Summary
החדרה-transurethral תהליך מאתגר, לא טוב תואר בספרות. מטרתו של כתב יד זה הוא לתיאור טכניקה עבור החדרת צנתר למסירה intravesical של נוזלים עם חומרים פעילים אל תוך שלפוחית השתן ו/או הערמונית בעכברים זכרים בוגרים של-transurethral.
Abstract
החדרה-transurethral יכול לשמש כדי לספק פתרונות שונים עם חומרים פעילים (למשל, תרופות, כימיקלים, בקטריה, וירוסים) באופן מקומי לתוך שלפוחית השתן זירוז מודלים חייתיים של פתולוגיות בשלפוחית השתן או להעריך יעילות הטיפולים intravesical. ביותר מכרסמים מודלים של פתולוגיות בדרכי השתן (LUT) התחתון הם המושרה בעכברים הנשי בשל הקלות של intravesical החדרה של החומרים באמצעות לשופכה הנשית. עם זאת, בשל ההבדלים אנטומיים בין LUT נשי, החדרה-transurethral ב עכבר זכר שסברו שהוא הליך מאוד מאתגר, זה לא תוארה בעבר. כתב יד זה, אנו מספקים תיאור מפורט של איך להכין צינורות פוליאתילן (PE) עבור הכניסה הבאים לתוך השופכה של עכבר זכר. בנוסף, נדון בסוגי צינורות PE כדי לשמש בהתאם האתר הרצוי של חיסון אידיאלי. יתר על כן, אנו מתארים נקודת בנקודה כיצד להכין חיה על החדרה-transurethral מוצלח למנוע פציעה של השופכה ולהבטיח המסירה של הפתרון למיקום הרצוי. ההליך מופעל על ידי מפסק את העורלה, העטרה לחשוף את הפתיחה של meatus השופכה. בשלב הבא, העטרה הם אחז על ידי מלקחיים בוטה שאינו מוחצת לייצב את הפין, לאורך צינור PE. צינורות PE הוכנס לראשונה meatus השופכה מקבילה לגוף בעלי חיים, אז הזווית שלו מכוונן בהטיית הקטטר לתמרן אותו ללכת בעקבות את עקמומיות טבעית של השופכה. טכניקה זו יכולה לשמש המושרה מאתר מודלים של פתולוגיות בשלפוחית השתן ו/או להעריך את האפקטיביות של טיפולים intravesical בעכברים זכרים.
Introduction
הגישה החדרה-transurethral שימשה במחקרים קודמים באחת השיטות ליצירת מודלים מכרסם של שלפוחית השתן פתולוגיות1,2,3,4 והוא יכול לשמש כדי להעריך יעילות הטיפולים באופן מקומי ונמסרו בעכברים. למרות בבעלי חיים לא יכול לסכם באופן מלא פתולוגיות אנושי, זיהוי של המנגנונים שבבסיס במחקרים שנעשו בבעלי חיים מספקת הבנה טובה יותר של הפרעות LUT אנושיים כגון תסמונת כאב דלקת שלפוחית השתן interstitial/שלפוחית השתן, neurogenic דלקת שלפוחית השתן, דלקת שלפוחית השתן אוטואימוניות ו דלקת הערמונית5.
ההליך החדרה-transurethral לבצע על העכבר זכר בוגר הוא מאתגר יותר מבחינה טכנית מאשר intravesical החדרה העכבר נקבה בוגרת6. באופן טבעי מעוקל האנטומיה של השופכה הגברית יחד עם קוטר קטן שלה להקשות טכנית לבצע החדרת קטטר-transurethral. לכן, מפורטות הוראות אינדוקציה-transurethral של זיהום בדרכי השתן העכבר6 ו LUT דלקת7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 באמצעות קטטר מוכנס לשלפוחית השתן היו בעבר המתוארים עבור עכברים נקבה בלבד. כתב יד זה שואפת לספק תיאור צעד אחר צעד של הטכניקה-transurethral החדרה של חומרים בעכברים זכרים, לרבות קטעי וידאו, תמונות, איורים. החדרה-transurethral הליכים עכבר זכר בוגר יכול להתבצע עם משתנה inoculates דומה לזה בעבר תיאר את העכבר נקבה7 , התמזגה עם טכניקות נוספות כגון electromyogram הקלטות של תגובות visceromotor (VMR)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים עם בעלי חיים, כולל את השיטה ואת משך ההרדמה, כמו גם טיפול לאחר הניתוח, היו שנדונו עם וטרינר ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)- מוסד קשורות. כתב יד זה, כל הפרוצדורות בוצעו עם 8 בת שבוע 15 C57BL/6 לעכברים זכרים, הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים שאושרו על-ידי IACUC ב מאוניברסיטת קולורדו.
