DFS70 autoantikroppar härma gemensamma sjukdomsassocierade antinukleära antikroppar mönster att göra korrekta tolkning utmanande när du använder konventionella HEp-2-substrat. Protokollet beskrivs fördelarna med romanen bakåtkompilerade HEp-2 substrat jämfört med konventionella HEp-2 i ANA screening och särskiljande DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva fall.
Systemiska autoimmuna bindvävssjukdomar kännetecknas av cirkulerande antinukleära antikroppar (ANA). Även om det finns flera tekniker för ANA screening, förblir indirekt immunofluorescens (IIF) använder mänskliga epiteliala celler-2 (HEp-2) substrat den primära och rekommenderade metoden på grund av dess överlägsen känslighet. HEp-2 substrat kan upptäcka en mängd mönster som härrör från autoantikropp bindning till olika proteiner och nukleinsyra autoantigener fördelade över kärnan och cytoplasman i celler. Den stora mångfalden av monospecifikt och blandade mönster följd av positiva reaktioner på HEp-2 substrat också komplicera tolkningen och noggrannhet av rapportering. Ett konkret exempel som nyligen fått största uppmärksamhet är täta fina spräckliga 70 (DFS70) mönster som följer av autoantikroppar som specifikt binder till ett protein som kallas linsen epitel härrör tillväxtfaktor (LEDGF). Brist på tydlig association med specifika systemisk autoimmun sjukdom och hög prevalens i friska populationer har gjort korrekt tolkning av DFS70 mönster viktig. Korrekt skillnaden av DFS70 mönster från sjukdomsassocierade mönster med hjälp av konventionella HEp-2 substrat är utmanande. Dessutom ofta samtidig förekomst av DFS70 mönster tillsammans med sjukdomsassocierade mönster som homogen, spräckliga och blandade homogen-spräcklig mönster komplicera IIF tolkningen. Syftet med denna uppsats är att påvisa nyttan av en roman konstruerad HEp-2 IIF substrat som behåller alla fördelar av konventionella HEp-2 substrat samtidigt samtidigt som förmågan att särskilja DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva exempel. Nya substrat är ytterligare kunna avslöja sjukdomsassocierade ANA mönster tidigare dold av DFS70 mönster.
ANAs är kännetecknande för autoimmuna medierad systemisk bindväv sjukdomar1. Flera metoder används för screening och bekräftelse av ANAs. IIF teknik med HEp-2 substratet förblir den mest utbredda och ofta rekommenderad metod för screening ANAs1,2. Trots framsteg i fast fas diagnostiska test metoder såsom enzym länkade immunosorbent assay (ELISA), enzymimmunoanalys (EIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA) och pärla-baserade multiplex analyser är IIF av HEp-2 den vanligaste screeningen metoden på grund av dess diagnostiska nyttan och kostnaden effektivitet1,2,3. Ovannämnda analys teknik är beroende av en begränsad uppsättning renat native eller rekombinant autoantigener HEp-2 celler enskiktslager förberedelserna på glas bild brunnar för närvarande en omfattande mängd autoantigener i sin naturliga form, fördelad över kärnan och cytoplasman, som reagerar med autoantikroppar från patientsera eller positiva kontroller, vilket resulterar i en mängd mönster som är associerade med olika autoimmuna sjukdomar. Dessa mönster är indelade i kärn, cytoplasmiska och mitotiskt mönster baserat på platsen för antigenet i cellerna. Varje mönster och associerade antigen/antigener och sjukdomstillstånd är väl karakteriserade4. I metoden IIF inkuberas patient- och kontrollsera på glas bild brunnar som presenterar en enskiktslager kultur av HEp-2 celler passande fast att bevara en mängd autoantigener i deras naturliga konfiguration. Autoantikroppar i patientsera eller positiva kontroller tillåts att binda till den autoantigener som presenteras av HEp-2 celler på substratet (glasskiva är väl) under inkubation. Efter inkubation, obundna antikroppar är tvättas bort och bundna antikroppar av IgG klass upptäcks med fluorescein/fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugerade anti-humant IgG reagens. Obundna rapporterade-conjugate tvättas bort och glas coverslips är monterade ovanpå bilderna med hjälp av en monteringsmedium som bevarar reaktionerna och underlättar observation under en fluorescerande Mikroskop. Reaktioner observeras under en fluorescens Mikroskop utrustad med lämpliga excitation-utsläpp filter kombination som har konfigurerats enligt reportern används (för FITC reporter, diagnostiska Mikroskop vanligtvis använder filter med excitation utbud av 467 -498 nm och en utsläpp rad 513-556 nm). Förekomsten av ANA framgår av en ljust grön fluorescens av särskilda strukturer i cellerna. Till skillnad från automatiserad analys plattformar bygger IIF metodik på den mödosamma processen med seriell späda sera och visuella positiva fastställandet av färgning mönster som kräver betydande expertis5,6. Trots dessa begränsningar, IIF av HEp-2 förblir den mest använda och rekommenderad metod för screening av ANAs på grund av standardisering ansträngningarna för mönster tolkning och nomenklatur av det internationella samförståndet på ANA mönster (ICAP) kommittén, ökad tillgänglighet av automationslösningar för IIF slide bearbetning och resultatet tolkning3.
