Summary
Transurethrale Instillation ist eine anspruchsvolle Verfahren und nicht gut in der Literatur beschrieben. Dieses Manuskript soll eine Technik für transurethrale einführen eines Katheters für intravesikale Lieferung von Flüssigkeiten mit Wirkstoffen in der urinausscheidenden Blase und/oder Prostata bei erwachsenen männlichen Mäusen zu beschreiben.
Abstract
Transurethrale Instillation kann verwendet werden, um verschiedene Lösungen mit Wirkstoffen (z. B. Drogen, Chemikalien, Bakterien und Viren) lokal in der Harnblase zu induzieren Tiermodellen der Blase Pathologien oder bewerten liefern die Wirksamkeit der intravesikale Therapien. Die meisten Nager-Modelle der unteren Harnwege (LUT) Pathologien induziert werden bei weiblichen Mäusen aufgrund der intravesikale Instillation von Stoffen über die weibliche Harnröhre zu erleichtern. Jedoch aufgrund der anatomischen Unterschiede zwischen der weiblichen und männlichen LUT, transurethrale Instillation in einer männlichen Maus wurde als ein anspruchsvolles Verfahren, und nicht vorher beschrieben. In diesem Manuskript bieten wir eine detaillierte Beschreibung des wie Polyethylen (PE) Schläuche für spätere Einfügung in die Harnröhre einer männlichen Maus vorzubereiten. Darüber hinaus diskutieren wir die ideale Arten von PE-Rohren in Abhängigkeit vom gewünschten Ort der Impfung verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir Punkt für Punkt wie ein Tier für eine erfolgreiche transurethrale Instillation, Verletzungen der Harnröhre zu vermeiden und sorgen für die Bereitstellung der Lösung an die gewünschte Stelle vorzubereiten. Das Verfahren ist eingeleitet durch Zurückziehen der Vorhaut und die Eichel, die Eröffnung des urethralen Meatus verfügbar zu machen. Als nächstes werden die Eichel durch stumpfe-Brech Zange um den Penis und das PE-Rohr zu stabilisieren erfasst. Das PE-Rohr wird zuerst in der urethralen Meatus parallel zum tierischen Körper eingefügt, dann seine Winkel wird durch Kippen des Katheters zu manövrieren, um die natürliche Krümmung der Harnröhre folgen eingestellt. Diese Technik kann verwendet werden, um induzierte murinen Modelle der Blase Pathologien und/oder Bewertung der Wirksamkeit der intravesikale Therapien bei männlichen Mäusen.
Introduction
Die transurethrale Instillation Ansatz wird in früheren Studien als eine der Methoden, um Nager Blase Pathologien1,2,3,4 -Modelle zu erstellen und kann zur Auswertung verwendet werden die Wirksamkeit von lokal gelieferten Behandlungen bei Mäusen. Obwohl Tiermodellen können nicht vollständig menschliche Pathologien rekapitulieren, bietet Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen in tierexperimentellen Studien ein besseres Verständnis für die menschlichen LUT Störungen wie interstitielle Zystitis/Blase Schmerzsyndrom, neurogene Blasenentzündung, autoimmune Blasenentzündung und Prostata Entzündung5.
Die transurethrale Instillation Eingriff auf einem erwachsenen männlichen Maus ist technisch anspruchsvoll als intravesikale Instillation eines Erwachsenen weiblichen Maus6. Die natürlich geschwungene Anatomie der männlichen Harnröhre zusammen mit seinem kleinen Durchmesser machen es technisch schwierig, die transurethrale einführen des Katheters zu erreichen. Daher, eine ausführliche Anleitung für die transurethrale Induktion der Maus urinausscheidende Fläche Infektion6 und LUT Entzündung7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 über Katheter Blase eingefügt wurden zuvor für weibliche Mäuse nur skizziert. Dieses Manuskript soll eine schrittweise Beschreibung der Technik für transurethrale Instillation von Stoffen bei männlichen Mäusen, einschließlich video-Clips, Bilder und Illustrationen. Transurethrale Instillation Verfahren in Erwachsener männliche Mäuse mit Variablen durchgeführt werden können inoculates ähnlich wie zuvor beschrieben in der weiblichen Maus7 und fusionierte mit zusätzlichen Techniken wie Elektromyogramm Aufnahmen von visceromotor Reaktionen (VMR)16.
