DFS70 自身抗体模拟常见的疾病相关的核抗体模式, 使准确的解释在使用传统的 HEp-2 基板的挑战。该协议描述了新的工程 HEp-2 基底优于传统的 HEp-2 在 ana 筛选和区分 DFS70 模式与高信心 monospecific 和混合 ana 阳性案件。
系统性自身免疫性结缔组织病的特点是循环核抗体 (ANA)。虽然有几种技术可用于 ANA 筛选, 间接免疫荧光 (IIF) 使用人上皮 cells-2 (HEp-2) 基质仍然是主要的和推荐的方法, 因为其优越的灵敏度。HEp-2 基板可以检测到多种模式产生的自身抗体绑定到各种蛋白质和核酸抗原分布在整个细胞核和细胞质的细胞。由于 HEp-2 基底上的正反应, monospecific 和混合模式的多样性也使报告的解释和准确性复杂化。最近受到极大关注的一个具体例子是, 由于自身抗体特异性地结合到一种叫做晶状体上皮细胞衍生生长因子 (LEDGF) 的蛋白而产生的致密精细斑点 70 (DFS70) 模式。缺乏明确的联系与特定的系统性自身免疫疾病和高患病率的健康人口已作出准确的解释 DFS70 模式的重要。使用传统的 HEp-2 基质, 准确区分 DFS70 模式与疾病相关模式具有挑战性。此外, 频繁共生的 DFS70 模式, 以及与疾病相关的模式, 如均匀, 斑点, 混合均匀斑点模式复杂的 IIF 解释。本文的目的是演示一种新颖的 HEp-2 IIF 基板的实用性, 它保留了传统 HEp-2 基板的所有优点, 同时提供了在两种情况下都能很好地区分 DFS70 模式的能力。monospecific 和混合的安娜阳性例子。新的基质更能揭开先前被 DFS70 模式掩盖的疾病相关的 ANA 模式。
阿纳斯是自体免疫介导的系统性结缔组织病的一个标志1。采用几种方法对阿纳斯进行筛选和确认。使用 HEp-2 基板的 IIF 技术仍然是筛选阿纳斯12的最广泛使用和常用的推荐方法。尽管在固相诊断分析方法, 如酶联免疫吸附试验 (ELISA), 酶免疫分析 (EIA), 化学发光免疫分析 (评估), 和 bead-based 多重分析的进展, IIF 的 HEp-2 是最普遍的筛选方法由于其诊断有用性和成本效益1,2,3。above-mentioned 检测技术依赖于一组有限的纯化本机或重组抗原, 而在玻璃滑动井上的 HEp-2 细胞单层制剂呈现出大量抗原的自然形式, 分布在细胞核和细胞质, 与患者血清或阳性对照的自身抗体发生反应, 产生多种与自身免疫条件相关的模式。这些模式分为核、细胞质和有丝分裂模式的基础上的抗原在细胞中的位置。每个模式和相关的抗原/抗原和疾病状态都有很好的特征4。在 IIF 方法中, 患者和控制血清在玻璃滑动井中孵化, 这种 HEp-2 细胞的单层培养适当固定, 以保护其自然构型中的许多抗原。患者血清或阳性对照中的自身抗体可以与基底上 HEp-2 细胞 (玻璃滑动井) 在孵化过程中所呈现的抗原结合。后潜伏期, 未绑定的抗体被冲走, igg 类抗体检测荧光/荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 共轭人 igg 试剂。未绑定报告-共轭被冲走, 玻璃片安装在幻灯片的顶部使用安装介质, 保存的反应和促进观察下的荧光显微镜。在装有合适的激发发射过滤器组合的荧光显微镜下观察反应 (对于 FITC 记者来说, 诊断显微镜通常使用的过滤器与励磁范围为467-498 毫微米和发射范围 513-556 毫微米)。安娜的存在是由一个明亮的绿色荧光的特定结构在细胞中表现出来的。与自动化的测试平台不同, IIF 方法依赖于连续稀释血清的费力过程和需要大量用户专业技能5,6的染色模式的可视化阳性检测。尽管有这些限制, HEp-2 仍然是最广泛使用和推荐的方法来筛选的阿纳斯由于标准化努力, 以模式解释和命名标准的国际共识的全日空模式 (汇联) 委员会,增强了 IIF 幻灯片处理的自动化解决方案的可用性, 以及结果解释3。
