Summary
Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei motoneuroni frenici in topi dopo intrapleural consegna del fluoroforo coniugati beta unità secondaria di colera tossina. Due tecniche vengono confrontati per iniettare la cavità pleurica: transdiaphragmatic versus approcci transtoracico.
Abstract
Frenici motoneuroni sono motoneuroni cervicali provenienti da C3 a C6 livelli in specie di mammiferi più. Proiezioni axonal convergono in nervo frenico che innerva il diaframma respiratorio. A fettine di midollo spinale, frenici motoneuroni non può essere identificati da altri neuroni di motore su criteri morfologici o biochimici. Forniamo la descrizione delle procedure per la visualizzazione di corpi cellulari del neurone di motore frenico in topi, seguente intrapleural iniezioni di colera tossina subunità beta (CTB) coniugata con un fluoroforo. Questo tracciante fluorescente neuroanatomical ha la capacità di essere presi alla giunzione neuromuscolare diaframma, essere retrogradely trasportato lungo gli assoni frenici e raggiungere i corpi cellulari frenici. Vengono confrontati due approcci metodologici di consegna CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica iniezioni. Entrambi gli approcci sono successo e risultare in numero simile di CTB-labeled frenici motoneuroni. In conclusione, queste tecniche possono essere applicate per visualizzare o quantificare i motoneuroni frenici in vari studi sperimentali come quelli focalizzati sulla circuitazione diaframma-frenico.
Introduction
Lo scopo dello studio è quello di presentare un metodo affidabile per identificare frenici motoneuroni (PhMN) su sezioni di midollo spinale di topo. L'iniezione di un tracciante fluorescente neuroanatomical nella cavità pleurica è stato scelto come metodo di consegna per raggiungere le proiezioni neuromuscolare frenica sulla membrana del e utilizzare trasporto retrogrado lungo gli assoni frenici per etichettare frenici corpi cellulari. Vengono descritte due tecniche di consegna intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica.
Frenici motoneuroni sono cellule spinali relè cui assoni convergono in nervi frenici, che in definitiva innervano il diaframma. Si tratta di neuroni motori inferiori beneficiano l'unità inspiratorio i centri respiratori bulbari e l'inoltro alle giunzioni neuro-muscolari del diaframma (NMJ). PhMN sono strutturati in due colonne motore, uno per ogni hemicord, che corre lungo la spina dorsale di metà di-cervicali. Nella maggior parte delle specie di mammiferi compreso gli esseri umani, le colonne motore frenica si è diffusa da livelli C3 C61,2,3. Noi ed altri abbiamo confermato che PhMN concentrata in livelli C3-C5 in ratti e topi del midollo spinale4,5,6,7,8. La distribuzione topografica delle cellule frenica non è a caso; motoneuroni che innervano la parte sternale del diaframma sono distribuiti più densamente nella parte craniale della piscina motore frenica (C3), mentre i motoneuroni che innervano la parte crurale sono più caudale (C5)9. Inoltre, PhMN sono raggruppati variamente nella materia grigia corno ventrale. A livello di C3, i mazzi delle cellule frenico si trovano lateralmente, poi spostare in senso ventrolateral e ventromedially si trovano presso la più caudale di livelli10,11.
Dato il loro ruolo vitale durante l'inspirazione, è della massima importanza per identificare con precisione PhMN nel midollo spinale sano, ma anche seguire il loro destino durante condizioni patologiche, come le malattie degenerative o lesioni traumatiche del midollo spinale. Poiché PhMN non differiscono morfologicamente da altri motoneuroni cervicali, identificazione di PhMN si basa sulla somministrazione mirata di traccianti neuroanatomici sia a livello dei centri respiratori primario8, o presso il diaframma NMJ7 o in il nervo frenico4. Il tracciante è ripreso da fibre nervose e trasportato fino ai corpi cellulari frenici del rachide cervicale, dove possono essere visualizzato utilizzando sistemi di rilevazione diretta o indiretta. Retrograda o anterograda traccianti sono commercialmente disponibili con una vasta gamma di coniugati. Degno di nota, ogni elemento tracciante è dotato di no, bassa o alta capacità per la trans sinaptica traccia.
Nello studio corrente, abbiamo scelto la subunità beta della tossina colerica (CTB) funzionalizzata con Alexa Fluor 555 (d'ora in poi denominato CTB-fluoroforo) come un'etichetta fluorescente, che permette una visualizzazione diretta del PhMN sulle sezioni congelate del midollo spinale. CTB è solitamente descritto come un tracciante monosinaptica, anche se i dati sperimentali tendono a mostrare un transneuronal passaggio12. CTB ha la capacità di legare il ganglioside GM1 alla membrana del plasma della terminazione nervosa. CTB è interiorizzato via clathrin-dipendente o - indipendente meccanismi e traffici attraverso la rete trans-Golgi nel reticolo endoplasmico in un modo retrogrado13,14. L'interiorizzazione e trasporto retrogrado sembrano essere legate il citoscheletro di actina15,16 , nonché sulla rete dei microtubuli17.