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Protocol
alle Verfahren mit Tieren, einschließlich der Art und Dauer der Anästhesie sowie postoperative Pflege mit einem Tierarzt besprochen und genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an die angegliederten Institution. In dieser Handschrift wurden alle Verfahren mit 8 bis 15 Wochen alten C57BL/6 männlichen Mäusen durchgeführt und das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien genehmigt durch die IACUC an der University of Colorado.
1. Vorbereitung der Schläuche
Hinweis: um das Inokulum vermitteln, eine Nadel befestigt, Polyethylen (PE) Schläuche ( Abbildung 1A) oder ein kleines Messgerät (< 24 G) Angiocatheter () verwendet werden kann Abbildung 1). Die Verwendung eines Angiocatheter bedarf keinerlei Vorbereitung außer Sterilisation mit 70 % Ethanol (EtOH). Das Inokulum ist die Substanz die eingeflößt/injiziert/in die Harnwege hinterlegt ist. Dies kann mit Bakterien, Viren oder eine chemische Lösung sein. Dies ist vor der Zeit und der Forschungs-Protokoll bereit. Zum Beispiel, wenn Ziel der Studie ist die Bewertung der Auswirkungen von E. Coli-Infektion auf die ableitenden Harnwege, der Forscher müssen bereiten das Inokulum enthalten Bakterien, die in den unteren Harnwegen geimpft/eingeflößt werden können.
- Vorbereitung der Nadel an PE-Schlauch angeschlossen ist einfach und besteht aus den folgenden: Wählen Sie die Größe der PE-Schlauch basierend auf das Zielorgan und dem Alter des Tieres. Verwenden Sie für Tiere, die jünger als 12 Wochen, PE-10 Rohre (Außendurchmesser ist 0,024 Zoll und Innendurchmesser 0,011 Zoll). PE-10 Schlauch wird vorgeschlagen, für (1) die primäre Aussaat des Inokulums im vorderen Prostata (AP) und Samenbläschen (SV), oder (2) die primäre Aussaat des Inokulums in der Blase eines Tieres, das jünger als 12 Wochen alt sein. PE-Schlauch mit einem größeren Durchmesser von bis zu Größe PE 50 (Außendurchmesser bis zu 0,038 Zoll und Innendurchmesser bis 0,023 Zoll) eignet sich für die primäre Aussaat des Inokulums in der Blase der älteren Tiere.
- Schnitt ca. 2,5 Zoll PE Schlauch.
- Wählen Sie eine Nadel, die passen die gewählten PE Durchmesser verwendet werden. 27 G Nadel kann in das Lumen der PE-10 Schläuche passen, und 22 G Nadel passt das Lumen der PE-50 Schlauch.
- Bereiten die Nadel vor dem Einsetzen in den PE-Schlauch durch reiben die scharfe Kante der Nadel auf einer handelsüblichen Ölstein ( Abbildung 1A -B) zu langweilig zu machen, oder verwenden Sie ein handelsübliches stumpf Nadel.
- Die stumpfe Nadel ( Abbildung 1) in das Lumen der PE-Schlauch einführen. Verhindern Sie Schäden die Lumen oder Einstieg in eine falsche Lumen durch die Nadel bleibt in der Mitte des Lumen zu gewährleisten. ( Abbildung 1 -E). Wenn das PE-Rohr beim Einsetzen der stumpfe Nadel beschädigt ist, schneiden Sie das beschädigte Ende und starten Sie den Prozess.
- Legen Sie die Nadel aufgesetzt PE-Schlauch in 70 % EtOH für Sterilisation bis seine Verwendung für das Verfahren. Flush, die 70 % EtOH durch die Nadel-PE-Schläuche, das Lumen zu sterilisieren und um sicherzustellen, dass keine Leckage aus PE-Rohren aus ist während des Prozesses der Nadel einsetzen zu beschädigen. Falls es austritt, das Nadel-PE-Rohr verworfen.