Bland många mönster identifieras av metoden HEp-2 IIF, autoantikroppar riktade psip1 genprodukten (också kallad LEDGF/p75/DFS70), vunnit stort intresse under de senaste åren för flera skäl4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoantikroppar förekommer i höga titrar i friska kontroller och studier hittills har misslyckats med att demonstrera en distinkt kliniska sammanslutning för förekomst av DFS70 autoantikroppar7,8,9 ,10,11,12,13. Andelen rapporterade positiva resultat för DFS70 autoantikroppar i olika sjukdomstillstånd och friska kohorter varierat mycket mellan studier6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monospecifikt DFS70 mönstret är väl differentierad från en homogen eller spräckliga mönster men tolkning av blandade homogen-spräcklig mönster och anti-DFS70 antikroppar samarbete förekommer med andra ANAs är utmanande även för expert läsare. Den nuvarande generationen av IIF screening metoder och DFS70 särskilda fast fas analyser klarar inte av att skilja en monospecifikt DFS70 reaktion från blandade mönster (figur 1A, gula skuggade området av algoritmen). Feltolkning av DFS70 mönster som homogen, spräckliga, eller blandade mönster, eller vice versa, kan få allvarliga konsekvenser på patientvård. Det nuvarande vanliga protokollet är följande: de kliniska labs anställer ett antal fasta fasen kontrollprov för sjukdomsassocierade ANAs eller en immunoadsorption metod för DFS70/LEDGF när tät fin spräcklig (AC-2) mönster misstänks (figur 1a)4,5.
Målet med detta protokoll är att påvisa nyttan av en roman konstruerad HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), kommer att kallas till HEp-2 ELITE) som behåller alla fördelar med konventionella HEp-2 för screening ANAs samtidigt särskilja DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva fall (figur 1B, gula skuggade området av algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat består av en ungefärlig blandning av oförändrade konventionella HEp-2 celler och bearbetade celler saknar LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 baserat på5. Förfarandet IIF på HEp-2 ELITE är identisk med den konventionella HEp-2-metoden. Den unika konfigurationen av HEp-2 ELITE substrat inte bara behåller alla fördelar med konventionella HEp2 men kan skilja homogena, spräckliga och blandade reaktionsmönstren från DFS70 mönster på den inledande screeningen eller testning av ett prov (figur 1B )5. Patientsera vara reagerat på bilder med HEp-2 IIF substrat bör vara utspädd 1:40 med screening utspädning eller enligt kriteriet enskilt laboratorium. En specifik reaktion på 1:40 eller högre titer anses positivt.
I denna studie, positiva sera för homogena, spräckliga, centromer, nukleolära, cytoplasmiska retikulära/AMA och DFS70 mönster som producerade en medellång positiv signal (i förhållande till den negativa kontrollen och positiv ANA kontroll som tillhandahålls av satsen) vid screening utspädning av 1:40 valdes för att simulera de mono-specifika och blandade mönster på HEp-2 substrat (konventionella och HEp-2 ELITE). 1:40 utspädda DFS70 positiva sera blandades med 1:40 utspädningar av enskilda sjukdomsassocierade ANA mönster kontroller (homogen, spräckliga, centromer, nukleolära, eller cytoplasmisk retikulära-AMA) i olika proportioner (kontroll: DFS70 i 100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och utvärderas på konventionella och HEp-2 ELITE substrat efter standard IIF förfarande som beskrivs nedan.
Autoantikroppar mot kärnkraft och cytoplasmatiska antigen är mycket utbrett i systemiska autoimmuna sjukdomar. Även om ingen enskild analys ger bästa möjliga känslighet och specificitet, betraktas IIF av HEp-2 allmänt som en mycket känslig och kostnadseffektiv metod för systemiska autoimmuna sjukdomar2,3,4 . Trots förekomsten av IIF protokoll för mer än 50 år är noggrannhet IIF assay starkt beroende av skicklighet av teknikern, försiktig körning av de enskilda stegen i protokollet och korrekt tolkning av resultat med hjälp av en välskött fluorescens Mikroskop. Diagnos av systemisk autoimmun sjukdom bör inte grundas på resultaten av en enda serologiska test såsom IIF av HEp-2.
Beredning av reagens med hög kvalitet vatten (destillerat/avjoniserat), användning av standardiserade Paketkomponenter (diabilder med HEp-2 celler enskiktslager, prov spädningsmedel, positiva och negativa kontroller, pre utspädda optimerad FITC-konjugat och monteringsmedium) ha en positiv inverkan på resultaten. Hoppa över tillsättning av kontroller eller prover på brunnar kan uppmuntra falskt negativa tolkningar. Torkning av bilder när som helst efter tillägg av provet eller kontroll kan resultera i artefaktiska falska positiva reaktioner och/eller felaktig mönster. För mycket tvättbuffert vänster på bild eller torkning av bild wells innan dispens av monteringsmedium kan resultera i artefakter. Lägga till otillräcklig mängd av montering medium eller genererar bubblor på bild ytan innan du placera ett täckglas kan leda till reaktioner som ser suddiga eller ur fokus när observerats under mikroskopet. Monterade diabilder skall förvaras vid 2-8 ° C och analyseras inom fönstret Rekommenderad tid att minimera falska negativa eller artefaktiska resultat.