1. הכנה של אבובים
הערה: להחדיר את inoculum, מחט המצורפת לאורך צינור פוליאתילן (PE) ( איור 1 א') או לאמוד קטן (< 24 G) angiocatheter יכול להיות בשימוש ( איור 1 ג'י). השימוש angiocatheter דורש ללא הכנה חוץ עיקור עם 70% אתנול (EtOH). Inoculum הוא חומר זה הוא החדירו/מוזרק/והופקדו בדרכי השתן. זה יכול להיות פתרון המכיל חיידקים, וירוסים או חומר כימי. זה מוכן מראש ועל פי פרוטוקול המחקר. לדוגמה, אם המחקר נועד להעריך את ההשפעות של e. coli חדירתו בדרכי השתן התחתונה, החוקר יהיה עליך להכין את inoculum המכיל חיידקים, אשר יכול להיות מחוסן/החדירו בדרכי השתן התחתונה.
- הכנה של המחט המחוברים לצנרת PE היא פשוטה והיא מורכבת הבאות: לבחור את הגודל של צינורות PE מבוסס על האיבר היעד והתקופה של חיה. לשימוש חיים צעיר יותר 12 שבועות, צינורות PE-10 (מחוץ בקוטר הוא 0.024 ס מ והוא בתוך קוטר 0.011 סנטימטרים). צינורות PE-10 הוא הציע להיות ישימים עבור (1) זריעה העיקרי של inoculum anterior הערמונית (AP), vesicles הזרע (SV), או (2) זריעה העיקרי של inoculum בשלפוחית השתן של חיים צעיר יותר בגיל 12 שבועות. PE צינורות בקוטר גדול של עד מידה 50 PE (מחוץ בקוטר עד ס מ 0.038 ובתוך בקוטר עד 0.023 ס מ) יכול לשמש זריעה העיקרי של inoculum בשלפוחית השתן של בעלי החיים ישנים יותר.
- לחתוך כ 2.5 סנטימטרים של צינורות PE.
- בחר מחט שיתאים לקוטר PE שנבחר לשמש. מחט 27 G יכול להתאים לתוך לומן של צינורות PE-10 ולאחר מחט 22 גרם מתאים לומן של צינורות PE-50-
- להכין המחט לפני הכניסה לתוך לאורך צינור PE על ידי שפשוף על חדות קצה המחט על אבן שמן זמינים מסחרית ( איור 1A -B) שזה משעמם, או להשתמש סיגריה זמינים מסחרית המחט.
- להציג את המחט משעמם ( איור 1C) לתוך לומן צינורות PE. למנוע נזק לומן או כניסתו לומן שווא על-ידי הבטחת השרידים מחט במרכזה של לומן. ( איור 1D -E). אם לאורך צינור PE פגום במהלך החדרת המחט משעמם, לחתוך הסוף פגום ולהפעיל מחדש את התהליך.
- למקם את צינורות PE צמוד-מחט ב- 70% של EtOH עבור עיקור עד השימוש עבור ההליך. סומק 70% EtOH דרך הצנרת מחט-PE לחטא לומן, כדי להבטיח שם זה אין זליגות לאורך צינור PE של נזק במהלך התהליך של הכנסת המחט. אם יש דליפה, מושלך לאורך צינור מחט-PE-
הערה: קצה לאורך צינור PE צריכה להיות חלקה לפני צנתור. כדי למנוע בעיות עם מציגה את צינורות PE לתוך השופכה, מומלץ לחתוך את קצה צינורות PE מייד לפני צנתור ( איור 1F). אורך מינימלי המוצע לאורך צינור PE הוא 1.5 אינץ ', אשר כוללת את החלק המקיפים את המחט.
2. הליך צנתור
- לפני אינדוקציה של הרדמה, לרוקן את השלפוחית של העכבר.
- להפעיל לחץ עדין ועיסוי אל הבטן התחתונה של העכבר. תמרונים אלה בדרך כלל להוביל הרקה ספונטנית. שלפוחית שתן מלאה עלולה לגרום לדילול או דליפה מיידית כל מושתל inoculum.
