Summary
Vi beskriver här stenos i inferior vena cava som murina modell av djup ventrombos. Denna modell recapitulates blod flöde begränsning, en av de stora triggers för ventrombos hos människor.
Abstract
Djup venös trombos (DVT) och dess förödande komplikation, lungemboli, är ett allvarligt hälsoproblem med hög dödlighet. Mekanismerna av tromb bildas i venerna är fortfarande oklara. Bristen på rörlighet (t.ex., efter kirurgi eller långdistansflygningar) är en av de viktigaste faktorerna som leder till DVT. Patofysiologiska följden av bristen på rörlighet är blod flöde stagnation i venösa klaffarna. Här beskrivs en modell som härmar sådana flöde störningar som en trombos-drivande faktor. I denna modell skapas partiell flöde begränsning (stenos) i den sämre vena cava (IVC). Stängningen av ca 90% av IVC lumen för 48 h resulterar i utvecklingen av tromboser strukturellt liknar de hos människa. Likheterna är: i) de flesta av tromb volymen är röd, dvs består av röda blodkroppar och fibrin, ii) förekomsten av en vit del (linjer av Zahn), (iii) icke-utblottad endothelial enskiktslager, iv) förhöjda plasmanivåer D-Dimer och v) möjligheten att förhindra trombos av lågmolekylärt heparin. Begränsningar inkluderar variabel storlek tromboser och faktumet att en viss procentandel av vildtyp möss (0 - 35%) inte kan producera en tromb. Utöver visuell observation och mätning, kan tromboser visualiseras genom icke-invasiv teknik, såsom ultraljud, som tillåter övervakning dynamiken i tromb utveckling. Vid kortare tidpunkter (1-6 h), intravital mikroskopi kan tillämpas för att direkt observera händelser (t.ex., rekrytering av celler till kärlväggen) föregår tromb bildas. Användning av denna metod av flera team runt om i världen har gjort det möjligt att avslöja grundläggande mekanismer DVT insättande och identifiera potentiella mål som kan vara till nytta för att förebygga.
Introduction
Djup ventrombos (DVT) är utvecklingen av tromboser i djupa vener, vanligtvis (men inte bara) i benen. I Konjunktioner med lungemboli (PE; designerat tillsammans som venös tromboembolism, VTE) det framkallar i ungefärligt 900.000 amerikaner årligen och utgör en allvarlig hälsofråga och ekonomiskt problem1,2. PE, en komplikation av DVT, uppstår när en tromb blir fristående från dess ursprungliga plats och når lungorna, vilket kan orsaka andningsinsufficiens och död. Dödssiffran från VTE överskrider dödligheten i AIDS, breast cancer och trafikolyckor, kombinerade3.
Den viktigaste faktorn som orsakar DVT förutom är kända skäl, såsom cancer eller trauma, bristen på rörlighet 4,5. Detta kan resultera från kirurgi (särskilt ortopediska), förlamning, långdistansflygningar eller andra skäl. Blodflödet i venerna beror på muskelpump och därför lem immobilisering resultat i stillastående blod flöde i venösa klaffarna, vilket leder till Trombos. Syftet med den metod som beskrivs häri är att sammanfatta sådant blod flöde distorsion6,7. Delflöde begränsning i den sämre vena cava (IVC) härmar villkor skapade i mänskliga venösa klaffarna och resulterar i bildandet av en tromb liknande struktur som människans tromboser6. Den stora delen av en tromb är röd och består av införlivandet av blodplättar, röda blodkroppar och fibrin. Tromboser har en liten ”vita delen” berikad i trombocyter (figur 1), som liknar ”rader med Zahn” som beskrivs i mänskliga venösa tromboser. Båda delarna av tromben innehåller också neutrofiler8, som är bland de första cellerna ska rekryteras på platsen för framtida tromb6,9. Neutrofiler i den röda delen utvisa neutrofila extracellulära fällor (nät), medan neutrofiler i den vita delen verkar sakna nät8. Likaså att mänskliga DVT åtföljs trombos hos möss av förhöjda plasmanivåer D-dimer (figur 2). Lågmolekylärt heparin (enoxaparin), används för DVT profylax hos patienter, förhindrar också trombos hos möss. En viktig fördel med denna metod är avsaknad av endothelial denudation9, vilket är karaktäristiskt för mänskliga DVT10. Denna funktion gör IVC stenos en mer kliniskt relevant modell av DVT än, till exempel induktion av trombos av järnklorid, som inducerar endotelial denudation och där tromboser består huvudsakligen av trombocyter11, 12,13. En modell av komplett Stas i IVC föredras av flera lag14,15,16. I motsats till stenos, där kvarstående flöde underhålls i fartyget, tillämpning av stasis stoppar helt flödet och därmed begränsar tillgängligheten till systemiskt administrerade substanser till webbplatsen trombos. Det verkar också att mekanismerna bakom trombos som induceras av stenos och stasis är olika: stenos resulterar i utvecklingen av lokal inflammation (aktivering av endotel, frisläppandet av Weibel-Palade kropp innehåll, rekrytering av immunceller och trombocyter att kärlväggen) orsakar ”immunothrombosis”6,9,17, stasis förefaller att inducera snarare trombos utifrån, i synnerhet vävnadsfaktor och andra koagulering och fibrinolys-relaterade mekanismer18,19,20. Således, stenos och stasis modellerna återspeglar lite olika aspekter av venös trombos utveckling, även om deras mekanismer kan säkerligen överlappa. Elektrolytisk IVC modell (EIM) DVT21,22 inducerar en tromb som endast delvis occluding kärlväggen. Därför är det bekvämt för att testa effekterna av systemisk administrering av olika droger på tromb tillväxt. Denna modell, förutsätter dock störningar av IVC vägg integritet (infogning av en nål) och induktion av trombos av elektrisk ström att göra patofysiologiska relevansen av denna mekanism minst omtvistat.
Protocol
Alla djur förfaranden var godkända av etisk granskning djurskyddsorganets och UK Home Office (Storbritannien, projektet licens 40/3745). Möss på C57BL/6 bakgrund, 8-12 vecka gamla, 19-25 g kroppsvikt, av båda könen används.
1. animaliskt anestesi
- Placera en mus i en induktion kammare och inducera anestesi av en blandning av 5% isofluran med 100% syrgas. Använda ett flöde av 0,5 L/min. vänta tills musen helt slutar röra sig och dess frekvens av andning blir sällsynta.
- Ta bort musen från kammaren och raka buken med en elektrisk klippare. Ta bort hår från buken så grundligt som möjligt att undvika kontaminering av bukhålan.
- Placera musen i ryggläge och placera musens näsan i en kon kopplad till anestesi systemet. Minska procentandelen isofluran till 2-3% (den exakta procenten kan skilja sig något från djur till djur). Kontrollera att djuret sover med dess andningsfrekvens är lägre än vanligt men undvika kippar. Om kippar inträffar, minska procenten av isofluran med 0,5%.
- Kontrollera den pedal reflexen för att bekräfta korrekt anesthetization och starta operation endast om det är negativt. Applicera vet salva på ögonen för att förebygga torrhet.
- Tillämpa en anti-bakteriedödande lösning (1% Hibitane) på musens buken och torka området med hjälp av en steril bomull bud på ett sätt som exklusive potentiella förnyad kontaminering av operationsområdet (t.ex., insida till ut i en cirkulär mode). Upprepa 3 gånger.
2. tillämpningen av IVC stenos och mus återhämtning
Obs: Alla instrument såväl som material (bomullspinnar, gasväv, saltlösning etc.) komma i kontakt med området kirurgi måste vara sterila. Operatören måste skrubba före operation och bära sterila handskar och klänning under förfarandet. Mikroskopet handtagen bör vara insvept i en steril folie.
- Ge möss en mot smärta behandling före operation och under hela försöksperioden. Exempelvis använda buprenorfin 0,1 mg/kg subkutant 30 min innan kirurgi och sedan varje 12 timmar tills djuret är euthanized. Som trombos i denna metod utvecklas på samma sätt till steril inflammation, Undvik att använda antiinflammatoriska läkemedel som en premedicinering.
- Täcka musen med en steril draperi och gör ett hål i drapera att avslöja platsen för kirurgi. Med sax, gör ett snitt längs med buken mittlinjen, 1,5 cm ner från bröstbenet. Med hjälp av bomullspinnar exteriorize tarmar till vänster sida av musen och täck dem med steril gasbinda indränkt i varmt (37 ° C) koksaltlösning att undvika uttorkning.
- Identifiera IVC och dess sidogrenar (det kan vara 0, 1 eller 2 av dem) i kaudala riktning från platsen av sammansmältning av IVC med den vänster nedsatt ven. Ligera alla synliga sidogrenar med 7-0 inert Prolene suturer som nära IVC som möjligt.
- Försök att inte hålla sidogrenar med tången direkt utan snarare dra dem upp håller fett vävnaden som omger dem med tång i ena handen och göra en tunnel under grenen med pincett i andra handen. Stäng inte tillbaka grenar.
- Håll omgivande vävnader med pincett, dra till IVC upp och vänster producerar spänningar i det lilla området mellan IVC och den stora kroppspulsådern exakt på vinkeln mellan IVC och den vänstra njurvenen. Beakta att det är praktiskt taget omöjligt att separera aorta från IVC även 2-3 mm under (i kaudala riktning).
- Använda skilda rörelser med pincett tips i din högra hand göra ett hål mellan stora kroppspulsådern och IVC. Tänk på att fler rörelser gjort, ju högre risken för skada fartyget. Idealiskt, försöka minimera antalet rörelser till 3-5.
- Förbereda en bit av 7-0 inert Prolene sutur av ca 2 cm lång. Placera den i musens bukhålan på förarens vänstra sida i närheten av IVC.
- Dra IVC upp och vänster igen. Sätt din rätt pincett tips i hålet mellan stora kroppspulsådern och IVC så att tips visas på andra sidan av IVC. Ta suturen och dra den tillbaka genom hålet (figur 3A).
- Göra en preliminär Knut med suturen men inte stänga den. Placera 30G nål (”en spacer”) böjd som en krok till Knut och nu stängs (figur 3B).
- Ta bort mellanlägget (figur 3C).
- Returnera tarmarna tillbaka till bukhålan med en bomullstuss bud och fördela dem jämnt i den.
- Nära peritoneum med 6-0 vicryl sutur med kontinuerlig loopar. Nära första och sista slingorna som en knut.
- Nära huden med metall häftklammer.
- Injicera musen med 0,5 mL av varm (37 ° C) glukos saltlösning subkutant för att återställa flytande balansen av organismen.
- Placera musen i en enskild bur i ett varmt (25 ° C) kammare eller rum och få mat och gel vatten inne i buren. Iaktta tills musen är helt återställd (allmänt, runt 1 h).
Representative Results
Häri, beskrivs en modell av DVT induceras av flöde distorsion i IVC. Induktion av stenos i IVC initierar distorsion och stagnation av blodflödet och efter ett tag (i detta fall, 48 h) resulterar i utvecklingen av en tromb, strukturellt liknar mänskliga DVT tromboser (figur 1A). Förekomsten av en tromb inuti IVC är lätt upptäckas visuellt (figur 1B). En viktig likhet mellan modell och mänskliga DVT är förhöjda plasmanivåer D-dimer (figur 2). D-dimer är en produkt av fibrin nedbrytning och dess närvaro i blodet tyder på att en aktiv trombotisk process pågår.
Modellen presenteras steg för steg i figur 3A-C. IVC utsätts noggrant, ett hål mellan IVC och aorta och en sutur (Prolene 7-0) dras genom hålet under IVC. Sedan är IVC sammanskrivna av suturen över en spacer (30G nål, figur 3D), efter som mellanlägget avlägsnas. Detta förfarande möjliggör för ca 90% stängning av IVC lumen lämnar de återstående 10% patent. Detta säkerställer blod flöde stagnation så småningom leder till Trombos.
Figur 4 visar den största nackdelen av modellen, variabel tromb storlek. Alla dessa tromboser erhölls i samma experiment utförs på vildtyp hanmöss av samma ursprung, ålder och liknande kroppsvikt. Även om alla möss producerat tromboser (trombos prevalens av 100%), varierar deras storlek tydligt i ett brett utbud.
Figur 1: Representativa trombos efter 48 h begränsning/stenos. (A), en typisk trombos efter 48 h IVC stenos. Obs röd (röd blod cell-berikad) och vit (trombocyt-berikad) delar. (B) IVC med (vänster) eller utan (till höger) en tromb. Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Förhöjda plasmanivåer D-dimer efter IVC stenos applicering. Möss utsattes för IVC stenos. Blodet togs vid angivna tidpunkter, stabiliserad 1:9 med 3,8% natriumcitrat, plasma förbereddes genom centrifugering (2300 x g, 5 min) och D-dimer nivåer bestämdes genom en ELISA kit enligt tillverkarens anvisningar. Cirklar utse sham manövrerade möss, korsar utse IVC stenos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flöde begränsning/stenos i Inferior Vena Cava (IVC) modellen av DVT hos möss. På varandra följande stadier av modellen presenteras. (A) ett hål mellan IVC och aorta är gjord och en suturen dras igenom det runt IVC. (B) en knut är stängd över en spacer (30 G nål). (C) mellanlägget avlägsnas: slutliga anser att kirurgen ser innan du stänger musen. Den streckade gula linjen avgränsas IVC. LRV står för vänster nedsatt ven. Skala barer = 0,2 mm. (D) distansen (30 G nål). Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Variabilityen av tromb storlek.
Möss utsattes för 48 h IVC stenos. Presenterade erhålls tromboser i samma experiment. Skala barer 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Här, presenteras ett protokoll av den IVC stenos, som härmar blod flöde distorsion, en viktig utlösande faktor för DVT. Stenos i IVC inducerar utveckling av tromboser i 65-100% av C57BL/6 möss inom 48 h och 25-50% av möss inom 2-6 h6,8,23 (Brill A, opublicerade data, 2016). En stor begränsning för metoden är variationerna i tromb storlek24 (figur 4), som kan observeras efter både kortsiktiga (6 h) och långsiktiga (48 h) IVC stenos. Skälen för sådana variabilitet (med tanke på att samma villkor, såsom distansen, anestesi osv, används) förblir dunkla men man kan spekulera att Anatomiska variationer mellan möss (t.ex. bredd av IVC, antalet och placeringen av både sida och tillbaka grenar) ligger bakom detta fenomen. Variabiliteten i tromb storlek gör trombos förekomsten (procent av möss med en tromb) det viktigaste resultatet. Trombos prevalensen kan jämföras med oförutsedda bord och Fishers exakta test. Ett av experimenten var ett undantag när reducerade tromb storlek med samma trombos förekomsten efter injektion av podoplanin-hämmande antikroppar observerades 7.
Denna metod är särskilt användbart när venös trombos inledande studeras. Det möjliggör utreda tidiga händelser i kärlväggen, såsom rekrytering av celler, leder så småningom till Trombos. Pro - eller anti - thrombotic effekterna av droger kan utvärderas med hjälp av denna modell med trombos prevalens är en primär avläsning. Stenos för 48 h är tillämpligt att avslöja en anti-trombotisk fenotyp, medan 6 h stenos kan användas om en protrombotiska fenotyp förväntas. Histologisk analys av tromb och omgivande IVC vägg kan också utföras.
Frågan huruvida sida grenar bör vara sammanskrivna eller kvar patent förblir öppen. En grupp har visat att ligering av sidogrenar ökar inte tromb storlek och läge av en side-gren närmare än 1,5 mm till webbplatsen IVC ligering dramatiskt försämrar tromb utveckling25. Stängningen av sidogrenar kan framkalla endoteliala skador i dem och även öka tiden för kirurgi26. I våra händer minskar bristen på sida gren stängning avsevärt trombos prevalens (ned till 10-30% efter 48 h stenos; Brill, opublicerade) och därför vi ligera alla synliga sidogrenar.
Littermate kontroller bör helst användas som möss, även på samma bakgrund men från olika källor, kan ha lite olika trombos prevalens. Om effekten av DVT sig på eventuella parametrar (till exempel, biokemisk) studeras, bör sham manövrerade djur användas. Simulerade manövrerade möss genomgå samma procedur men ligatur runt IVC är stängd löst och lämnade det utan producerar stenos.
Det vanligaste misstaget (ett kritiskt steg) i detta protokoll är ett försök att separera aorta och den IVC inte just i vinkeln mellan fartygen men något lägre, vilket oftast resulterar i blödning. När en massiv blödning inträffar, bra återhämtning av musen blir osannolikt och det rekommenderas att stoppa experimentet och avliva djuret. Normalt, möss återhämta sig väl, flytta inuti buren och väsentligen minskar inte i vikt. Vi rekommenderar möss över 20 g för både män och kvinnor och hålla djur (särskilt hanar) i enskilda burar efter operationen fram till slutet av experimentet att undvika kämpar och skada. Det har rapporterats i en annan (elektrolytisk) modell av DVT att hanmöss producerar större tromboser än honor27. Analys av våra data har inte avslöjat betydande skillnad i trombos prevalens mellan manliga och kvinnliga möss (Brill, opublicerad). Därför uppmuntras forskare att utföra experiment med IVC stenos modell på möss av båda könen.
Unravelling suturer eller häftklamrar kan inte uteslutas framför allt i långa experiment (en vecka och längre). Således, möss bör kontrolleras minst två gånger en dag speciellt för suturen integritet och särskild uppmärksamhet bör ägnas utseendemässigt av blod spår på bur sängkläder.
Det bör noteras att, liksom alla andra djur modellen, stenos av IVC har sina begränsningar när det gäller översättning till människor. Murina IVCs har till exempel inte ventiler, medan mänskliga DVT utvecklar inuti venösa klaffarna. Människor har också spinal vertikalt med muskel pumpen att vara en viktig mekanism accelererande blodflödet i venerna. Däremot har möss spinal horisontell orientering med ingen roll av muskelpump stödja blod tillbaka till hjärtat. Dessa begränsningar bör beaktas när översätta från mus till den mänskliga sjukdomen.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av stiftelsen brittiska hjärtat (PG/13/60/30406) och University of Birmingham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | 8 - 10 weeks old, bothe genders | |
| Scissors | WPI | 15922 | |
| Scissors | WPI | 14003 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| 7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
| 6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
| Cotton buds | Spar | ||
| Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
| Drapes | Kruuse | 141765 | |
| Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
| Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
| Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
| Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
| IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
| Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
| Microscope Olympus SZX10 | Olympus |
References
- Heit, J. A. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), 370-372 (2008).
- Huang, W., Goldberg, R. J., Anderson, F. A., Kiefe, C. I., Spencer, F. A. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: the Worcester VTE study (1985-2009). Am J Med. 127 (9), 829-839 (2014).
- House of Commons Health Care Committee. The Prevention of Venous Thromboembolism in Hospitalised patients. The House of Commons. , (2005).
- Kuipers, S., et al. Travel and venous thrombosis: a systematic review. J Intern Med. 262 (6), 615-634 (2007).
- Lopez, J. A., Chen, J. Pathophysiology of venous thrombosis. Thromb Res. 123, Suppl 4 30-34 (2009).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Payne, H., Ponomaryov, T., Watson, S. P., Brill, A. Mice with a deficiency in CLEC-2 are protected against deep vein thrombosis. Blood. 129 (14), 2013-2020 (2017).
- Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
- Sevitt, S. The structure and growth of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol. 27 (7), 517-528 (1974).
- Witsch, T., et al. A novel hollow and perforated flexible wire allows the safe and effective local application of thrombolytic therapy in a mouse model of deep vein thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 37 (4), 450-454 (2014).
- Shaya, S. A., et al. Comparison of the effect of dabigatran and dalteparin on thrombus stability in a murine model of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 14 (1), 143-152 (2016).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. J Clin Invest. 106 (3), 385-392 (2000).
- Wrobleski, S. K., Farris, D. M., Diaz, J. A., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis. J Vis Exp. (52), (2011).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Siefert, S. A., et al. Enhanced venous thrombus resolution in plasminogen activator inhibitor type-2 deficient mice. J Thromb Haemost. 12 (10), 1706-1716 (2014).
- Schulz, C., Engelmann, B., Massberg, S. Crossroads of coagulation and innate immunity: the case of deep vein thrombosis. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 233-241 (2013).
- Day, S. M., et al. Macrovascular thrombosis is driven by tissue factor derived primarily from the blood vessel wall. Blood. 105 (1), 192-198 (2005).
- Diaz, J. A., et al. Impaired fibrinolytic system in ApoE gene-deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis. J Vasc Surg. 55 (3), 815-822 (2012).
- Zhou, J., May, L., Liao, P., Gross, P. L., Weitz, J. I. Inferior vena cava ligation rapidly induces tissue factor expression and venous thrombosis in rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (6), 863-869 (2009).
- Diaz, J. A., et al. Electrolytic inferior vena cava model (EIM) of venous thrombosis. J Vis Exp. (53), e2737 (2011).
- Diaz, J. A., et al. The electrolytic inferior vena cava model (EIM) to study thrombogenesis and thrombus resolution with continuous blood flow in the mouse. Thromb Haemost. 109 (6), 1158-1169 (2013).
- Brill, A., et al. Extrahepatic high-density lipoprotein receptor SR-BI and apoA-I protect against deep vein thrombosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (8), 1841-1847 (2012).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Geddings, J., et al. Strengths and weaknesses of a new mouse model of thrombosis induced by inferior vena cava stenosis: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 12 (4), 571-573 (2014).
- Alvarado, C. M., et al. Male mice have increased thrombotic potential: sex differences in a mouse model of venous thrombosis. Thromb Res. 127 (5), 478-486 (2011).
