Summary
Un protocollo è descritto per la sintesi manuale di oligo-peptoids seguita da analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.
Abstract
Peptoids sono sequenza controllata oligomeri che imita il peptide che consiste in unità di glicina N-alchilati. Tra le molte applicazioni potenziali, peptoids sono stato pensato come un tipo di archiviazione di informazioni molecolari. Analisi di spettrometria di massa sono stato considerato il metodo di scelta per peptoids di sequenziamento. Peptoids possono essere sintetizzati tramite chimica in fase solida utilizzando un ciclo di reazione ripetuta in due fasi. Qui presentiamo un metodo per sintetizzare manualmente oligo-peptoids e per analizzare la sequenza della peptoids utilizzando tecniche di spettrometria di massa (MS/MS) tandem. L'esempio peptoid è un nonamer composto alternando glicina di N (2-methyloxyethyl) (Nme) e glicina di N (2-phenylethyl) (Npe), come pure una N-(2-amminoetil) glicina (Nae) al N-terminale. La formula di sequenza del peptoid è Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, dove Ac è il gruppo acetile. La sintesi avviene in un recipiente di reazione di fase solida disponibile in commercio. La resina di ammide pista è utilizzato come supporto solido per produrre il peptoid con un gruppo di ammide al C-terminale. Il prodotto peptoid risultante è sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione electrospray. La misurazione di MS/MS produce uno spettro di ioni frammento derivanti dalla dissociazione della carica peptoid. Gli ioni frammento vengono ordinati in base ai valori del loro rapporto massa / carica (m/z). I valori m/z degli ioni frammento vengono confrontati con le masse nominali degli ioni frammento teoricamente prevista, secondo lo schema di peptoid frammentazione. L'analisi genera un pattern di frammentazione della carica peptoid. Il modello di frammentazione è correlato alla sequenza di monomero della peptoid neutro. A questo proposito, analisi MS legge le informazioni di sequenza della peptoids.
Introduction
Peptoids sono una classe di polimeri sequenza controllata con strutture di spina dorsale che imita la struttura dei peptidi. Peptoids possono essere sintetizzati da diverse ammine, che permette di peptoids ad esporre proprietà altamente sintonizzabile1,2. Peptoids sono stati utilizzati come modelli molecolari per la ricerca biofisica, considerati come agenti terapeutici e progettato come leganti per proteine3,4,5,6. Peptoids sono stati sviluppati in una varietà di composti biologicamente attivi, quali materiali anti-incrostazione e anticorpo-mimetici, agenti antimicrobici e degli enzimi inibitori7,8,9. Con una natura altamente ordinata e sintonizzabile, peptoids hanno anche stato pensato come un tipo di informazioni molecolari deposito10. La scoperta di queste chiamate di diverse applicazioni per lo sviluppo di efficienti metodi analitici per caratterizzare la sequenza e la struttura di peptoids. Tecniche basate sulla spettrometria di massa tandem hanno indicato la promessa come il metodo di scelta per analizzare le proprietà di sequenza di sequenza controllata polimeri, tra cui peptoids11,12,13, 14,15. Tuttavia, gli studi sistematici correlando i pattern di frammentazione di ioni peptoid derivanti da studi di spettrometria di massa e le informazioni strutturali di peptoids sono molto limitati.
Peptoids possono essere facilmente sintetizzati utilizzando un metodo di fase solida. Il metodo ben sviluppato coinvolge un'iterazione di un ciclo di16,di due fasi monomero aggiunta17. In ogni ciclo di aggiunta, un'ammina associato a resina è acetilata da un acido di aloacetici (in genere acido bromoacetico, BMA), e questa è seguita da una reazione di spostamento con un'ammina primaria. Anche se i protocolli di sintesi automatizzata sono stati applicati ordinariamente per la sintesi di peptoid, peptoids possono essere sintetizzati manualmente con ottimi rendimenti in un standard chimica laboratorio16,18,19, 20.
Il nostro laboratorio ha adottato il metodo della sintesi di peptoid manuale e semplificato la strumentazione utilizzata per i metodi esistenti. In precedenza abbiamo studiato i modelli di frammentazione di una serie di peptoids utilizzando tecniche di MS/MS21,22,23. I nostri risultati indicano che peptoids producono caratteristici frammentazioni quando essi sono sottoposti alla dissociazione indotta da collisione (CID)21,23 o cattura elettronica esperimenti22 dissociazione (ECD). In questo articolo, dimostriamo come oligo-peptoids può essere sintetizzato in un laboratorio di chimica standard, come eseguire gli esperimenti di CID utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo e come analizzare i dati spettrali. Il peptoid essere sintetizzato e caratterizzato è un nonamer con acetilazione del N-terminale e C-terminale amidazione, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La struttura del peptoid è illustrata nella Figura 1.
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Protocol
1. sintesi di Peptoid
Nota: La sintesi inizia con la resina di attivazione gonfiore la resina e rimuovendo il gruppo di protezione. Questa è seguita da una crescente della catena di peptoid sulla resina attraverso ripetuti cicli di aggiunta del monomero. Il primo monomero accoppiato alla resina è il residuo del C-terminale. Il peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale. Una volta ottenuta la sequenza desiderata peptoid, la resina viene clivata off e il prodotto peptoid è purificato.
- Preparazione dei reagenti
Nota: I reagenti liquidi sono misurati utilizzando una micropipetta e i reagenti solidi vengono misurati utilizzando una bilancia analitica.- Mescolare 6,2 mL di N, n' '-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL di N, N-dimetilformammide (DMF) per preparare un 0,8 M della soluzione DIC/DMF.
- Sciogliere g 5,56 di BMA in 50,0 mL di DMF per preparare una soluzione di 0,8 M BMA/DMF.
- Mescolare 2 mL di piperidina (Pip) e 8 mL di DMF per ottenere 20% soluzione di Pip/DMF.
- Sciogliere 1,9 mL di Npe in 13,1 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Npe/DMF.
- Sciogliere 1,3 mL di Nme in 13,7 mL DMF per raggiungere 1.0 M Nme/DMF.
- Sciogliere 0,32 mL di Nae in 2 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Nae/DMF.
Attenzione: la maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate nella sintesi sono pericolosa. Acido trifluoroacetico (TFA), DIC, Pip e BMA sono pericolosi per la pelle, occhi e vie respiratorie. DMF e diclorometano (DCM) sono sospetti cancerogeni. Tutte le reazioni devono essere eseguite in una cappa aspirante e appropriati dispositivi di protezione individuale devono essere utilizzato. Si prega di controllare il foglio di dati materiale di sicurezza (MSDS) di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella sintesi.
- Attivazione di resina
- Misurare 84 mg di resina di ammide Rink (resina, 0.047 mmol, caricamento 0,56 mmol/g) e aggiungerlo ad un vaso di reazione di fase solida in polipropilene da 10 mL. Inserire lo stantuffo nel recipiente.
- Aggiungere 2 mL di DMF per il recipiente di reazione e tappo il recipiente con un tappo a pressione. Posizionare il vaso su uno shaker e agitare il recipiente a temperatura ambiente con un angolo di movimento di circa 12 gradi e 385 oscillazioni/min per 30 min. scarico la soluzione a un contenitore per rifiuti rimuovendo il tappo e lo stantuffo del recipiente di reazione.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave e la nave di cap. Agitare su agitatore per 2 min e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave, tappo serbatoio e agitare a temperatura ambiente per 12 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.
- Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave e agitando il vaso per un minimo di 1 Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina con DMF per altre 4 volte.
- Aggiunta del monomero e acetilazione del N-terminale
Nota: Ogni ciclo di aggiunta del monomero comporta lo spostamento, bromoacetylation e reazione a due passi.- Eseguire il primo ciclo di aggiunta del monomero a forma Nme-resina.
- Eseguire una reazione di bromoacetylation. Mescolare 1 mL di soluzione di 0,8 M BMA/DMF e 1 mL di soluzione di 0,8 M DIC/DMF in un becher. Trasferire il composto in un recipiente di reazione contenente la resina e la nave di cap. Posizionare il vaso su shaker e agitare a temperatura ambiente per 20 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.
- Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave, d'agitazione per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare la resina con DCM ancora una volta e poi lavare con DMF due volte.
- Eseguire una reazione di spostamento. Aggiungere 1 mL di soluzione di 1,0 M Nme/DMF, la nave di cap, agitare il recipiente a temperatura ambiente per 60 min. Rimuovi il tappo e drenare la soluzione premendo lo stantuffo.
- Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina disegnando in 1 mL di Diclorometano, agitare per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare DCM una volta di più, seguita da lavaggio con DMF due volte.
- Ripetere i cicli di aggiunta del monomero da passaggi 1.3.2 a 1.3.5 per formare Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando si ripete il passaggio della reazione di spostamento (1.3.4), utilizzare una soluzione di ammina specifico in base alla sequenza di peptoid.
Nota: La catena peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale con il residuo del C-terminale associato alla resina. - Eseguire acetilazione del N-terminale per formare Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.
- Anidride acetica mix 92 µ l della, 43,5 µ l di N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL di DMF in un becher per fare cocktail circa 2 mL di acetilazione.
- Aggiungere 2 mL di acetilazione cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 60 min. Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo.
- Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Ripetere il lavaggio della resina con DCM ancora una volta, quindi lavare con DMF altre due volte.
- Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Ripetere il lavaggio due volte con DCM. Rimuovere il tappo e lasciare che la resina asciugare all'aria nel vaso di reazione per 10 min.
- Clivaggio e purificazione
- Mescolare 3,8 mL di TFA, 100 µ l di triisopropylsilane (suggerimenti) e 100 µ l di grado HPLC H2O in un becher per fare cocktail 4 mL di clivaggio.
- Aggiungere 4 mL di preparata clivaggio cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 2 h.
- Rimuovere il tappo e raccogliere la soluzione filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene 50 mL. Aggiungere 1 mL di TFA al vaso, tappo e agitare per 1 minuto raccogliere la soluzione filtrato nella stessa provetta da centrifuga.
- Evaporare TFA soffiando delicatamente in un flusso di gas di azoto fino a circa 1 mL soluzione viscosa è a sinistra.
- Aggiungere 15 mL di etere etilico per la soluzione rimanente, tappo della provetta da centrifuga e viene quindi incubato in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte. Il greggio peptoid precipita come solido bianco.
- A pellet il solido utilizzando una centrifuga a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi il tappo della provetta centrifugo e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido.
Attenzione: l'etere dietilico è un solvente organico infiammabile. Si prega di utilizzare una centrifuga di sicuro di etere etilico. - Lavare il solido con l'aggiunta di 10 mL di etere etilico ghiacciata nella centrifuga tubo contenente il solido, tappatura del tubo e l'immissione nella centrifuga. Eseguire centrifugazione a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi la centrifuga tubo da centrifuga e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido.
- Asciugare il solido soffiando delicatamente in un flusso di gas azoto.
- Aggiungere 10 mL di grado HPLC H2O per sciogliere il solido essiccato. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa in nylon con dimensione dei pori di 0.45 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene pre-pesata 50 mL.
- Shell congelare la soluzione immissione e ruotando la centrifuga provetta contenente la soluzione di peptoid in un 12-ounce, a doppio strato tazza polistirolo espanso 1/3 riempita con azoto liquido. Lyophilize la soluzione congelata durante la notte per produrre peptoid solido.
- Ripetere ancora una volta di liofilizzazione dissolvendo il solido peptoid in 10 mL di grado HPLC H2O, shell congelamento in azoto liquido e liofilizzazione durante la notte. Il peptoid risultante è sufficientemente puro per analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.
2. Sig. ra misure e analisi di sequenza
Nota: L'esperimento di MS/MS viene effettuata in uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione (ESI) di electrospray. Raccolta dei dati viene controllata tramite il software di acquisizione dati accompagnato con lo strumento. La procedura generale include 1) effettua l'esperimento di spettrometria di massa di scansione completa e registrare lo spettro di massa, 2) eseguire il CID MS/MS sperimentare e registrazione dello spettro MS/MS e 3) confrontando i dati spettrali di MS/MS con teorica schema di frammentazione predetto in base alla funzionalità strutturale della peptoid.
- Preparazione della soluzione campione
- Pesare 1,0-2,0 mg peptoid solido in un flaconcino di vetro di 3-5 mL. Aggiungere 1 mL miscelati di solvente di acetonitrile e acqua (ACN/H2O, 1:1, v/v) per sciogliere il peptoid. Questo dà la soluzione di riserva campione con una concentrazione di circa 10-3 M.
- Trasferimento di 20 µ l di soluzione madre in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e aggiungere 1 mL miscelati di solvente di ACN/H2O per produrre una soluzione di campione diluito di circa 10-5 M.
- Rimuovi qualsiasi eventuali particelle insolubili nella soluzione campione diluito eseguendo centrifugazione a 4.427 x g per 3 min circa 700 µ l della parte superiore della soluzione di trasferimento in un'altra centrifuga di 1,5 mL tubo per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro con concentrazione di circa 10-5 M.
- Regolare la concentrazione della soluzione di lavoro di MS basata sull'intensità di segnale osservato durante le misurazioni di spettrometria di massa.
- Un modo alternativo per rimuovere eventuali particelle insolubili possibili nella soluzione del campione diluito è passare la soluzione di campione attraverso una siringa filtro 0,20 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro di circa 10-5 M.
- Registrazione di spettri di massa
- Eseguire miscela di solventi di ACN/H2O (1:1, v/v) con la fonte electrospray di ionizzazione (ESI) e impostare lo strumento in uno standard agli ioni positivi, scansione completa modalità di spettrometria di massa con una gamma di rapporto massa / carica (m/z) di 100-1500.