在 HEp-2 IIF 方法检测到的众多模式中, 针对psip1基因产品的自身抗体 (也称为 LEDGF/p75/DFS70), 近年来由于几个原因引起了极大的兴趣4,5 ,6,7,8,9,10。DFS70 抗体存在于高滴在健康的控制, 到目前为止的研究没有表现出一个独特的临床协会的存在 DFS70 自身抗体7,8,9 ,10,11,12,13。不同疾病状态和健康人群中 DFS70 抗体阳性结果的报告率差异很大, 研究6,8,9,10,14 ,15,16,171819202122 ,24,25,26,27,28。monospecific DFS70 模式是很好的区别, 从一个同类或斑点模式, 但解释混合均匀斑点图案和 anti-DFS70 抗体 tfbs 与其他阿纳斯是挑战, 甚至对专家读者。当前世代的 IIF 筛选方法和 DFS70 的具体固相检测不能区分 monospecific DFS70 反应从混合模式 (图 1A, 黄色阴影区域的算法)。对 DFS70 模式的误解如均匀、斑点或混合图案, 或反之亦然, 可能会对病人护理产生严重影响. 当前常用的协议如下: 临床实验室对疾病相关的阿纳斯和/或 DFS70/LEDGF 免疫方法进行了大量的固相验证性试验, 怀疑有密集的细斑点 (AC-2) 模式 (图1A)4,5。
该协议的目的是证明一个新的工程 HEp-2 IIF 基板 (HEp-2 ELITE/DFS70 击倒 (KO), 将被称为 HEp-2 精英) 的效用, 保留了传统 HEp-2 的所有优势, 以筛选阿纳斯同时区分 DFS70 模式与高置信度的 monospecific 和混合 ANA 阳性情况 (图 1B, 算法的黄色阴影区域)5。HEp-2 精华基板由未修饰的常规 HEp-2 细胞和无 LEDGF/p75/DFS70 抗原的工程细胞的近似混合物组成, 1:9 比为5。HEp-2 精英的 IIF 程序与传统的 HEp-2 方法相同。HEp-2 精华基板的独特配置不仅保留了常规 HEp2 的所有优点, 而且可以在样品的初始筛选或测试中区分均匀、斑点和混合反应模式 (图1B)5。患者血清在幻灯片上的反应 HEp-2 IIF 基质应稀释1:40 与筛选稀释或根据个别实验室标准。一个特定的反应在1:40 或更高的效价被认为是积极的。
在这项研究中, 阳性血清的均匀, 斑点, 丝, 核仁, 细胞质网状/医学和 DFS70 模式产生了中等阳性信号 (相对于负控制和阳性的 ANA 控制提供的套件) 在筛选稀释1:40 被选择用于模拟 HEp-2 基底 (常规和 HEp-2 精华) 的单特异性和混合型。1:40 稀释 DFS70 阳性血清与1:40 稀释的个别疾病相关的 ANA 模式控制 (均匀, 斑点, 丝, 核仁, 或细胞质网状-医学) 的各种比率 (control:DFS70 在 100:0, 80:20, 50:50,20:80, 和 0:100) 和评估的常规和 HEp-2 精英基板遵循标准 IIF 程序概述如下。
细胞核和细胞质抗原的自身抗体在系统性自身免疫性疾病中非常普遍。虽然没有单一的化验提供最好的灵敏度和特异性, IIF 被广泛认为是一种高度敏感和 cost-effective 的系统性自身免疫疾病的筛选方法2,3,4.尽管 iif 协议的盛行已超过50年, 但 iif 测试的准确性非常依赖于技术人员的技能, 仔细执行协议的各个步骤, 并且使用维护良好的荧光显微镜。系统性自身免疫性疾病的诊断不应基于单一血清学测试的结果, 如 IIF 的 HEp-2。
使用优质水 (蒸馏/去离子), 使用标准化的试剂盒组件 (HEp-2 细胞单分子膜, 样品稀释剂, 正负控制, pre-diluted 优化 FITC 共轭, 安装介质)对结果有积极的影响。在井中跳过添加控件或样本会助长虚假的负面解释。在添加样品或控制后, 在任何点干燥的幻灯片会导致 artifactual 假阳性反应和/或不正确的模式。在安装介质分配前, 滑动或干燥滑动井的洗涤缓冲器过多会导致工件的产生。在放置片之前, 在滑动面上添加足够数量的安装介质或生成气泡会导致在显微镜下观察时出现模糊或对焦不清晰的反应。安装的幻灯片必须存储在 2-8 ° c, 并在建议的时间窗口分析, 以尽量减少假阴性或 artifactual 结果。