Hinweis: Die Spitze des PE-Rohres muss vor der Katheterisierung glatt sein. Um Probleme mit der Einführung des PE-Schlauch in die Harnröhre zu vermeiden, empfiehlt es sich, die Spitze der PE-Schlauch unmittelbar vor der Katheterisierung ( Abb. 1F) abgeschnitten. Die empfohlene Mindestlänge des PE-Rohres ist 1,5 Zoll, worunter das Teil rund um die Nadel.
2. Katheterisierungsverfahren
- vor der Induktion der Anästhesie, entleeren die Blase Maus.
- Üben Sie sanften Druck und massage, um den Unterleib der Maus. Diese Manöver führen in der Regel zur spontanen Entleerung. Eine volle Blase kann die Verdünnung oder sofortigen Leckage jeder eingeflößt Inokulum führen.
Hinweis: Eine zusätzliche Option, um eine leere Blase in einer Maus zu gewährleisten ist, das Tier Wasser für mindestens 1 Stunde vor Beginn des Verfahrens transurethrale Instillation zu berauben. Wasserentzug durch die Institution als Bestandteil der tierischen Protokoll genehmigt werden.
- Üben Sie sanften Druck und massage, um den Unterleib der Maus. Diese Manöver führen in der Regel zur spontanen Entleerung. Eine volle Blase kann die Verdünnung oder sofortigen Leckage jeder eingeflößt Inokulum führen.
- Ein Anästhesiegerät mit Isofluran Fluss (2 %) verwenden, um Anästhesie induzieren.
- Sobald das Tier betäubt ist, legen Sie sie auf eine herzliche Wärme-Unterbett und bedecken Sie es mit einem blauen Pad mit seiner Nase innen Nosecone für die Aufrechterhaltung des kontinuierlichen Anästhesie.
- Bestätigen, dass das Tier in Narkose ist, indem das Pedal Reflex (Zehe Prise).
- Nachdem das Pedale Reflex nicht vorhanden ist, fahren Sie durch Zurückziehen der Vorhaut.
- Presse die Schamgegend mit Daumen und Zeigefinger einer Hand ( Figuren 2A und 2 b), und ziehen Sie die Drüsen Penis mit Daumen und Zeigefinger der anderen Hand ( Abbildung 2). Wenn dies korrekt durchgeführt wird, sind die Vorhaut, Eichel und Penis Körper ausgesetzt. ( Abb. 2D und Abbildung 2F). Verwenden Sie keine Zange Drüsen Penis herausziehen, da dies zu Beschädigungen des Gewebes führen wird.
- Die Spitze des Katheters und die Eichel mit sterilen chirurgischen Schmiermittel vor dem Einführen des Katheters zu schmieren. Dies erleichtert die Einfügung des PE-Rohres.
Hinweis: Einzeln verpackte Quadraten chirurgische Schmiermittel, anstatt eine große Röhre, werden empfohlen, für jede Nutzung auf sterile Bedingungen zu erhalten. - Halten Sie die Spitze des Penis mit stumpfen Pinzette vorsichtig und drücken Sie vorsichtig die Eichel um den urethralen Meatus öffnen verursachen.
- Halten Sie die Spritze mit der Nadel aufgesetzt PE-Schläuche oder PE Schläuche selbst und legen Sie die PE-Schlauch durch den urethralen Meatus.
Hinweis: Ein Stativ Griff die Spritze mit der Nadel aufgesetzt PE-Schläuche oder PE Schläuche mit dem Daumen, zeige- und Mittelfinger wird empfohlen für die Stabilität.