Nota:
Parametri di funzionamento tipici:
Tensione dell'ago di ESI, 5 kV
Tensione capillare, 40 V
Essiccazione di temperatura del gas (azoto), 200 ° C. - Aggiungere circa 300 µ l di soluzione di lavoro di peptoid MS (circa 10-5 M) in una 500 µ l o una siringa da 1 mL e collegare la siringa all'entrata del ESI utilizzando della tubazione capillare polietere etere chetone (PEEK). Posizionare la siringa nella pompa a siringa e impostare la portata a 10 µ l/min per infondere la soluzione di esempio nell'ingresso dell'ESI.
- Accendere la tensione dell'ago ESI per attivare il processo ESI e poi accendere il rivelatore. Impostare la visualizzazione in modalità profilo e la gamma di m/z di 100-1.500. Mostra un profilo di spettro di massa mostrato nella finestra del profilo. Il picco a m/z 1.265 (visualizzato come m/z di 1,264.6) corrisponde alla peptoid peptoid ione o protonata.
- Registrare lo spettro di MS per 2 min. Nella finestra"metodo", utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro.
Nota: Lo spettro di massa risultante è illustrato nella Figura 3. - Ottimizzare l'intensità del picco a m/z di 1.265. Impostare l'intervallo di m/z di 1.150-1.350 e regolare la tensione capillare durante la visualizzazione dell'intensità di picco in mV mostrato nella finestra del profilo. Ad esempio, aumentare la tensione capillare a 50 V o superiore e Mostra la variazione dell'intensità di picco. L'intensità di picco ottimale è intorno a 150-200 mV.
Nota: Regolazione della tensione capillare può cambiare significativamente l'abbondanza di determinati ioni. Aumentando la tensione capillare può migliorare l'intensità dello ione peptoid. Tuttavia, un'alta tensione capillare può anche indurre la dissociazione dello ione peptoid alla sorgente di ioni e diminuire l'intensità osservata. Regolazione della temperatura del gas di essiccazione può migliorare l'intensità del picco a m/z 1.265, ma è meno efficace di regolazione della tensione capillare. Se il picco a m/z 1.265 non raggiunge l'intensità ottima, regolare la concentrazione di campione (o esempio, doppia la concentrazione della soluzione di lavoro di MS). - Accendere lo strumento nella modalità di MS/MS. Impostare lo ione precursore a 1.265 m/z e il MS/MS range a m/z di 100-1.400 di massa. Nella finestra"metodo" utilizzare 1.265 m/z come la "prima messa Q1" e lasciare vuoto il "Ultima messa Q1". Utilizzare m/z 100 come "Q3 prima messa" e m/z 1.400 Mass "Q3 ultimo."
Nota: In modalità MS/MS, le prime funzioni di quadrupolo unità (Q1) come un filtro di massa per isolare lo ione peptoid come lo ione precursore, la seconda unità di quadrupolo (Q2) è una cella di collisione e il terzo quadrupolo unità (Q3) funzioni come un analizzatore di massa. - Insieme l'energia di collisione a 40 eV e il gas di collisione (argon, in questo caso) della pressione a 1,5 mTorr.
- Mostra un profilo di spettro totale visualizzato nella finestra del profilo. Il picco a m/z di 1.265 corrisponde allo ione peptoid, e i picchi con valori inferiori a m/z rappresentano i frammenti dallo ione peptoid.
- Regolare l'energia di collisione per ottimizzare la visualizzazione dello spettro di frammentazione. Ad esempio, aumentare l'energia di collisione a 45 eV e Mostra il cambiamento del profilo dello spettro.
Nota: In generale, aumentando l'energia di collisione migliorerà l'abbondanza degli ioni frammento e ridurre l'abbondanza dello ione peptoid. Aumentando la pressione del gas di collisione consentirà inoltre di migliorare l'abbondanza degli ioni frammento.
Attenzione: Non aumentare la pressione del gas di collisione oltre 2 mTorr. - Registrare lo spettro MS/MS per 2 min. Nella finestra"metodo" utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro.
- Ripetere 1 - 2 tempi di registrazione.
- Eseguire miscela di solventi di ACN/H2O (1:1, v/v) con la fonte electrospray di ionizzazione (ESI) e impostare lo strumento in uno standard agli ioni positivi, scansione completa modalità di spettrometria di massa con una gamma di rapporto massa / carica (m/z) di 100-1500.
- Analisi di sequenza di peptoid
Nota: Nella circostanza di CID, lo ione di peptoid sarebbe frammento presso i legami ammidici lungo la spina dorsale di peptoid per produrre una serie di frammenti N-terminali chiamati B-ioni e una serie di frammenti C-terminale chiamato Y-ioni- Disegnare la struttura chimica della peptoid acetilato inserendo l'estremità N-terminale sul lato sinistro e C-terminale sul lato destro e una linea tratteggiata a ogni legame dell'ammide per generare uno schema di frammentazione, come mostrato nella Figura 2a. Disegnare un protone con un cerchio tratteggiato per indicare l'elemento portante della carica. A partire dal lato sinistro della struttura, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti N-terminali come B1, B2, B8. A partire dal lato destro, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti C-terminale come Y1, Y2, a Y8.
Nota: Un software di disegno chimico può essere utilizzato per disegnare la struttura di peptoid. - Immaginate di frammentazione presso il legame di ammideth 4 dal lato sinistro e disegnare le strutture del frammento N-terminale e il frammento C-terminale con accuse formali corretto, come mostrato nella Figura 2b. Inserire l'etichetta di B4 sul frammento N-terminale e inserire l'etichetta di Y5 sul frammento C-terminale. Calcolare il valore m/z B4 sommando le masse nominale degli elementi nella struttura per produrre un valore di 580 e posto m/z 580 sul frammento N-terminale. Calcolare il valore m/z Y5 e posto m/z 685 sul frammento C-terminale.
- Calcolare i valori di m/z per tutti e otto gli ioni B e tutti e otto gli ioni Y e assemblarli in una tabella, come mostrato nella tabella 1.
Nota: I valori m/z dei frammenti possono essere calcolati utilizzando un prodotto chimico software di disegno. - Aprire lo spettro MS/MS registrato di peptoid utilizzando il software di modifica di dati accompagnato con lo strumento. Impostare le preferenze di etichettatura "Visualizza etichette di ioni" ed etichetta soglia al 3%. Questo genera uno spettro MS/MS con valori m/z etichettati sulle cime.
- Esportare il MS/MS dati spettrali come file di testo nel file CSV formattare e ricostruire lo spettro utilizzando software di elaborazione dati. Inserire i valori m/z sulle cime. Lo spettro di MS/MS risultante è mostrato in Figura 4.
Nota: Alcuni spettrometri di massa sono dotati di software di elaborazione dati in grado di generare lo spettro MS/MS. In questo caso, non è necessario esportare i dati spettrali di MS/MS. - Assegnare i valori m/z mostrati sullo spettro MS/MS a quelli mostrati nella tabella 1 per identificare il corrispondenti B - e Y-ioni. Ad esempio, il picco a m/z 580 è identificato come la B4-ione e m/z 685 viene identificato come il Y5-ioni. Etichettare le cime con i corrispondenti simboli B e Y sullo spettro, come mostrato nella Figura 4.
- Disegnare la struttura chimica della peptoid acetilato inserendo l'estremità N-terminale sul lato sinistro e C-terminale sul lato destro e una linea tratteggiata a ogni legame dell'ammide per generare uno schema di frammentazione, come mostrato nella Figura 2a. Disegnare un protone con un cerchio tratteggiato per indicare l'elemento portante della carica. A partire dal lato sinistro della struttura, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti N-terminali come B1, B2, B8. A partire dal lato destro, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti C-terminale come Y1, Y2, a Y8.
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Representative Results
La struttura di un peptoid 9-mer con acetilazione del N-terminale, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è mostrata nella Figura 1. Il peptoid è stato sintetizzato manualmente in un recipiente di reazione in polipropilene sinterizzato tramite approccio in fase solida. Pista di pattinaggio ammide resina (0,047 mmol, 84 mg con caricamento 0,56 mmol/g) è usata come supporto solido per produrre il peptoid con un poi amidato C-terminus. La catena peptoid è costruita da cicli multipli di aggiunta del monomero. Ogni ciclo di aggiunta del monomero comporta spostamento, bromoacetylation e passi di due reazioni. La bromoacetylation è ottenuta aggiungendo soluzione BMA 0,8 M e 0,8 M DIC soluzione e la reazione dura 20 minuti. Lo spostamento si ottiene con l'aggiunta di soluzione di ammina di 1,0 M per il prodotto di acetilazione e l'acetilazione di reazione prende 1 h. N-terminale è stato effettuato con l'aggiunta di una soluzione di cocktail contenenti 92 µ l di anidride acetica, 43,5 µ l di DIPEA e 2 mL di DMF. Il peptoid è clivata off dalla resina aggiungendo una soluzione cocktail contenente 3,8 mL di TFA, 100 µ l di suggerimenti e 100 µ l di grado HPLC H2O, e la reazione prende 2 h. TFA viene rimosso nella cappa soffiando in un flusso di gas di azoto fino a circa 1 mL viscoso soluzione è lasciata. Il prodotto peptoid precipita in etere etilico ed è isolato mediante centrifugazione, e questa è seguita da due iterazioni di liofilizzazione. Il peptoid risultante è sufficientemente puro per analisi MS/MS.