使用一个保养良好的 epi 荧光显微镜, 它有适当的 LED/汞/氙光源和清洁的光学元件, 包括未损坏的励磁和发射过滤器, 对于获得准确的 IIF 结果至关重要。最终用户对辨别正/负反应强度和模式解释的培训是至关重要的。HEp-2 IIF 的检测是易受缺乏标准化的程序, 显微镜配置, end-user 训练或技能。在教育目的4中, 以各种制造商获得的一致的命名和代表性的模式和图像的例子, 都是由汇联 () 提供的。HEp-2 细胞模式分类树提供的各种核, 细胞质和有丝分裂模式是一个宝贵的资源, 以了解不同的模式之间的微妙差异, 可能看起来类似于未经训练的眼睛4。一个具有挑战性的模式的主要例子是 DFS70, 也缺乏一个明确的联系与自身免疫状态, 并在前面的章节讨论这种模式是非常普遍的健康人群5。
根据研究, anti-DFS70 自身抗体的患病率在健康人群、ana 筛查群体和无系统性自身免疫疾病证据的 ana 阳性个体之间有差异9,16,20 ,30,31。据报道, DFS70 自身抗体的发生与其他与疾病相关的安娜模式的分离。在 2-22% 的健康对照报告中, 孤立或 monospecific DFS70 模式, 但在不到1% 的情况下与自身免疫性风湿性疾病32。基于这些趋势, 提出了 DFS70 单阳性模式作为排除自身免疫性风湿性疾病的标准, 其方法为:3,31,32。为促进自身抗体测试命名和 HEp-2 IIF 结果的解释的统一而设立的联汇会委员会建议在报告 ANA 筛选结果4时报告 DFS70 阳性。
在排除基于 DFS70 单阳性的系统性自身免疫性疾病之前, 必须对目前的筛查和确认方法 (特别是 DFS70) 的现状进行回顾。DFS70 阳性的协议 HEp-2 IIF 和固相验证性检测, 即 ELISA, 评估, 和线免疫分析/斑点杂交方法) 之间的差异广泛不同的研究13,22,25,33.对这一分歧作出贡献的 IIF 解释和验证性化验参数已经讨论过了5,13,34。最近提出的 anti-DFS70 抗体确认的免疫方法解决了当前固相检测的一些缺陷 (对于 DFS70), 但要求实验室在 IIF 过程中对疑似样本执行额外的步骤, 这增加报告结果13的成本和周转时间。当 HEp-2 ELITE/DFS70 高细胞用于常规的 ANA 筛查时, 不需要额外的步骤。这降低了总体成本, 而且在初始筛选步骤27中可看出 DFS70 模式时, 对周转时间没有影响。使用传统的 HEp-2 IIF 方法的另一个缺点是在筛选阶段无法区分 DFS70 模式 tfbs 与其他 ANA 模式。然而, 这种缺点是克服了使用 HEp-2 ELITE/DFS70 高细胞27。
常规 HEp-2 和新工程 HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) 的比较评价使用 ANA 阳性控制及其与单阳性 DFS70 控制的组合, 证明了新基板的功能同时用于阿纳斯和确认 DFS70 模式的屏幕 (图 1)。新基板的 iif 协议与传统的 HEp-2 iif 方法相同。所有与疾病相关的 ANA 模式的解释方案与 DFS70 模式的例外情况相同 (表 1)。使用新方法时, 对单阳性和混合 DFS70 模式的解释相对比较容易, 而且不需要额外的化验 (图 1B)。这一新方法在临床实验室的实施简化了与 DFS70 模式的解释相关的挑战, 并通过进一步揭示以前隐藏的与疾病相关的 ana 模式, 提高了 ana 筛查的整体准确性。DFS70 (混合模式)。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢安德鲁曾格执行 IIF 实验和收集图像。
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |