a) プロトン化 peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2のフラグメント化スキームを予測しました。点線は断片化サイト、記号 B1 B8に示す N 末端フラグメントおよびシンボル Y1 Y8に示す C 末端フラグメント;概略構造を持つサンプル b) 断片化します。構造ショー B4-5Y とイオン-イオン/z は対応する m の値は、それぞれ。M/z 値を計算するには、構造体の要素の名目の大衆を総括します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: フル スキャンの質量スペクトル peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2、どこ m/z 値は最も近い整数に丸められます。M/z 1,265 ピーク [P + H]+peptoid イオンに対応し、m/z 1,287 のピークがナトリウム イオンに対応する peptoid、「P + ナ]+の付加物。M/z 633 と m/z 644 で 2 つのピークは、二重課金 peptoid [P + 2 H]2 + [P + H + Na]2 +、それぞれ対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: プロトン化 peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2の MS/MS スペクトルは割り当てられた断片が付いています。M/z 1,265 でピークがプロトン化 peptoid、[P + H]+に対応し、m/z 値の低いピークがフラグメント イオンに対応します。Peptoid イオンの断片化方式に基づいて計算されるそれらと m/z 値を比較して、B と Y イオンが割り当てられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| B イオン | m/z 値 (質量の公称値) | Y イオン | m/z 値 (質量の公称値) |
| B1 | 143 | Y1 | 133 |
| B2 | 304 | Y2 | 294 |
| B3 | 419 | Y3 | 409 |
| B4 | 580 | Y4 | 570 |
| B5 | 695 | Y5 | 685 |
| B6 | 856 | Y6 | 846 |
| B7 | 971 | Y7 | 961 |
| B8 | 1132 | Y8 | 1122 |
表 1:理論の m/z 値はプロトン化 peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) の予測されたフラグメント化スキームに基づいて計算4NH2. B イオンと Y イオンは、N 末端と C 末端の対応するフラグメント イオンをそれぞれ示します。各 m/z 値 (質量の公称値) は、そのフラグメント イオンの要素の公称質量を加算して計算されます。
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Discussion
提示プロトコルを使用して nonamer peptoid、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2は合成されています。合成装置には、注射器のようなポリプロピレン固相反応容器と機械的シェーカーが含まれます。反応容器は商業的に低コストです。機械的シェーカーは、化学実験室で一般的な装置です。注射器のような反応容器を使って、ソリューションは引き込まれるしプランジャーを手動で移動することによって容器からプッシュできます。この技術により単量体、1 つの単一の反作用の容器で発生する追加と樹脂の胸の谷間反応、胸の谷間の別容器に樹脂連結中間製品を転送する手順が不要に。この手法は、反応容器からソリューションを削除する真空抽出装置の必要性もなくなります。真空抽出、他研究者19,20によって実証されている手動 peptoid 合成に使用されます。反応ステップ間樹脂を徹底的に洗浄は高純度の製品を得ることが重要です。潜在的な問題の 1 つは、モノマー添加のいくつかのサイクル後反応容器で釉薬の目詰まりです。この問題を解決、新しい反応容器に樹脂を転送し、合成処理を続けます。この合成技術は、10-12 残基ペプチドに適しています。長いペプチドのプランジャーを押して反応容器からソリューションを削除することが難しくなります。この場合、(プランジャーをストッパーで置き換える必要があります) 反応容器からソリューションを削除する真空抽出装置を利用できます。合成プロトコル粗生成物を精製して、ジエチル エーテルの peptoid を析出させる。いくつかの短いと親水性ペプチドがジエチル エーテル沈殿を形成しません。この場合、凍結乾燥が続いている 10% 酢酸の粗製品を溶解し、ジエチル エーテルとソリューションを複数回洗浄により、peptoid を分離することができます。いくつかの高い疎水性ペプチド フォームがありますもないジエチル エーテル沈殿物。この場合は、ジエチル エーテルを蒸発させるし、peptoid 製品を浄化する逆相高速液体クロマトグラフィーを使用します。