הערה: אפשרות נוספת כדי להבטיח שלפוחית ריקה ב עכבר הוא לשלול את החיה של מים במשך לפחות שעה לפני תחילת ההליך החדרה-transurethral. מניעת מים צריך יאושרו על-ידי המוסד במסגרת פרוטוקול בעלי חיים-
- להפעיל לחץ עדין ועיסוי אל הבטן התחתונה של העכבר. תמרונים אלה בדרך כלל להוביל הרקה ספונטנית. שלפוחית שתן מלאה עלולה לגרום לדילול או דליפה מיידית כל מושתל inoculum.
- להשתמש מכונת הרדמה עם זרימה איזופלוריין (2%) כדי לגרום הרדמה.
- ברגע החיה. הוא מורדם, הנח אותו על שמיכה חמה חימום ומכסים אותו עם כרית כחול עם האף שלה בתוך nosecone לשם קיום מתמשך הרדמה.
- מאשרים כי החיה הוא בהרדמה על-ידי בדיקת את רפלקס פדלים (הבוהן צביטה).
- פעם רפלקס פדלים נעדר, המשך על ידי מפסק ערלה.
- העיתונות באזור הערווה עם האגודל והן האצבע המורה. של יד אחת ( דמויות 2A ו- 2B), יצא אל הפין בלוטות באמצעות באגודל ובאצבע של (יד אחרים איור 2C). כאשר מטרה זו מושגת כראוי, עורלה, הפין העטרה וגוף הפין נותרים חשופים. ( איור 2D ו- 2F איור). אל תשתמש מלקחיים כדי להוציא את הפין בלוטות כפי זה יגרום נזק לרקמות.
- לשמן את קצה הקטטר, העטרה עם חומר סיכה כירורגי סטרילי לפני החדרת הקטטר. זה יקל על החדרת צינורות PE.
הערה: ריבועים ארוזים בנפרד של חומר סיכה כירורגי, במקום שפופרת גדולה אחת, מומלץ עבור כל שימוש לשמור על תנאים סטריליים. - בעדינות להחזיק את קצה הפין באמצעות מלקחיים משעמם וללחוץ בעדינות את העטרה לגרום את meatus השופכה לפתוח.
- להחזיק את המזרק עם מחט-attached PE-אבובים או PE צינורות עצמה ולהוסיף את צינורות PE באמצעות השופכה meatus.
הערה: אחיזה חצובה של המזרק עם מחט-attached PE-הצנרת או על PE צינורות עצמה באמצעות האגודל, אינדקס, באצבעות מומלצת יציבות.
הערה: הנתיב של צנתור צריך להיות מעוקל בגלל שכדור הטבעי של השופכה מוקף הפין העטרה וגוף הפין העכבר זכרים בוגרים, כפי שמוצג באיור 3A ו- 3B איור. לאורך צינור PE catheterized. אולי אתקל בהתנגדות במהלך צנתור, לכן, מומלץ לכוון את הזווית בהטיית הצנרת למעלה או למטה כדי לעזור מראש את צינורות PE בנוסף לאיבר המטרה. במידת הצורך, צינורות PE ניתן לסובב מעט לעזור לו לתמרן דרך פניות חדות שונים של השופכה. כאשר יש בהתנגדות רבה מדי, הצנרת צריך לשוחרר בחזרה, ואז להתקדם שוב עם לחץ מינימלי. משיכת PE-אבובים בחוץ לגמרי, באמצעות שימון נוסף עשוי להיות מועיל. - לבצע החדרה של inoculum ברגע PE-אבובים הגיעה האיבר הרצוי על-ידי לחיצה על הבוכנה המחט להחדיר האחסון הרצוי של inoculum (5-200 µL אמצעי האחסון הוא הציע).
- עבור החדרה של inoculum אל שלפוחית השתן, לקדם את צינורות PE עד כ- 0.75 ס מ של צינורות PE מוכנס ( איור 3 א).
הערה: עבור החדרה של inoculum AP, SV, בדרך כלל, the מוכנס אבובים פוגש את ההתנגדות ברגע שהוא מגיע לנקודה של פתיחת לתוך הערמונית הקדמי. על-ידי התאמת הזווית בהטיית הצנרת למעלה או למטה, צינורות PE להתקדם עוד עד כ 1 אינץ ' של צינורות PE היה מוכנס ( איור 3B).
- עבור החדרה של inoculum אל שלפוחית השתן, לקדם את צינורות PE עד כ- 0.75 ס מ של צינורות PE מוכנס ( איור 3 א).
3. אין ויוו הדמיה של מערכת השתן התחתונה, הכליות
הערה: מטרת ויוו הדמיה בכתב היד: (1) כדי לאשר לוקליזציה המרחבי של inoculum; ו- (2) כדי להעריך את השכיחות של ריפלוקס של inoculum הכליות. למטרה זו, ניתן להשתמש גם בעכבר מרדימים או לאללה.
- להמחיש בדרכי השתן התחתונה עכבר זכר בוגר, לבצע פתיחת בטן קו האמצע בבטן התחתונה כדי לחשוף את שלפוחית השתן, ערמונית, שלפוחית הזרע.
- תחתכי את העור של האמצע של עצם הערווה עד מתחת הסרעפת באמצעות מספריים.
- העלה את כל העור הרקמה התת עורית.
- לזהות את avascular linea alba ממוקם האמצע, תחתכי את זה כדי להזין את החור בצפק שבו כל האיברים נמצאים.
- לאשר את ההתאמה המרחבית ויזואליזציה של צבע כחול או סוכן מתאים מעקב אחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החדרה-transurethral של צבע כחול דרך צינורות PE 50 גרם החדרה של לצבוע לתוך על שלפוחית השתן (איור 4A), ועל דרך צינורות PE 10 ב הצביעה של SV ו- AP (איור 4B), בהתאמה. להעריך החדרה-transurethral שבוצעו גורם של ריפלוקס מיידית של inoculum לכליות או לא, הכליות ואת שופכן נצפו ולאחריו החדרה של 100 µL של תכלת ושל הפלורסנט (איור 4A-B). אף אחד ההליך החדרה באמצעות שני גדלים שונים של צינורות PE ושני צבעים שונים כתוצאה הצביעה של ureters או של הכליות.
איור 1: 22 G מחט לקראת הכניסה לתוך פוליאתילן (PE) אבובים 50- המחט חד (A) היא חרקו נגד אבן שמן (B) כדי להקהות את קצוות חדים (C). ברגע שהמחט משעמם, המחט הוא מוכנס לתוך לומן צינורות PE (D) ומתקדם על המחט עם מלקחיים בסדר (E). הצנרת נחתך ואז כ- 1.5 ס מ (F). ניתן להשתמש גם 24 G angiocath (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עכבר זכר עורלה מכסה את העטרה, השופכה meatus (א), עם המתיחה קלה של עורלה העטרה יכול להיות חשופים (B), עם המתיחה קלה של העטרה (C), וניתן כולה ערלה מההצעה (D), ובכך המאפשר גישה נוחה meatus שחסימת השופכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: איורים של איברים במערכת השתן התחתונה; שלפוחית השתן, ערמונית, שלפוחית הזרע (SV) מציג החדרה-transurethral באמצעות צינורות PE 50 (א) ו- PE 10 צינורות (B) עבור ראשי זריעה של שלפוחית השתן, ערמונית SV/קדמי, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תמונות של איברים בדרכי השתן העליונות; הכליות, שלפוחית השתן, ערמונית, שלפוחית הזרע (SV) לאחר החדרה-transurethral באמצעות צינורות PE 50 (א) ו- PE 10 צינורות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר בפירוט שיטה של החדרה-transurethral עכבר זכר בוגר. דיפרנציאלית אזור זריעה הראשי ניתן להגיע באמצעות צינורות PE של קטרים שונים. PE-50 מומלץ להגיע בהצלחה לומן שלפוחית השתן, בעוד קוטר גדול יותר ש-PE-10 משמש כדי להגיע AP של SV (איור 3 א-ב). בנוסף, הבחירה של גודל של צינורות PE ו עוגב היעד עבור חיסון גורמים אחרים, כמו עוצמת הקול של inoculum מושתל, גם לשחק תפקיד קצה המיקום ועל ההפצה של הפתרון. הניסויים שלנו להפגין את החדרה-transurethral של µL 100 של כחול לצבוע באמצעות או PE-10 או PE-50 לא תחולל ריפלוקס מיידית לצבוע לכליות. עם זאת, ריפלוקס השתן לכליות שעלול לקרות במהלך התקופה שלאחר ההתקנה, עלול לגרום זיהום בכליות, כמודגם היה בעבר עכברים נקבה בוגרת8. לכן, הערכה היסטולוגית של הכליות מומלץ מאוד לאשר את היעדר זיהום עקיף של הכליות של המיצגים-transurethral.
ישנם מספר שלבים מפתח חשוב לביצוע של החדרה-transurethral מוצלח של inoculum. קודם כל, צינורות PE צריך להיות באורך מספיק — לפחות 2.5 ס מ. זה יאפשר על כוונונים נוספים של אורך צינורות, במידת הצורך, בתהליך ההכנה אבובים, או בעקבות ההליך החדרה-transurethral. מספר ניסיונות וכישלונות במהלך שלב 9 של פרוטוקול זה יכול לגרום סתימה של סוף לאורך צינור PE שנוסף על-ידי נוזלי הגוף. במצב זה, שצריך לחתוך את קצה לאורך צינור PE את יש טיפ ברור נסיונות עוקבות. ברגע לקצה לאורך צינור PE הוא נחתך, חומרי הסיכה כירורגית צריך להחילו שוב. שנית, אחיזה נכונה של מזרק או PE צינורות עצמה להגדיל את אחוזי ההצלחה. שלישית, צריך להיות מוכנס אורך מספיק צינורות PE, עורלה, הפין העטרה וגוף הפין צריך להיות נוקשה בשורה בלי יד ידית במהלך התהליך של צנתור. אחרת, זרם אחורי של inoculum עלול לקרות כאשר הבוכנה המזרק הוא דחף.
תוצאות טובות יותר עבור ההליך החדרה-transurethral יכול להיות תוצאה של תרגול בליווי הימנעות נזק לאיבר שופכה, היעד במהלך ההליך. תוצאות ביצועים הניתנים לאימות באמצעות צבעים צבעוניים או צבעי פלורסנט כמו בהליך כדי לאשר לוקליזציה העיקרי של inoculum סימנים של ריפלוקס לכליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אין כל תודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Ethanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch | Becton Dickson | 205155 | |
| BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS22 | |
| Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS27 | |
| 6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone | Norton | 40204034 | |
| Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Dissecting Forceps, Curved | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Syringe | BD Medical | 309626 | |
| India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 weeks old male C57B/6 Mice | Jackson Lab | #000664 |
References
- Lee, S., Yang, G., Bushman, W. Prostatic inflammation induces urinary frequency in adult mice. PLoS One. 10 (2), e0116827 (2015).
- Wong, L., Hutson, P. R., Bushman, W. Prostatic inflammation induces fibrosis in a mouse model of chronic bacterial infection. PLoS One. 9 (6), e100770 (2014).
- Elkahwaji, J. E., Zhong, W., Hopkins, W. J., Bushman, W. Chronic bacterial infection and inflammation incite reactive hyperplasia in a mouse model of chronic prostatitis. Prostate. 67 (1), 14-21 (2007).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. Prostate. 72 (3), 307-317 (2012).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Bushman, W. Models of inflammation of the lower urinary tract. Neurourol Urodyn. 30 (5), 673-682 (2011).
- Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Boldon, K., Bushman, W. Bacterial cystitis is accompanied by increased peripheral thermal sensitivity in mice. J Urol. 179 (2), 759-763 (2008).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66 (6), 2798-2802 (1998).
- Dinis, P., Charrua, A., Avelino, A., Cruz, F. Intravesical resiniferatoxin decreases spinal c-fos expression and increases bladder volume to reflex micturition in rats with chronic inflamed urinary bladders. BJU Int. 94 (1), 153-157 (2004).
- Cayan, S., et al. Botulinum toxin type A may improve bladder function in a rat chemical cystitis model. Urol Res. 30 (6), 399-404 (2003).
- Jerde, T. J., Bjorling, D. E., Steinberg, H., Warner, T., Saban, R. Determination of mouse bladder inflammatory response to E. coli lipopolysaccharide. Urol Res. 28 (4), 269-273 (2000).
- Saban, M. R., et al. LPS-sensory peptide communication in experimental cystitis. Am J Physiol Renal Physiol. 282 (2), F202-F210 (2002).
- Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. J Immunol. 166 (2), 1148-1155 (2001).
- Saban, M. R., et al. Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BMC Immunol. 8, 6 (2007).
- Bjorling, D. E., et al. Acute acrolein-induced cystitis in mice. BJU Int. 99 (6), 1523-1529 (2007).
- Sadler, K. E., Stratton, J. M., Kolber, B. J. Urinary bladder distention evoked visceromotor responses as a model for bladder pain in mice. J Vis Exp. (86), (2014).