Hinweis: Der Pfad der Katheterisierung sollte wegen der natürlichen Krümmung der Harnröhre, der Eichel und Penis Körper in der erwachsenen männlichen Maus umgeben, wie in Abbildung 3A und 3 b Abbildung gezeigt gebogen werden. Die katheterisierte PE-Schlauch kann Widerstand während der Katheterisierung treffen, daher, es wird empfohlen, den Winkel durch das Rohr nach oben oder unten Hilfe voraus Kippen des PE-Rohr weiter auf das Zielorgan. Bei Bedarf kann das PE-Rohr leicht gedreht werden, um es durch die verschiedenen scharfen Kurven der Harnröhre zu manövrieren zu helfen. Wenn es gibt zu viel Widerstand, der Schlauch wieder gezogen werden sollten und dann wieder mit minimalem Druck. Ziehen das PE-Rohr vollständig und mit mehr Schmierung kann hilfreich sein. - Instillation des Inokulums ausführen, sobald das PE-Rohr das gewünschte Organ erreicht hat, indem man die Nadel Kolben, um die gewünschte Lautstärke des Inokulums einzuflößen (5-200 µL Volumen wird vorgeschlagen).
- Für Instillation des Inokulums in der Harnblase fördern den PE-Schlauch bis ca. 0,75 Zoll PE Rohr wird eingefügt ( Abbildung 3A).
Hinweis: für die Instillation des Inokulums in der AP und SV, im Allgemeinen, the eingefügt Schläuche trifft Widerstand, sobald es den Punkt der Öffnung in die vorderen Prostata erreicht. Durch Einstellung des Winkels durch Kippen des Schlauchs nach oben oder unten, das PE-Rohr wird weiter bis etwa 1 Zoll PE Rohr wurde eingefügt ( Abb. 3 b).
- Für Instillation des Inokulums in der Harnblase fördern den PE-Schlauch bis ca. 0,75 Zoll PE Rohr wird eingefügt ( Abbildung 3A).
3. In Vivo Bildgebung des ableitenden Harnwege und Nieren
Hinweis: der Zweck der in-Vivo Bildgebung in diesem Manuskript ist: (1) die räumliche Lokalisation des Inokulums; bestätigen und (2) die Inzidenz des Rückflusses des Inokulums zu bewerten die Nieren. Zu diesem Zweck entweder betäubt oder euthanasierten Maus verwendet werden kann.
- Um die ableitenden Harnwege Erwachsener männliche Mäuse zu visualisieren, führen Sie unteren Bauch Mittellinie Laparotomie, die Blase, Prostata und Samenbläschen aussetzen.
- Die Haut in der Mittellinie vom Schambein bis knapp unter dem Xiphoid Prozeß mit einer Schere einzuschneiden.
- Erhöhen die Haut vom Unterhautgewebe.
- Identifizieren die avaskuläre Linea Alba befindet sich in der Mittellinie und dies geben wo befinden sich die Organe der Bauchhöhle einzuschneiden.
- Bestätigen die räumliche Lokalisation von Visualisierung des blauen Farbstoff oder einem anderen geeigneten Tracking Agent.
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Representative Results
Transurethrale Instillation von blauen Farbstoff über PE 50 Schlauch führte Instillation des Farbstoffs in der Harnblase (Abb. 4A) und via PE 10 Schläuche in Einfärbung des SV und der AP (Abbildung 4 b). Um festzustellen, ob der durchgeführten transurethrale Instillation eine sofortige Rückfluß des Inokulums zu den Nieren oder nicht bewirkt, beobachtet die Niere und Harnleiter gefolgt von Instillation von 100 µL der blauen Farbstoff und Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 4A-B). Keiner der das Instillation Verfahren mit zwei verschiedenen Größen von PE Rohren und zwei verschiedenen Farbstoffen führte Einfärbung der Harnleiter oder Nieren.