Med välskötta epi-fluorescerande Mikroskop som inrymmer en lämplig LED/Hg/Xenon ljus källa och rent optiska komponenter inklusive excitation och utsläpp filter som inte är skadade är avgörande för att få korrekta IIF resultat. Slutanvändaren utbildning för diskriminerande positiv/negativ reaktion stödnivåer och tolkning av mönster är kritisk. HEp-2 IIF analyser är känsliga för brist på standardisering i förfaranden, Mikroskop konfiguration, och slutanvändaren utbildning eller skicklighet. Samförstånd nomenklaturen och representant mönster och exempel på bilder som förvärvas med hjälp av olika tillverkare görs tillgängliga genom ICAP () för utbildningsändamål4. Ett HEp-2 celler mönster klassificering träd som tillhandahålls av ICAP för olika nukleära, cytoplasmiska och mitotiskt mönster är en värdefull resurs att lära de subtila skillnaderna mellan olika mönster som kan likna den otränade ögon4. En av de främsta exemplen på ett utmanande mönster är den DFS70 som också saknar en tydlig association med en autoimmun sjukdom, och som diskuterats i tidigare avsnitt detta mönster är mycket utbrett i friska populationer5.
Beroende på studien, förekomsten av anti-DFS70 autoantikroppar variera mellan friska kohorter, ANA screening populationer och ANA positiva individer utan tecken på systemisk autoimmun sjukdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantikroppar har rapporterats förekomma i isolering samt med andra sjukdomsassocierade ANA mönster. Isolerade eller monospecifikt DFS70 mönster rapporteras i 2-22% av friska kontroller men i mindre än 1% av fallen med autoimmun reumatisk sjukdom32. Baserat på dessa trender, föreslogs DFS70 mono-positiva mönster som ett kriterium för att utesluta i autoimmuna reumatiska sjukdomar av ICAP kommittén3,31,32. ICAP kommittén, för att främja harmonisering av autoantikroppar test nomenklaturen och tolkning av resultaten HEp-2 IIF, rekommenderar rapportering DFS70 positivitet när rapportering ANA screening resultat4.
Innan dom ut en systemisk autoimmun sjukdom utifrån DFS70 mono-positivitet, är det viktigt att se över nuvarande metoder för screening och bekräftelse (särskilt de specifikt för DFS70). Avtalet mellan DFS70 positivitet av HEp-2 OOM och fast fas bekräftande analyser nämligen ELISA, CLIA och linje immunoassay/dot blot metoder) varierade kraftigt mellan olika studier13,22,25,33 . IIF tolkning och bekräftande analys parametrar som bidrar till denna oenighet har diskuterats tidigare5,13,34. En nyligen föreslagna immunoadsorption strategi för anti-DFS70 antikropp bekräftelse tar upp några av bristerna i nuvarande fasta fasen analyser (för DFS70) men kräver labben att utföra ytterligare ett steg i IIF förfarande på misstänkta prover, som ökar den kostnad och turnaround tid för rapportering av resultat13. Detta ytterligare steg krävs inte när HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler används för rutin ANA screening. Detta minskar den totala kostnaden och dessutom finns det ingen påverkan på handläggningstid som DFS70 mönster är skönjas i den inledande bedömning steg27. En ytterligare nackdel med att använda konventionell HEp-2 IIF metod är att det är svårt att skilja DFS70 mönster samarbete förekommer med andra ANA mönster vid screening scenen. Denna nackdel är dock att övervinna genom användning av HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.
Jämförande utvärdering av konventionella HEp-2 och den nya konstruerade HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) med ANA positiva kontroller och deras kombinationer med en mono-positiva DFS70 kontroll, påvisa nyttan av nya substratets förmåga att samtidigt skärm för ANAs och bekräfta DFS70 mönster (figur 1). IIF protokollet för den nya substraten är identisk med den konventionella HEp-2 IIF-metoden. Tolkning systemet för alla sjukdomsassocierade ANA mönster är identiska med undantag för DFS70 mönstret (tabell 1). Tolkning av både mono-positiv och blandade DFS70 mönster var relativt lättare med den nya metoden och det garanterar inte ytterligare analyser (figur 1B). Genomförandet av denna nya metod i kliniska lab förenklar den utmaning som är associerad med tolkningen av DFS70 mönster och förbättrar den totala noggrannheten av ANA screening av ytterligare avslöjar sjukdomsassocierade ANA mönster tidigare dold av DFS70 (blandade mönster).
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Andrew Zenger för att utföra de IIF experiment och samla in bilder.
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |