Summary
프로토콜은 질량 분석에 의해 올리고 peptoids 시퀀스 분석 다음의 수동 합성에 설명 되어 있습니다.
Abstract
Peptoids N-alkylated 글리신 단위의 구성 된 시퀀스 제어 펩 티 드를 흉내 낸 올리고 있습니다. 많은 잠재적인 응용 프로그램, peptoids 분자 정보 스토리지의 유형으로의 생각 되었다. 질량 분석 분석 시퀀싱 peptoids에 대 한 선택의 방법을 고려 하고있다. Peptoids 반복 2 단계 반응 사이클을 사용 하 여 단단한 단계 화학을 통해 합성 될 수 있다. 여기 우리는 수동으로 올리고 peptoids을 합성 하 고 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 기술을 사용 하 여 peptoids의 시퀀스를 분석 하는 방법을 제시. 샘플 peptoid nonamer는 N-(2-aminoethyl) 글리신 (내) N-말단에 뿐만 아니라 N-(2-methyloxyethyl) 글리신 (Nme) 및 N-(2-phenylethyl) 글리신 (Npe), 교류의 구성 이다. peptoid의 시퀀스 수식이입니다 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, Ac는 아 세 틸 그룹. 합성은 상업적으로 사용할 수 있는 고체 상 반응 용기에 일어난다. 링크 아 미드 수 지는 C-말단에 아 미드 그룹 peptoid를 고체 지원으로 사용 됩니다. 결과 peptoid 제품 분무 이온화 소스에 결합 된 트리플-사중 극 자 질량 분석기를 사용 하 여 시퀀스 분석을 복종 된다. MS/MS 측정 된 peptoid의 분리에서 유래 파편 이온의 스펙트럼을 생성 합니다. 조각 이온 들의 질량 대 전 비 (m/z)의 값에 따라 밖으로 정렬 됩니다. 조각 이온의 m/z 값 peptoid 조각화의 계획에 따라 이론적으로 예측 된 조각 이온의 명목상 대 중에 대 한 비교 됩니다. 분석 된 peptoid의 조각화 패턴을 생성합니다. 조각화 패턴 중립 peptoid의 단위체 시퀀스에 상관 된다. 이와 관련, MS 분석은 peptoids의 시퀀스 정보를 읽습니다.
Introduction
Peptoids는 펩 티 드의 구조를 흉내 낸 등뼈 구조와 시퀀스 제어 고분자의 클래스. Peptoids 수 수 합성 다양 한 아민에서 높은 가변 속성1,2전시 peptoids를 가능 하 게. Peptoids 생물 연구, 치료 대리인으로 간주 하 고 ligands 단백질3,4,,56으로 설계에 대 한 분자 모형으로 사용 되었습니다. Peptoids 다양 한 생물학적 활성 화합물, 안티 파울 링 및 항 체 모방 재료, 항균 성 대리인 및 효소 억제제7,,89등으로 개발 되었습니다. 매우 정렬 하 고 조정할 수 있는 자연과 peptoids 분자 정보 저장10의 유형으로의 생각 또한 있다. 이러한 다양 한 응용 프로그램의 시퀀스를 특성화 하기 위해 효율적인 분석 방법의 개발 및 peptoids의 구조에 대 한 호출 합니다. 탠덤 질량 분석 기반 기술을 포함 peptoids11,12,13, 시퀀스 제어 고분자의 시퀀스 속성을 분석 하기 위한 방법의 선택으로 약속으로 나타났습니다. , 1415. 그러나, peptoid 이온 조각화 패턴에서 결과 상호 연결 하는 체계적인 연구 질량 분석 연구 및 peptoids의 구조적 정보는 매우 제한 된.
Peptoids은 단단한 단계 메서드를 사용 하 여 쉽게 합성 수 있습니다. 잘 개발 된 방법은 2 단계 단위체 또한 사이클16,17의 반복을 포함 한다. 각 추가 주기에서 수 지 바인딩된 아민 haloacetic 산 (일반적으로 bromoacetic 산, BMA)에 의해 acetylated 그리고 이것은 1 차 아민으로 변위 반응 옵니다. Peptoids는 표준 화학 실험실16,,1819, 에서 우수한 수익률 수동으로 합성 수 자동된 합성 프로토콜 peptoid 합성에 정기적으로 적용 된, 있지만 20.
우리의 실험실 수동 peptoid 합성의 방법을 채택 있으며 기존의 방법에서 사용 하는 기구를 간소화 합니다. 우리는 이전 MS/MS 기술을21,,2223을 사용 하 여 peptoids의 일련의 분열 패턴을 공부 했다. 우리의 결과 peptoids 생산 특성 fragmentations 그들은 충돌 유도 된 분리 (CID)21,23 하 대상이 됩니다 또는 전자 붙 잡음 분리 (ECD)22 실험 할 때 표시 됩니다. 이 문서에서는, 어떻게 올리고 peptoids 표준 화학 실험실에서 종합 될 수, 트리플-사중 극 자 질량 분석기를 사용 하 여 CID 실험을 수행 하는 방법 및 스펙트럼 데이터를 분석 하는 방법을 보여 줍니다. 합성 하 여 특징 peptoid는 N 맨끝 acetylation와 C 터미널 amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2nonamer. peptoid의 구조는 그림 1에 표시 됩니다.
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Protocol
1입니다. Peptoid의 합성
참고: 합성 수 지 수 지 붓기 고 보호 그룹을 제거 하 여 활성화로 시작 합니다. 이것은 성장 하는 단위체 추가 사이클을 반복을 통해 수 지에 peptoid 체인 옵니다. 수 지에 결합 하는 첫 번째 단량체 C 맨끝 잔류물 이다. peptoid은 N-말단에 C-말단에서 늘어난다. 일단 원하는 peptoid 시퀀스, 달성 수 지 떨어져 죽 습와 peptoid 제품을 정화.
- 시 약의 준비
참고: 액체 시 약은 micropipette를 사용 하 여 측정 하 고 고체 시 약 분석 균형을 사용 하 여 측정 됩니다.- N, N의 6.2 mL를 섞어 '-diisopropylcarbodiimide (DIC)와 N, N-dimethylformamide DIC/DMF 솔루션의 0.8 M 준비 (DMF)의 43.8 mL.
- 0.8 M BMA/DMF 솔루션을 준비 하는 DMF의 50.0 mL에 BMA의 5.56 g을 분해.
- 2 mL piperidine (Pip)와 8 mL 20 %Pip / DMF 솔루션을 달성 하기 위하여 DMF의 혼합.
- 1.9 mL Npe의 1.0을 달성 하기 위하여 DMF의 13.1 mL에 녹 M Npe/DMF.
- 1.3 mL Nme의 13.7 mL 1.0을 달성 하기 위하여 DMF에 녹 M Nme/DMF.
- 1.0을 달성 하기 위하여 DMF의 2 mL에 내의 0.32 mL를 해산 M 내/DMF.
주의: 합성에 사용 되는 화학 물질의 대부분은 위험한. Trifluoroacetic 산 (TFA), DIC, 핍, 그리고 BMA는 호흡기, 눈, 및 피부에 유해. DMF와 dichloromethane (DCM) 발암 물질 의심 됩니다. 모든 반응 증기 두건에서 수행 해야 하 고 적절 한 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. 합성에 사용 되는 모든 화학 물질의 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 확인 하시기 바랍니다.
- 수 지 활성화
- 링크 아 미드 수 지 (수 지, 0.047 mmol, 로드 0.56 mmol/g)의 84 mg에 밖으로 측정 하 고 10 mL 폴 리 프로필 렌 고체 상 반응 배를 추가. 그릇에 플런저를 삽입 합니다.
- 반응 배를 DMF의 2 개 mL를 추가 하 고 혈관 압력 캡 모자. 통에 그릇을 놓고 뚜껑을 제거 하 고 반응 배의 플런저를 밀어 여 폐기물 컨테이너 약 12도 및 30 분 용액에 대 한 진동/분 385의 움직임의 각도에서 실내 온도에서 용기를 선동.
- 선박 20 %Pip / DMF 용액 2 mL를 추가 하 고 그릇 뚜껑. 2 분, 쉐이 커에 선동 및 폐기물 컨테이너에 대 한 해결책을 드레인.
- 선박 20 %Pip / DMF 용액 2 mL를 추가, 선박, 모자 및 모자를 12 분 제거에 대 한 실 온에서 교 반 및 폐기물 컨테이너 솔루션 드레인.
- DMF, 선박, 상한의 1 mL을 추가 하 여 수 지를 세척 하 고 배 교 반 1 분에 대 한 뚜껑 제거 및 드레인 솔루션 플런저를 밀어. 4 추가 시간에 대 한 DMF와 수 지를 세척.
- 단량체 추가 및 N 맨끝 acetylation
참고: 두 개의 반응 단계, bromoacetylation 및 변위 각 단위체 추가 주기 포함 한다.- 양식 Nme-수 지를 첫 번째 단량체 추가 사이클을 실시 합니다.
- Bromoacetylation 반응을 수행 합니다. 0.8 M BMA/DMF 솔루션 및 1 mL 비 커에서 0.8 M DIC/DMF 솔루션의 1 mL를 혼합. 수 지를 포함 하는 반응 용기에 혼합물을 전송 하 고 그릇 뚜껑. 셰이 커에 배를 배치 및 모자를 20 분 제거에 대 한 실 온에서 교 반 및 폐기물 컨테이너에 대 한 해결책 드레인.
- DMF의 1 mL을 추가, 상한 그릇, 1 분 동안 교 반 및 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배 교 반 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 한번 더, DCM와 수 지를 세척 하 고 두 번 DMF로 씻어.
- 변위 반응을 수행 합니다. 추가 1.0 M Nme/DMF 용액 1 mL, 그릇 뚜껑, 선동 60 분 제거에 대 한 실 온에서 용기 뚜껑 하 고 플런저를 밀어 솔루션을 배수.
- 1 mL DMF 추가 하 고 1 분 동안 배를 교 반 하 고, 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 1 ml DCM, 1 분 동안 agitating 그리고 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM 한번 더, DMF 두 번 세척 뒤 씻는 다.
- 1.3.2에 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4를 단계에서 단위체 추가 사이클을 반복-수 지. 변위 반응 (1.3.4)의 단계를 반복 하는 경우 peptoid 순서에 따라 특정 아민 솔루션을 사용 합니다.
참고: peptoid 체인은 늘어난다 C-말단에서 N-말단에 수 지에 바인딩된 C 맨끝 잔류물 함께. - N 맨끝 acetylation Ac-Nae-(Npe-Nme)4를 수행-수 지.
- 믹스 92 µ L의 아세트산 무수 물, N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), 그리고 2 mL 비 커에 DMF의 acetylation의 약 2 mL 칵테일의 43.5 µ L.
- 수 지를 포함 하는 선박 acetylation 칵테일의 2 개 mL를 추가 하 고 선박, 모자 60 분 뚜껑을 제거 하 고 플런저를 밀어 솔루션 드레인 실내 온도에 그것을 선동.
- DMF의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배를 agitating 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배 교 반 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 반복 세척 DCM과 수 지 한 번 더 다음 씻어 DMF 두 번 더.
- DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배를 agitating 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM으로 세척 두 번 반복 합니다. 뚜껑을 제거 하 고 10 분 동안 반응 용기에 건조 하자 수 지.
- 절단, 정화
- TFA, triisopropylsilane (팁)의 100 µ L 및 HPLC 급 H2O 비 커에 100 µ L 분열의 4 mL 칵테일의 3.8 mL를 혼합.
- 4 mL의 갓 만든 분열 칵테일 수 지를 포함 하는 선박을 추가 하 고 선박, 모자 2 h에 대 한 실 온에서 교 반.
- 뚜껑을 제거 하 고 50ml 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 filtrate 솔루션을 수집 합니다. 선박 TFA의 1 mL을 추가 하 고, 모자 1 분 같은 원심 분리기 튜브에 수집 filtrate 솔루션에 대 한 선동.
- 약 1 mL 점성 솔루션은 남아 때까지 질소 가스의 흐름에 부드럽게 불어 TFA를 증발.
- 나머지 솔루션 diethyl 에테르의 15 mL를 추가 하 고 원심 분리기 튜브 캡 하룻밤 2 h-20 ° C 냉동 고에서 품 어. 원유 peptoid 흰색 고체 침전 물.
- 작은 10 분 제거에 대 한 4,427 x g에서 원심 분리기를 사용 하 여 고체 원심 분리기 튜브의 모자 하 고 가만히 따르다 diethyl 에테르 비 커에 신중 하 게 고체를 잃지 않고.
주의: Diethyl 에테르는 가연성 유기 용 매 이다. Diethyl 에테르 안전 원심 분리기를 사용 하십시오. - 세척 포함 하는 고체, 고체는 원심 분리기에 얼음 처럼 차가운 diethyl 에테르 10 mL을 추가 하 여 튜브 튜브, 상한 고는 원심 분리기에 넣습니다. 10 분 제거는 원심 분리기는 원심 분리기에서 튜브와 가만히 따르다 diethyl 에테르 비 커에 신중 하 게 고체를 잃지 않고 4,427 x g에서 원심 분리를 수행 합니다.
- 부드럽게 부는 질소 가스의 흐름에 의해 고체를 건조.
- HPLC 급 H2O 말린된 고체 해산의 10 mL를 추가 합니다. 0.45 μ m의 기 공 크기와 나일론 주사기 필터를 통해 솔루션을 전달 하 고 미리가 중된 50 mL 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에는 filtrate 수집.
- 셸 배치 하 고 회전 하는 원심 분리기 튜브를 포함 하는 12 온스, 더블 스택 확장 된 폴리스 티 렌 컵 1/3에서에서 peptoid 솔루션 액체 질소로 가득 하 여 솔루션을 고정 합니다. 단단한 peptoid를 하룻밤 냉동된 솔루션을 lyophilize.
- 단단한 peptoid HPLC 급 H2O의 10 mL에 용 해 하 여 동결은 한번 더 반복, 액체 질소에서 냉동 고 lyophilizing 하룻밤 껍질. 결과 peptoid 질량 분석에 의해 시퀀스 분석에 대 한 충분히 순수입니다.
2. MS 측정 및 시퀀스 분석
참고: MS/MS 실험 분무 이온화 (ESI) 소스에 결합 한 트리플 4 극 자 질량 분석기에서 수행 됩니다. 데이터 수집 장비와 함께 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 제어 됩니다. 일반 절차 포함 1) 전체 스캔 질량 분석 실험을 수행 하 고 실험 2) 수행 CID MS/MS 질량 스펙트럼을 기록, 및 MS/MS 스펙트럼을 기록 하 고 3) 이론적으로 MS/MS 스펙트럼 데이터 비교 조각화 체계는 peptoid의 구조적 기능에 따라 예측.
- 샘플 솔루션의 준비
- 3-5 mL 유리 유리병에 1.0-2.0 mg 단단한 peptoid 밖으로 무게. 해산 된 peptoid 이기와 물 (= / H2O, 1:1, v/v)의 1 mL를 혼합 용 매를 추가 합니다. 이 약 10-3 M의 농도와 재고 샘플 솔루션을 제공합니다.
- 1.5 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 20 µ L를 전송 하 고 = / h 조2O를 약 10-5 M의 희석된 샘플 솔루션의 1 mL를 혼합 용 매를 추가.
- Peptoid MS와 작업 솔루션으로 만들기 위해 튜브 3 분 전송 솔루션의 윗부분의 약 700 µ L 다른 1.5 mL 원심 분리기에 대 한 4,427 x g에서 원심 분리를 수행 하 여 희석된 샘플 솔루션에서 모든 가능한 불용 성 입자 제거 약 10-5 M의 농도.
- 질량 분석 측정 중 관찰 된 신호 강도에 따라 MS 작업 솔루션의 농도 조정 합니다.
- 0.20 μ m 주사기 필터를 통해 샘플 솔루션을 전달 하 고 솔루션을 만들고 MS peptoid 작업 약 10-5의 1.5 mL 원심 분리기 튜브에는 filtrate 수집 하는 것입니다 희석된 샘플 솔루션에서 모든 가능한 불용 성 입자를 제거 하는 다른 방법 M.
- 질량 스펙트럼을 기록
- 분무 이온화 (ESI) 소스를 통해 = / H2O (1:1, v/v)의 혼합된 용 매를 실행 하 고 표준 긍정적인 이온에 악기, 100-1500의 질량 대 전 비 (m/z) 범위 스캔 전체 질량 분석 모드를 설정 합니다.
참고:
전형적인 작동 매개 변수:
ESI 바늘 전압, 5 kV
모 세관 전압, 40 V
건조 가스 (질소 가스) 온도, 200 ° c. - 500 µ L 또는 1 mL 주사기로 peptoid MS 작업 솔루션 (약 10-5 M)의 약 300 µ L을 추가 하 고 모 세관 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK) 튜브를 사용 하 여 ESI 입구에 주사기를 연결. 주사기 펌프에 주사기를 놓고에서 ESI에 샘플 솔루션에 10 µ L/min 흐름 속도 설정 합니다.
- 켜고 ESI 과정을 활성화 ESI 바늘 전압 검출기를 켭니다. 프로필 모드와 100-1500의 m/z 범위에 표시를 설정 합니다. 프로 파일 창에 표시 된 질량 스펙트럼 프로필 보기 M/z 1265 (1,264.6의 m/z로 표시)에서 피크 peptoid 이온 또는 protonated peptoid에 해당 합니다.
- 2 분 동안 MS 스펙트럼을 기록 합니다. "방법 창"에서 "실행된 시간입니다."로 2 분 사용 기록 창을 열고 적절 한 파일 이름을 입력 하 고 스펙트럼을 기록 하기 시작.
참고: 결과 질량 스펙트럼은 그림 3에 표시 됩니다. - 1265의 m/z에서 피크의 강도 최적화 합니다. 1150-1350 m/z 범위 설정 하 고 프로 파일 창에 표시 하는 mV에 피크 강도 보면서 모 세관 전압을 조정 합니다. 예를 들어 50 V 모 세관 전압 증가 또는 높은 피크 강도의 변화를 볼. 최적의 피크 강도 150-200 mV.
참고:은 크게 특정 이온의 풍부로 변경할 수 있습니다 모 세관 전압 조정. 모 세관 전압을 증가 peptoid 이온의 강도 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, 모 세관 고전압 수 있습니다 또한 이온 소스에 peptoid 이온의 분리를 유발 하 고 관찰 된 강도 감소. 1265, m/z에서 피크의 강도 향상 시킬 수 있습니다 건조 가스의 온도 조정 하지만 모 세관 전압을 조정 하는 것 보다 덜 효과적 이다. M/z 1265에서 피크 최적의 강도 도달 하지 않습니다, 경우 샘플 농도 (또는 MS 작업 솔루션의 농도 두 번 하는 등)를 조정 합니다. - 악기 MS/MS 모드로 전환 합니다. M/z 1265에 선구자 이온을 설정 하 고 MS/MS 질량 범위에서 100-1, 400의 m/z. "방법 창"에서 "1 분기 첫 미사"로 m/z 1265를 사용 하 고 "1 분기 마지막 질량"을 비워 둡니다. "3 분기 첫 미사"와 m/z 1400 m/z 100을 사용 하 여 "3 분기 마지막 미사"로
참고: MS/MS 모드, 선구자 이온으로 peptoid 이온을 분리 하는 질량 필터 첫번째 4 중 극 단위 (1 분기) 기능에에서 두번째 4 중 극 단위 (2 분기)는 충돌 세포, 그리고 세 번째 4 중 극 (Q3) 단위 기능 질량 분석기입니다. - 세트 40 eV에서 충돌 에너지와 충돌 가스 (아르곤,이 경우에서) 1.5 mTorr에서 압력.
- 프로 파일 창에 표시 되는 질량 스펙트럼 프로필 보기 1265의 m/z에서 피크 peptoid 이온에 해당 하며 m/z 값 봉우리 peptoid 이온에서 파편을 나타냅니다.
- 조각화 스펙트럼의 디스플레이 최적화 하려면 충돌 에너지를 조정 합니다. 예를 들어 45 eV에 충돌 에너지를 증가 하 고 스펙트럼 프로 파일의 변화를 볼.
참고: 일반적으로, 충돌 에너지를 증가 것입니다 강화 조각 이온의 풍부 하 고 peptoid 이온의 풍부를 감소. 충돌 가스 압력 또한 조각 이온의 풍부를 강화할 것 이다.
주의: 2 mTorr 넘어 충돌 가스 압력을 증가 하지 않습니다. - 2 분 동안 MS/MS 스펙트럼을 기록 합니다. "방법 창"에서 "실행된 시간입니다."로 2 분 사용 기록 창을 열고 적절 한 파일 이름을 입력 하 고 스펙트럼을 기록 하기 시작.
- 1-2 회 녹화를 반복 합니다.
- 분무 이온화 (ESI) 소스를 통해 = / H2O (1:1, v/v)의 혼합된 용 매를 실행 하 고 표준 긍정적인 이온에 악기, 100-1500의 질량 대 전 비 (m/z) 범위 스캔 전체 질량 분석 모드를 설정 합니다.
- Peptoid 시퀀스 분석
참고: CID 조건 peptoid 이온 것 조각 라는 B-이온, N 맨끝 파편의 일련과 Y 이온 라는 C 터미널 조각의 시리즈 생산 peptoid 등뼈를 따라 아 미드 유대에서- 왼쪽 및 오른쪽 면에 C-말단에 N-말단을 배치 하 여 acetylated peptoid의 화학 구조 그리고 그림 2a와 같이 조각화 구조를 생성 하기 위해 각 아 미드 유대에 파선을 그립니다. 양성자는 전 하 운반자를 나타내기 위해 점선 동그라미를 그립니다. 구조의 왼쪽에서 starting, B1, B2, B8N 맨끝 파편을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다. 오른쪽에서 starting Y1, Y2Y8C 터미널 조각을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다.
참고: 화학 드로잉 소프트웨어는 peptoid 구조를 그리는 데 활용할 수 있습니다. - 왼쪽에서 4번째 아 미드 유대에 조각화를 상상 하 고 N 맨끝 파편의 그림 2b에서 같이 적절 한 공식적인 유료 C 터미널 조각 구조를 그립니다. N 맨끝 파편에 B4 의 라벨을 놓고 C 터미널 조각에 Y5 의 레이블을 배치 합니다. 580의 값을 산출 하는 구조에 있는 요소의 명목상 대 중을 요약 하 여 B4 의 m/z 값을 계산 하 고 N 맨끝 파편에 m/z 580을 놓습니다. Y5 의 m/z 값을 계산 하 고 C 터미널 조각에 m/z 685 장소.
- 모든 8 개의 B 이온 및 모든 8 Y 이온, m/z 값을 계산 하 고 표 1과 같이 테이블에서 그들을 조립.
참고: 파편의 m/z 값 계산할 수 있습니다 소프트웨어를 그리기 화학 물질을 사용 하 여. - 악기와 함께 데이터 검토 소프트웨어를 사용 하 여 peptoid의 기록 된 MS/MS 스펙트럼을 엽니다. 3% "이온 레이블 표시"를 라벨 환경 설정 및 레이블 임계값을 설정 합니다. 이 봉우리에 표시 하는 m/z 값으로 MS/MS 스펙트럼을 생성 합니다.
- MS/MS에서 CSV 텍스트 파일로 스펙트럼 데이터 형식과 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 스펙트럼을 재구성을 내보냅니다. 봉우리에 m/z 값을 배치 합니다. 결과 MS/MS 스펙트럼은 그림 4에 표시 됩니다.
참고: 일부 질량 분석기는 갖추고 데이터 처리 소프트웨어 MS/MS 스펙트럼을 생성. 이 경우에, MS/MS 스펙트럼 데이터를 내보낼 필요는 없습니다. - 해당 B-및 Y-이온을 식별 하기 위해 표 1 에 표시 된 것 MS/MS 스펙트럼에는 m/z 값을 할당 합니다. M/z 580에서 피크 B4로 식별 되는 예를 들어-이온 및 685 m/z는 Y5식별-이온. 그림 4와 같이 해당 B와 Y 기호는 스펙트럼에 봉우리를 레이블을 지정 합니다.
- 왼쪽 및 오른쪽 면에 C-말단에 N-말단을 배치 하 여 acetylated peptoid의 화학 구조 그리고 그림 2a와 같이 조각화 구조를 생성 하기 위해 각 아 미드 유대에 파선을 그립니다. 양성자는 전 하 운반자를 나타내기 위해 점선 동그라미를 그립니다. 구조의 왼쪽에서 starting, B1, B2, B8N 맨끝 파편을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다. 오른쪽에서 starting Y1, Y2Y8C 터미널 조각을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다.
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Representative Results
N 맨끝 acetylation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2와 9-메 르 peptoid의 구조는 그림 1에 표시 됩니다. peptoid 단단한 단계 접근 방식을 통해 fritted 폴 리 프로필 렌 반응 용기에 수동으로 합성 했다. 링크 아 미드 수 지 (0.047 mmol, 로드 0.56 mmol/g 84 mg) amidated C terminus와 peptoid를 고체 지원으로 사용 됩니다. Peptoid 체인의 단위체 또한 여러 사이클에 의해 만들어집니다. 각 단위체 추가 주기는 두 반응 단계, bromoacetylation 및 변위를 포함 한다. bromoacetylation 0.8 M BMA 솔루션 및 0.8 M DIC 솔루션을 추가 하 여 이루어집니다 그리고 반응 20 분 소요. 변위 acetylation 제품 1.0 M 아민 솔루션을 추가 하 여 이루어집니다 그리고 반응 소요 1 h. N 맨끝 acetylation 92 µ L의 아세트산 무수 물, DIPEA의 43.5 µ L, DMF의 2 개 mL를 포함 하는 칵테일 솔루션을 추가 하 여 실시 되었다. peptoid는 떨어져 죽 습 수 지에서 TFA, 팁, 100 µ L 및 HPLC 급 H2O, 100 µ L의 3.8 mL를 포함 하는 칵테일 솔루션을 추가 하 여 및 반응 소요 2 h. TFA 후드에 약 1 mL 점성까지 질소 가스의 흐름에 불어 제거 됩니다. 솔루션은 남아 있습니다. Peptoid 제품 diethyl 에테르에 침전, 원심 분리에 의해 분리 하 고이 동결은의 두 반복 뒤. 결과 peptoid MS/MS 분석을 위해 충분히 순수입니다.
peptoid에 대 한 예측된 조각화 계획 그림 2a, 점선된 원에 양성자 "모바일 양성자는" CID 실험 기간 동안 peptoid 조각화를 유도 것을 나타냅니다에 표시 됩니다. Peptoid 이온은을 조각화 사이트는 파선으로 표시 됩니다 peptoid 등뼈를 따라 아 미드 유대에서 파편. N 맨끝 파편 B 형 이온으로 표시 되 고 C 터미널 조각 Y 형 이온으로 표시 됩니다. 조각화 전혀 발생 합니다 경우 사용 가능한 아 미드 채권, 총 8 N 맨끝 파편, B8, B1 의 그리고 8 C 터미널 조각, Y8, Y1 의 총 형성. 각 조각은 명목상의 대 중 조각에 모든 요소를 요약 하 여 계산 된 해당 m/z 값을 갖습니다. 예를 들어, 구조와 B4의 해당 m/z 값 (명목상 질량)-이온과 Y5-이온 그림 2b에 표시 됩니다. B4 이온 화학 공식은 C31H42N5O6+, 및 명목상 질량 계산 방정식 (12 x 31) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. B4 이므로 단독으로 위탁 된 이온, m/z 값 580/1 것 = 580. 그림 2b, B4의 구조-이온은는 단순화 된 형태 (자세한 토론 섹션 참조). 모든 조각 이온 B1-B8 하 고 Y1-Y8 에서 계산 된 m/z 값 (명목상 질량)는 표 1에 부여 됩니다.
대량 분석에는 두 개의 프로세스가 포함 됩니다. 첫 번째 과정은 peptoid 샘플의 전체 스캔 질량 분석 분석을 수행 하. 이 결과 peptoid의 양을 측정 하 고 샘플의 상대적인 순수성 샘플 포함 되어 있는지 여부를 나타냅니다. Peptoid 이온의 전체 스캔 질량 스펙트럼은 그림 3, m/z 값에 가장 가까운 정수로 반올림 됩니다에 표시 됩니다. M/z 1265에서 피크 protonated peptoid에 해당 하며 나트륨 이온에 해당 하는 m/z 1,287에 피크는 peptoid의 adduct. M/z 633 m/z 644에서 두 봉우리 각각 이중 protonated 및 혼합된 protonated-sodiated peptoids에 해당합니다. 이 결과 peptoid 샘플은 충분히 MS/MS 분석 수행에 대 한 순수한 것이 좋습니다.
질량 분석에서 두 번째 과정은 m/z 1265에 protonated peptoid에 MS/MS 실험을 수행 하. 이 프로세스는 첫 번째 4 극 자 단위, 시드, peptoid 이온을 분할 하 고 세 번째 4 중 극 단위에 의해 그들의 m/z 값에 따라 조각 이온 정렬 선구자 peptoid 이온을 분리 포함 됩니다. 유래 스펙트럼은 그림 4, m/z 값에 가장 가까운 정수로 반올림 됩니다에 표시 됩니다. M/z 1265에서 피크 protonated peptoid에 해당합니다. M/z 값에서 다른 봉우리 peptoid 이온에서 파편 이온에 해당합니다. 조각 이온 B 이온 또는 Y-이온으로 그 예측 ( 표 1참조) ( 그림 2참조) peptoid 조각화 체계를 기반으로 그들의 m/z 값을 비교 하 여 지정 됩니다. 7 Y-이온 (Y2 Y8) 및 7 B-이온 (B1 B7) 관찰 나타났는데도 형성 된다. Y-이온의 풍부는 대부분 B-이온의 그것 보다 훨씬 더 높은 알.
그림 1: peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2의 화학 구조. peptoid 단단한 단계 접근 방식을 통해 수동으로 합성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2에 대 한 조각화 체계. N 맨끝 파편 B 이온과 Y 이온 라는 C 터미널 파편의 일련의 시리즈를 생산 하기 위해 peptoid 등뼈를 따라 아 미드 유대에 peptoid 이온 조각. a) protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2에 대 한 조각화 구조 예측. 점선된 라인 표시 조각화 사이트 B8 기호 B1 N 맨끝 파편을 표시 하 고 Y8 기호 Y1 나타냅니다 C 터미널 조각; b) 샘플 조각화 도식 구조입니다. 구조 표시 B4-이온과 Y5-이온 해당 m/z 값, 각각. M/z 값은 명목상의 대 중 구조에서 요소를 요약 하 여 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 전체 검색 질량 스펙트럼 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, peptoid의 m/z 값에 가장 가까운 정수로 반올림 됩니다. [P + H]+, peptoid 이온에 해당 하는 m/z 1265에서 피크 및 나트륨 이온에 해당 하는 m/z 1,287에서 피크의 peptoid, [P + 나]+adduct. M/z 633 m/z 644에서 두 봉우리에 이중 청구 peptoid, [P H + 2]2 + [P + H + 나]2 +, 각각 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 의 MS/MS 스펙트럼 할당 된 조각으로 표시. M/z 1265에서 피크 protonated peptoid, [P + H]+에 해당 하며 조각 이온에 해당 하는 m/z 값 봉우리. B와 Y 이온은 그 계산 된 peptoid 이온의 조각화 체계를 기반으로 그들의 m/z 값을 비교 하 여 할당 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| B-이온 | m/z 값 (명목상 질량) | Y-이온 | m/z 값 (명목상 질량) |
| B1 | 143 | Y1 | 133 |
| B2 | 304 | Y2 | 294 |
| B3 | 419 | Y3 | 409 |
| B4 | 580 | Y4 | 570 |
| B5 | 695 | Y5 | 685 |
| B6 | 856 | Y6 | 846 |
| B7 | 971 | Y7 | 961 |
| B8 | 1132 | Y8 | 1122 |
표 1: 이론적인 m/z 값 계산 protonated peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)의 예측된 조각화 계획에 따라 4 -NH 2 . B-이온과 Y 이온 각각 N-말단과 C-말단의 해당 조각 이온을 나타냅니다. 각 m/z 값 (명목상 질량)의 그의 조각 이온 요소 명목상 대 중을 요약 하 여 계산 됩니다.
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Discussion
Nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, 제시 하는 프로토콜을 사용 하 여 합성 되어 있다. 합성 장치는 주사기 모양의 폴 리 프로필 렌 고체 상 반응 배 및 기계 통 포함 됩니다. 반응 선박 상업적으로 사용할 수 있으며 저렴 한 비용. 기계적인 통은 화학 실험실에서 일반적인 기구 이다. 주사기 같은 반응 배를 사용 하 여, 솔루션으로 그려진 고 플런저를 수동으로 이동 하 여 배를 밀어. 이 기술은 추가 및 수 지 분열 반응 한 단 하나 반응 용기에서 발생 하는 단위체를 수 수 하 고 분열에 대 한 다른 혈관으로 수 지 바인딩된 중간 제품을 전송 하는 단계를 제거 합니다. 이 기술은 또한 반응 용기에서 솔루션을 제거 하는 진공 적 출 장치에 대 한 필요성을 제거 합니다. 진공 추출 다른 연구원19,20에 의해 입증 되었습니다 수동 peptoid 종합에 주로 사용 됩니다. 반응 단계 사이 수 지를 철저 하 게 세척 하는 것은 고 순도 제품을 얻기 위해 중요 합니다. 하나의 잠재적인 문제는 단위체 추가의 몇 사이클 후 반응 용기에 릿의 막힘. 이 문제에 해결책은 새로운 반응 용기에 수 지를 전송 하 고 합성 과정을 계속 하. 이 합성 기술은 10-12 잔류물을 peptoids를 위해 잘 작동합니다. 더 이상 peptoids에 대 한 플런저를 밀어 반응 용기에서 솔루션을 제거 하기가 어려워집니다. 이 경우에, 진공 적 출 장치 (플런저는 스 토퍼에 의해 대체 되어야 한다) 반응 용기에서 제거 하는 솔루션을 활용할 수 있습니다. 합성 프로토콜에서 원유 제품 diethyl 에테르에 peptoid 계기에 의해 정화입니다. 일부 짧고 높게 극 지 peptoids diethyl 에테르에 촉진 형성 하지 않을 수 있습니다. 이 경우에 peptoid 동결은 뒤에 10% 초 산에 원유 제품을 분해 하 고 세척 솔루션 diethyl 에테르로 여러 번 하 여 고립 될 수 있다. 일부 매우 소수 peptoids 수 있습니다 또한 형성 하지 diethyl 에테르에 촉진. 이 경우 diethyl 에테르를 증발 하 고 반전된 단계 HPLC를 사용 하 여 peptoid 제품을 정화.
이 연구에서 peptoid 이온 ESI에 의해 생성 되 고 MS/MS 실험 트리플 4 극 자 질량 분석기에서 수행 됩니다. 첫 번째 4 중 극 단위에 의해 이온 격리 기능 때문에 샘플은 직접 액체 크로마토그래피 (LC)에 대 한 필요성을 제거 하는 ESI 소스에 들어갈 수 있습니다. 홀로 protonated peptoids 수 있습니다 또한 쉽게 생성 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI) 기술을 사용 하 여. MS/MS 실험 이온 트랩 분석기 등 뿐만 아니라, 질량 분석기의 다른 종류를 사용 하 여 실시 될 수 있습니다. 조각 이온의 관계 되는 풍부는 MS/MS 스펙트럼 다른 악기를 사용 하 여 기록 하는 경우 다르게 나타날 수 있습니다, 있지만 질적 스펙트럼 기능 유사 해야 합니다. 일반적으로 다른 파편 이온의 관계 되는 풍부는 악기 매개 변수에 매우 민감합니다. 충돌 에너지와 충돌 가스 압력을 변경 것은 조각 이온의 관계 되는 풍부를 크게 변경할 수 있습니다. 예를 들어 충돌 에너지를 증가 하거나 충돌 가스 압력 증가 조각화, 추진 및 그 결과, peptoid 선구자 이온의 풍부한 줄어 그리고 조각 이온의 풍부한 증가 합니다. 이 연구는 단독 청구 peptoids에 집중 한다. 이 프로토콜을 사용 하 여 공부 하는 peptoids의 길이 질량 분석기의 m/z 범위에 의해 제한 됩니다. M/z 2000 대량 범위와 질량 분 서 계, 충전된 peptoids의 m/z 값 상한 보다 낮은 해야 합니다. Peptoids는 분자 질량 질량 분석기의 한계 보다 더 높은 경우는 이중 protonated peptoid 선구자 이온으로 사용할 수 있습니다. 이중 청구 peptoid는 약 절반 홀로 충전된 한 m/z 값을 할 것 이다.
이 작품에서 제시 하는 peptoid 사이드 체인 그룹으로 1 차 아민으로 기본적인 잔류물을 포함 합니다. 기본 잔류물 질량 분석기의 ESI 소스에서 이온화 효율을 향상 시킬 것 이다 protonation 사이트 역할을 합니다. 적은 극 지 (더 소수) peptoids ESI 소스에서 가난한 이온화 효율이 있다. 이 경우에, 대기 압력 화학 이온화 (APCI) 소스는 peptoids를 이온화를 활용할 수 있습니다. CID 조건 하에서 peptoid 이온은 주로 N 맨끝 파편의 시리즈 및 시리즈의 C-터미널 조각 아 미드 유대에 조각화. 경우에 전 하 운반자, 양성자, N 맨끝 파편, B 이온 형태에 상주 합니다. 그렇지 않으면, Y 이온 형태. 그림 2 는 B4의 구조-이온. 이것은 m/z 값을 계산 하는 데 도움이 간단한 구조 이다. 실제 B-이온 가능성이 5 조화로 oxazolone 반지23같은 순환 구조에서 형성 된다. 모든 예측 조각 이온은 질량 분 서 계에 형성 된 질량 스펙트럼에서 관찰. 긍정적으로 형성의 효율성 청구 조각 이온 크게 파편의 가스 단계 basicity (또는 양성자 선호도)에 의해 결정 됩니다. 매우 기본적인 조각 양식 긍정적으로 위탁 된 이온을 질량 스펙트럼에서 관찰 될 높은 기회가 있다. 일반적으로, 예측된 조각 이온의 70% 이상에서 관찰 한 peptoid의 순서를 예측에 대 한 합리적으로 높은 자신감을 준다. 질량 분석에 의해 시퀀스 분석을 위한 peptoids 설계, 그것은 잔류물 alkoxy 그룹, 같은 극 지 사이드 체인 그룹과 peptoid 사슬을 따라 서로 다른 사이트에 배치 하는 것이 중요.
N 맨끝 acetylation와 가장 단독 청구 peptoids, Y-이온 B 이온21,23보다 훨씬 더 높은 풍부 표시. B1을 제외 하 고 그림 3에서에서와 같이-이온, B-이온에 해당 하는 봉우리의 강도 Y 이온의 그 보다 훨씬 낮은. 무료 N 맨끝 아미노 그룹 peptoids에 대 한 Y B-이온에 이온의 높은 풍부 관찰 되었습니다 또한21. Y-이온의 선호는 전 하 운반자 양성자 좋아한다 C 터미널 조각에 있는 C 터미널 조각23의 더 높은 양성자 선호도 하 나왔다. 형성의 B와 Y-이온, 뿐만 아니라 물 손해와 관련 된 보조 조각 이온 또는 정한 사이드 체인 그룹 손실 protonated peptoids에서 자주 관찰 된다. 이러한 보조 조각 이온 종종 기본 조각 이온 (특히 Y-이온), 봉우리 옆 동반자 봉우리의 일련으로 나타나고 해당 기본의 질량에서 정한 사이드 체인 그룹의 질량을 빼서 확인할 수 있습니다. 조각 이온입니다.
이 프로토콜에는 수동으로 올리고 peptoid 합성 탠덤 질량 분석 방법을 사용 하 여 peptoid의 단위체 시퀀스를 분석 하는 방법을 보여 줍니다. 이 합성 프로토콜 교육 훈련 peptoid 합성에 새로운 연구 실험실 화학으로 쉽게 채택 될 수 있다. 이 질량 분석 프로토콜, peptoid의 id를 확인 뿐만 아니라 관찰된 조각화 패턴에 관하여 peptoid의 구조 기능을 특성화 하는 효율적인 도구 역할을 합니다. 미래의 응용 프로그램 peptoid 구조, 합성 및 다양 한 peptoids의 도서관의 질량 분석 분석을 통해 조각화 패턴을 연결 하는 상관 관계 지도 개발 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 마이클 코놀리 씨과 박사 로널드 Zuckermann (The 분자 주조, 로렌스 버클리 국립 연구소) peptoid 합성에서 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 우리 인정 국립 과학 재단 (체-1301505)에서 지원 합니다. 모든 질량 분석 실험 대학 태평양에서 화학 질량 분석 시설에서 실시 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
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