Abbildung 1: 22 G Nadel Vorbereitung zum Einfügen in Polyethylen (PE) Schläuche 50. Die spitzen Nadel (A) ist die scharfen Kanten (C) stumpf geschliffen gegen einem Ölstein (B). Sobald die Nadel stumpf ist, wird die Nadel in das Lumen der das PE-Rohr (D) eingefügt und erweiterte über die Nadel mit einer feinen Pinzette (E). Der Schlauch wird dann bis ca. 1,5 Zoll (F) geschnitten. 24 G Angiocath (G) kann auch verwendet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Männlichen Maus Vorhaut bedeckt die Eichel und urethraler Meatus (A), mit leichten Traktion der Vorhaut die Eichel kann ausgesetzt (B) und mit leichten Traktion der Eichel (C), lassen sich die gesamte Vorhaut zurückgezogen (D), so ermöglicht einfachen Zugang zu den urethralen Meatus und der Harnröhre. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Abbildungen der unteren Harnwege Organe; Harnblase, der Prostata und der Samenblase (SV) transurethrale Instillation mit PE 50 Schlauch (A) und PE-10 Rohre (B) für die primäre Aussaat der Harnblase und der SV/anterior Prostata bzw. zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Bilder der oberen und unteren Harnwege Organe; Nieren, Harnblase, Prostata und Samenblase (SV) nach transurethrale Instillation mit PE 50 Schlauch (A) und PE-10 Rohre (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt ausführlich eine Methode der transurethrale Instillation in erwachsenen männlichen Maus. Differenzielle seeding Hauptbereich erreicht mit PE-Rohre mit unterschiedlichen Durchmessern. PE-50 empfiehlt sich für erfolgreich erreichen der Harnblase Lumen, während Sie einen größeren Durchmesser, die, den PE-10 verwendet wird, um die AP und SV (Abb. 3A-B) zu erreichen. Neben der Wahl der Größe von PE-Rohren und Zielorgan für die Impfung Rolle andere Faktoren wie das Volumen des Inokulums eingeflößt, auch eine in der Endposition und Verteilung der Lösung. Unsere Experimente zeigen, dass transurethrale Instillation von 100 µL blau färben mit entweder PE-10 oder PE-50 löst keine sofortige Rückfluß des Farbstoffes in den Nieren. Jedoch der Rückfluss des Urins in die Nieren kann während der Post-Instillation Zeit passieren und unter Umständen Niereninfektion, wie zuvor in Erwachsenen weiblichen Mäusen8gezeigt wurde. Daher empfiehlt histologische Auswertung der Nieren, das Fehlen von indirekten Kontamination der Nieren von transurethrale arbeiten zu bestätigen.
Es gibt mehrere wichtige wichtige Schritte zu einer erfolgreichen transurethrale Instillation des Inokulums durchführen. Erstens sollte das PE-Rohr von ausreichender Länge sein – mindestens 2,5 Zoll. Dies würde für zusätzliche Anpassungen von der Schlauchlänge bei Bedarf während des Vorbereitungsprozesses Schläuche oder im Anschluss an die transurethrale Instillation Verfahren ermöglichen. Mehrere Versuche und Fehlschläge bei Schritt 9 dieses Protokolls können eine Blockierung der eingefügten Ende des PE-Rohres durch Körperflüssigkeiten verursachen. In diesem Fall sollte die Spitze des PE-Rohres ausgeschnitten werden, um ein klarer Tipp für nachfolgende Versuche haben. Sobald die Spitze des PE-Rohres geschnitten wird, sollte die chirurgische Schmiermittel erneut angewendet werden. Zweitens ein richtigen Griff von der Spritze oder PE Schläuche selbst die Erfolgsquote steigern. Drittens: eine ausreichende Länge des PE-Rohres eingefügt werden soll und die Vorhaut, Eichel und Penis Körper sollte werden starr aufgereiht ohne Griff während des Prozesses der Katheterisierung. Rückfluss des Inokulums kann sonst passieren, wenn der Spritzenkolben geschoben wird.
Bessere Ergebnisse für die transurethrale Instillation Prozedur können eine Folge der Praxis begleitet durch die Vermeidung von Schäden an der Harnröhre und Ziel Orgel während des Verfahrens sein. Leistungsergebnisse können validiert werden, mithilfe von farbigen Farbstoffe oder fluoreszierende Farbstoffe als das Verfahren, um primäre Lokalisation des Inokulums und irgendwelche Anzeichen von Reflux in den Nieren zu bestätigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren haben kein Bestätigungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Ethanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch | Becton Dickson | 205155 | |
| BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS22 | |
| Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS27 | |
| 6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone | Norton | 40204034 | |
| Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Dissecting Forceps, Curved | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Syringe | BD Medical | 309626 | |
| India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 weeks old male C57B/6 Mice | Jackson Lab | #000664 |
References
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