本研究では peptoid イオンは ESI によって生成された、トリプル四重極質量分析計の MS/MS 実験は行った。最初の四重極ユニットによるイオンの分離機能、ためサンプルは液体クロマトグラフィー (LC) の必要性を排除する ESI ソースに直接注入される.単独でプロトン化ペプチドも簡単に生成できますマトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 法を用いたします。MS/MS 実験は、イオン トラップ装置などの質量分析計などの他の種類を使用して実施することができます。フラグメント イオンの相対的な豊かさは、MS/MS スペクトルが異なる楽器を使用して記録されている場合は異なる場合があります、定性スペクトル特徴量類似したはずです。一般に、異なるフラグメント イオンの相対的な豊かさは計測器パラメーターに非常に敏感です。衝突エネルギーと衝突ガスの圧力の変更はフラグメント イオンの相対的な豊富を大幅変更できます。たとえば、衝突エネルギーを増加または衝突ガスの圧力の増加は、断片化を促進する結果として、peptoid 前駆イオンの豊かさが減るし、フラグメント イオンの豊かさが増加.本研究は、単独で荷電ペプチドに焦点を当てください。このプロトコルを用いてペプチドの長さは、質量分析計の質量範囲によって制限されます。M/z 2,000 までの質量範囲の質量分析計、荷電ペプチドの m/z 値が上限値より低い必要があります。ペプチド分子質量質量分析計の制限よりも高い場合、二重プロトン化 peptoid を前駆イオンとして使用できます。二重課金 peptoid は単独で充電されたものの約半分、m/z 値があります。
この作品で提示 peptoid には側鎖グループとして第一次アミンの基本的な残留物が含まれます。基本的な残渣は質量分析計の ESI ソースでイオン化効率を高めるとプロトン化サイトとして提供しています。以下の極 (より疎水性) ペプチド ESI ソースに貧しいイオン化効率があります。この場合、大気圧化学イオン化 (APCI) ソースは、ペプチドのイオン化を利用できます。CID の条件下で peptoid イオンは主に一連の N 末端フラグメントと一連の C 末端フラグメントを生成するアミド結合のフラグメントします。場合は電荷、陽子は、N 末端フラグメントは、B イオン フォームに存在します。そうでなければ、Y イオン フォーム。図 2 B4の構造を示しています-イオン。これは構造がシンプル、m/z 値を計算することができます。実際の B-イオンは、5 員環オキサゾロン リング23などの繰返し構造に形作られる可能性が高い。すべてではない予測フラグメント イオンの質量分析計の形成し、質量スペクトルで観測されました。積極的に形成の効率充電フラグメント イオンはフラグメントの気相塩基性 (またはプロトン親和性) によって決まります。非常に基本的なフラグメントであるフォームに正荷電イオンを質量スペクトルで観察される可能性が高い。一般に、peptoid のシーケンスを予測するため合理的に高い自信を与える予測フラグメント イオンの少なくとも 70% を観察します。ペプチド配列解析のための質量分析法による設計、peptoid チェーンに沿った異なる地点で極性側鎖基、アルコキシ グループなどで残基を置くことが重要です。
N 末端アセチル化と単独で最も荷電ペプチド Y イオン B イオン21,23より多くの高い豊かさを示します。B1のことを除いて、図 3に示すように-イオン、B イオンに相当するピークの強度は Y イオンのそれらよりはるかに低い。無料の N 末端のアミノ基を持つペプチドの B イオン上 Y イオンの高い豊富な観察されているだけでなく21。Y イオンの優遇を示唆、電荷キャリア陽子好む C 末端フラグメントに存在する C 末端フラグメント23の高いプロトン親和性のためであります。形成の B と Y-イオン、に加えて二次フラグメント イオンは、水の損失に関連付けられているまたは不安定な側鎖群の減少、プロトン化ペプチドに多く観察されます。これらの二次フラグメント イオン多くの場合 (特に Y-イオン)、主なフラグメント イオン ピーク横仲間ピークのシリーズとして表示され、対応するプライマリの質量から不安定な側鎖グループの質量を差し引くことによって識別することができます。フラグメント イオン。
このプロトコルは、手動でオリゴ peptoid を合成し、タンデム質量分析法を用いた peptoid のモノマー シーケンスを分析する方法を示します。この統合のプロトコルは、peptoid 合成における新しい研究者を育成する研究所の教育化学に簡単に適用できます。この質量分析のプロトコルは、peptoid の身元を確認するのみならず、観察された断片化のパターンに関連して peptoid の構造的特徴を特徴付けるための効率的なツールとして機能します。将来のアプリケーションは、peptoid の構造と合成して多様なペプチド ライブラリの質量分析のフラグメント パターンのリンク相関マップの開発を伴うことがあります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、peptoid 合成における技術支援のため氏マイケル ・ コノリーと博士ロナルド Zuckermann (の分子鋳造、ローレンス ・ バークレー国立研究所) を感謝したいです。我々 は、全米科学財団 (チェ ・ 1301505) からの支援を認めます。パシフィック大学で化学質量分析施設ですべての質量分析実験を行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
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