Lo schema di frammentazione prevista per il peptoid è mostrato in Figura 2a, dove il protone nel cerchio tratteggiato indica il protone"mobile" che avrebbe indotto peptoid frammentazione durante l'esperimento di CID. I frammenti dello ione di peptoid presso i legami ammidici lungo la spina dorsale di peptoid, per cui i siti di frammentazione sono indicati da linee tratteggiate. I frammenti N-terminali sono etichettati come ioni di tipo B e i frammenti C-terminale sono etichettati come ioni Y-tipo. Se la frammentazione si verifica affatto disponibile ammide legami, un totale di otto frammenti N-terminale, B1 a B8, e un totale di otto frammenti C-terminale, Y1 Y.8, avrebbe formato. Ogni frammento ha un corrispondente valore di m/z che viene calcolato sommando le masse nominali di tutti gli elementi nel frammento. Per esempio, le strutture e i corrispondenti valori m/z (masse nominali) di B4-ione e Y5-ioni sono mostrati in Figura 2b. È la formula chimica per lo ione4 B C31H42N5O6+, e la massa nominale è calcolata tramite l'equazione (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Poiché B4 è un ione singolarmente, il valore di m/z sarebbe 580/1 = 580. In Figura 2b, la struttura di B4-ion è una procedura semplificata forma (Vedi sezione di discussione per i dettagli). I valori calcolati m/z (masse nominali) di tutti gli ioni frammento da B1-B8 e da1Y -Y8 figurano nella tabella 1.
L'analisi di massa include due processi. Il primo processo è quello di eseguire l'analisi di spettrometria di massa di scansione completa del campione peptoid. Questo risultato indica se il campione contiene una quantità misurabile del peptoid e la relativa purezza del campione. Lo spettro di massa di scansione completa dello ione peptoid è illustrato nella Figura 3, dove i valori m/z vengono arrotondati al numero intero più vicino. Il picco a m/z 1.265 corrisponde alla peptoid protonata, e il picco a m/z 1.287 corrisponde allo ione sodio addotto della peptoid. Le due cime a 633 m/z e m/z 644 corrispondono rispettivamente a doppiamente protonata e misto protonata-sodiated peptoids. Questi risultati indicano che il campione di peptoid è sufficiente puro per lo svolgimento di analisi di MS/MS.
Il secondo processo in analisi di massa è quello di eseguire l'esperimento di MS/MS sul peptoid protonata a 1.265 m/z. Questo processo include isolando lo ione peptoid precursore della prima unità di quadrupolo, frammentare lo ione peptoid a CID e l'ordinamento gli ioni frammento in base ai loro valori m/z dalla terza unità di quadrupolo. Lo spettro risultante è mostrato in Figura 4, dove i valori m/z vengono arrotondati al numero intero più vicino. Il picco a m/z 1.265 corrisponde alla peptoid protonata. Le altre cime a valori più bassi di m/z corrispondono agli ioni frammento dallo ione peptoid. Gli ioni frammento vengono assegnati come il B-ion o lo Y-ione confrontando i valori m/z con quelli previsti (riportati nella tabella 1) sulla base dello schema di frammentazione di peptoid (illustrato nella Figura 2). Sette Y-ioni (Y2 Y8) e sette B-ioni (B1 a B7) si formano con abbondanze osservabile. Si noti che l'abbondanza degli ioni-Y è molto superiore a quello della maggior parte dei B-ioni.
Figura 1: struttura chimica di peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Il peptoid è stato sintetizzato manualmente tramite l'approccio di fase solida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di frammentazione per il protonata peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. i frammenti dello ione peptoid i legami ammidici lungo la spina dorsale di peptoid per produrre una serie di frammenti N-terminali chiamati B-ioni e una serie di frammenti C-terminale chiamato Y-ioni. a) predetto regime di frammentazione per il protonata peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Le linee tratteggiate indicano i siti di frammentazione, i simboli B1 a B8 indicano i frammenti N-terminale, mentre i simboli Y1 a Y8 indicano i frammenti C-terminale; b) frammentazione di campione con strutture schematiche. Le strutture mostrano la B4-ione e la Y5-ione con m/z corrispondenti valori, rispettivamente. I valori m/z vengono calcolati sommando le masse nominale degli elementi nelle strutture. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Scansione completa spettro di massa di peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, dove i valori m/z vengono arrotondati al numero intero più vicino. Il picco a m/z 1.265 corrisponde allo ione peptoid, [P + H]+, e il picco a m/z 1.287 corrisponde allo ione sodio addotto di peptoid, [P + Na]+. Le due cime a 633 m/z e m/z 644 corrispondono a doppiamente carica peptoid, [P + 2 H]2 + e [Na + H + P]2 +, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spettro MS/MS del protonata peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 etichettati con frammenti assegnati. Il picco a m/z 1.265 corrisponde alla peptoid protonata, [P + H]+, e le vette con i valori più bassi di m/z corrispondono agli ioni frammento. Il B - e Y-ioni sono assegnati confrontando i valori m/z con quelli calcolati sulla base dello schema di frammentazione dello ione peptoid. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| B-ioni | m/z valore (massa nominale) | Y-ione | m/z valore (massa nominale) |
| B1 | 143 | Y1 | 133 |
| B2 | 304 | Y2 | 294 |
| B3 | 419 | Y3 | 409 |
| B4 | 580 | Y4 | 570 |
| B5 | 695 | Y5 | 48W |
| B6 | 856 | Y6 | 846 |
| B7 | 971 | Y7 | 961 |
| B8 | 1132 | Y8 | 1122 |
Tabella 1: Valori m/z teorica calcolata in base allo schema previsto frammentazione del protonata peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . Il B-ion e il Y-ion indicare gli ioni frammento corrispondente del N-terminale e C-terminale, rispettivamente. Ogni valore di m/z (massa nominale) viene calcolato sommando le masse nominale degli elementi in quello ione di frammento.
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Discussion
Un peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è stato sintetizzato utilizzando il protocollo presentato. L'apparecchio per la sintesi coinvolge un vaso di siringa-come reazione di fase solida in polipropilene e un agitatore meccanico. I vasi di reazione sono commercialmente disponibili e a basso costo. Agitatore meccanico è un apparato comune nei laboratori di chimica. Con l'uso di un recipiente di reazione simil-siringa, soluzioni possono essere trascinati e spinto fuori la nave spostando manualmente lo stantuffo. Questa tecnica permette il monomero aggiunta e resina reazioni di scissione si verifichi in nave una singola reazione ed Elimina il passaggio di trasferire il prodotto intermedio associato a resina in un altro recipiente per la scissione. Questa tecnica elimina anche la necessità di un dispositivo di aspirazione rimuovere le soluzioni dal recipiente di reazione. Aspirazione è comunemente usato nella sintesi di peptoid manuale che sono stato dimostrato da altri ricercatori19,20. Lavare accuratamente la resina tra fasi di reazione è fondamentale per ottenere un prodotto di elevata purezza. Un potenziale problema è l'intasamento delle fritte nel recipiente di reazione dopo diversi cicli di aggiunta del monomero. Una soluzione a questo problema è di trasferire la resina in un nuovo vaso di reazione e di continuare il processo di sintesi. Questa tecnica di sintesi funziona bene per peptoids fino a 10-12 residui. Per peptoids più a lungo, diventa difficile rimuovere le soluzioni dal recipiente di reazione spingendo lo stantuffo. In questo caso, un dispositivo di aspirazione può essere utilizzato per rimuovere le soluzioni dal recipiente di reazione (lo stantuffo dovrebbe essere sostituito da un tappo). Nel protocollo di sintesi, il prodotto grezzo viene purificato precipitando il peptoid in etere etilico. Alcuni peptoids più brevi e altamente polari non possono formarsi precipitato in etere etilico. In questo caso, il peptoid può essere isolato da sciogliere il prodotto grezzo in acido acetico al 10% e la soluzione con etere etilico di lavaggio più volte, che è seguita da liofilizzazione. Alcuni peptoids altamente idrofobo non possono formare anche precipitato in etere etilico. In questo caso, far evaporare l'etere etilico e utilizzare una HPLC in fase inversa per purificare il prodotto peptoid.
In questo studio, lo ione di peptoid viene generato da ESI e l'esperimento di MS/MS è effettuato in uno spettrometro di massa triplo quadrupolo. A causa della capacità di isolamento di ioni dalla prima unità di quadrupolo, il campione è infuso direttamente nella sorgente ESI, che elimina la necessità per cromatografia liquida (LC). Singolarmente protonata peptoids può anche essere facilmente generato utilizzando la tecnica di matrix-assisted laser desorption-ionizzazione (MALDI). Gli esperimenti di MS/MS possono essere effettuati utilizzando altri tipi di spettrometri di massa pure, ad esempio uno spettrometro trappola ionica. Sebbene l'abbondanza relativa degli ioni frammento può apparire diverso se gli spettri MS/MS sono registrati utilizzando diversi strumenti, le caratteristiche spettrali qualitative dovrebbero essere simile. In generale, l'abbondanza relativa di diversi frammenti ionici è altamente sensibile ai parametri degli strumenti. Cambiare l'energia di collisione e la pressione del gas di collisione può alterare significativamente l'abbondanza relativa degli ioni frammento. Ad esempio, aumentando l'energia di collisione o la pressione del gas di collisione promuoverà la frammentazione e di conseguenza, l'abbondanza dello ione precursore peptoid diminuirà e l'abbondanza degli ioni frammento aumenterà. Questo studio si concentra su singolarmente carica peptoids. La lunghezza della peptoids studiato usando questo protocollo è limitata dal range m/z dello spettrometro. Per uno spettrometro di massa con range di massa fino a 2.000 m/z, i valori di m/z della peptoids carica dovrebbero essere inferiori al limite superiore. Se il peptoids ha una massa molecolare superiore al limite di spettrometro di massa, un doppiamente protonata peptoid può essere utilizzato come lo ione del precursore. Un peptoid doppiamente carica avrebbe un valore di m/z che è circa la metà di quella carica singolarmente.
Il peptoid presentato in quest'opera contiene un residuo di base con un'ammina primaria come il gruppo della catena laterale. Il residuo di base serve come un sito di protonazione, che migliorerebbe l'efficienza di ionizzazione nell'origine di spettrometro di massa ESI. Meno polare (più idrofobo) peptoids ha efficienza di ionizzazione povero nell'origine ESI. In questo caso, una sorgente di ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) possa essere utilizzata per ionizzare il peptoids. Le condizioni di CID, gli ioni peptoid frammentano principalmente presso i legami ammidici per produrre una serie di frammenti N-terminale e una serie di frammenti C-terminale. Se l'elemento portante della carica, il protone, risiede sui frammenti N-terminale, il modulo B-ioni. In caso contrario, la forma di Y-ioni. La figura 2 Mostra una struttura di B4-ioni. Si tratta di una struttura semplificata, che consente di calcolare il valore di m/z. Gli effettivi B-ioni sono probabilmente formati in una struttura ciclica, come un anello di cinque termini ossazolone23. Non tutti predetti frammenti ionici sono formati nello spettrometro di massa e osservati nello spettro di massa. L'efficienza di formare positivamente caricato ioni frammento è in gran parte determinato dal basicità in fase gassosa (o affinità protonica) del frammento. Frammenti altamente basici hanno un'alta probabilità per formare ioni caricati positivamente e devono essere osservate negli spettri di massa. In generale, osservando almeno il 70% degli ioni frammento predetto dà un ragionevolmente alta fiducia per predire la sequenza di un peptoid. Nella progettazione di peptoids per l'analisi di sequenza mediante spettrometria di massa, è importante posizionare residui con gruppi di catene laterali polari, quali gruppi alcossi, presso diversi siti lungo la catena di peptoid.
Per peptoids più singolarmente carica con acetilazione del N-terminale, il Y-ioni mostrano molto maggiore abbondanza oltre il B-ioni21,23. Come illustrato nella Figura 3, ad eccezione di quella di B1-ione, l'intensità dei picchi corrispondenti agli ioni di B è molto inferiore a quelli degli Y-ioni. Per peptoids con gruppi amminici liberi N-terminale, maggiore abbondanza di Y-ioni sopra B-ioni è stata osservata anche21. Il favorire Y-ioni suggerisce che il protone di portatori di carica preferisce risiedere sui frammenti C-terminale, che è dovuto il più alta affinità protonica del C-terminale frammenti23. Oltre alla formazione di B - e Y-ioni, ioni frammento secondaria associata a perdita di acqua o perdita labile gruppo catena laterale sono osservati spesso in protonata peptoids. Questi ioni frammento secondaria spesso appaiono come una serie di picchi di compagno accanto le vette degli ioni frammento primaria (soprattutto Y-ioni) e possono essere identificati sottraendo la massa del gruppo catena laterale labile dalla massa del primario corrispondente ioni frammento.
Questo protocollo viene illustrato come sintetizzare un oligo-peptoid e analizzare la sequenza di monomero di un peptoid utilizzando un metodo di spettrometria di massa tandem manualmente. Questo protocollo di sintesi può essere facilmente adottato in una chimica laboratorio addestrare nuovi ricercatori in sintesi peptoid didattico. Questo protocollo di spettrometria di massa serve come uno strumento efficace, non solo per confermare l'identità della peptoid, ma anche per caratterizzare le caratteristiche strutturali di peptoid in relazione a modelli la frammentazione osservati. Future applicazioni possono comportare lo sviluppo di una mappa di correlazione che collega la struttura peptoid e il modello di frammentazione attraverso la sintesi e l'analisi di spettrometria di massa di una libreria di diversi peptoids.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il signor Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) per l'assistenza tecnica in sintesi peptoid. Riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (-1301505). Tutti gli esperimenti di spettrometria di massa sono stati condotti presso l'impianto di spettrometria di massa di chimica presso l'Università del Pacifico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