Per dimostrare l'utilità di CTB come tracciante retrogrado neuroanatomical diaframma-PhMN circuiti di etichettatura, CTB-fluoroforo è stato consegnato intrapleurally. CTB è stata amministrata usando due tecniche: quella prima comprendeva una laparotomia e iniezioni multiple di transdiaphragmatic; il secondo, meno invasivo, utilizzato un'iniezione unica transtoracica. Quattro giorni più tardi, con etichetta fluorescente PhMNs sono stati quantificati nel midollo spinale cervicale da entrambi da sano e da animali (C4) livello spinale-danneggiati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo sperimentale è stato condotto nel rispetto delle direttive del Consiglio delle Comunità europee per l'esperimento animale (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) ed è stato approvato da animale etica Comitato dell'Università di Namur (etica progetto n ° 17-284 ). Figura 1 raffigura i due rispettivi approcci: transdiaphragmatic o transtoracica iniezioni. Utilizzare i topi C57bl/6J maschii (n = 18), all'età da 3 a 4 mesi nello studio.
1. preparazione della soluzione CTB
- Per le iniezioni di transdiaphragmatic:
- Sciogliere il potere CTB in acqua sterile alla concentrazione di 0,2% (w/v).
- Caricare 7,5 µ l di soluzione CTB (0,2% w/v) in un 10-µ l-microsiringa sterile con un ago attaccato 33-calibro (smusso smussato o breve) per ogni mouse.
- Iniettabile transtoracica:
- Sciogliere il potere CTB in acqua sterile, alla concentrazione dello 0,1% (p/v).
- Carico 20 µ l di soluzione CTB (0,1% p/v) in una siringa sterile 500-µ l-insulina con un ago calibro 27 smussato per ogni mouse.
Nota: Assicurarsi di utilizzare acqua distillata e sterile e correttamente sciogliere la polvere CTB. La soluzione può essere conservata a 4 ° C per un mese (non congelare). Dopo pochi giorni potrebbe formare un precipitato. Portare la soluzione a temperatura ambiente e mescolare bene usando una pipetta prima dell'uso.
2. preparazione prima del Intrapleural iniezioni
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico, utilizzando sterilizzatore autoclave o perle di vetro. Preparare un cappotto di banco pulito per fare un intervento chirurgico e di disporre gli strumenti chirurgici.
Nota: Qualsiasi materiale utilizzato durante la procedura chirurgica deve essere sterile. Strumenti che non possono essere sterilizzati come la microsiringa dovrebbe essere spazzato via giù con un disinfettante (clorexidina) o deve essere esclusivamente monouso. Il chirurgo dovrebbe lavare le sue mani con un disinfettante (clorexidina macchia) prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti sterili, una maschera facciale e un abito pulito. - Pesare l'animale e amministrare una dose adeguata di anestesia: l'iniezione intraperitoneale di anestetico cocktail (ad es. ketamina 100 mg/kg e xilazina 5 mg/kg).
- Pizzicare la punta e/o verifica per la perdita del riflesso palpebrale per determinare se il mouse è adeguatamente anestetizzato. Applicare una pomata di IFP per proteggere la cornea.
- Shave accuratamente la pelle ventrale (per la procedura di transdiaphragmatic) o la destra-parteggiata toracica pelle (per procedura transtoracica), utilizzando il tagliacapelli elettrico. Radersi bene e larghe abbastanza per evitare di entrare nel campo della chirurgia di capelli.
- Garantire condizioni asettiche dall'applicazione topica di soluzione di iodio 10% sulla zona rasata. Strofinare il sito chirurgico con la soluzione di iodio, facendo attenzione a strofinare dal centro del sito verso la periferia.
- Utilizzare un tampone omeotermi in tutta la chirurgia per mantenere la temperatura corporea dell'animale.
3. Intrapleural iniezioni con approccio Transdiaphragmatic
- Fissare il mouse anestetizzato in posizione supina su una piastra elettrica. Posizionare una garza arrotolata sotto il collo dell'animale. Per un topo adulto, è necessario utilizzare un tampone di garza arrotolata di 0,5 pollici di spessore. Questo pad alla scheda di chirurgia per evitare movimenti se qualsiasi del nastro.
- Usando un bisturi, incise la pelle ventrale lungo la linea mediana: fare un'incisione dal processo xifoideo nella regione ombelicale mentre si estende la pelle lateralmente con l'altra mano per rendere la pelle tesa. Non applicare troppa pressione sulla lama per evitare di danneggiare organi sottostanti.
- Utilizzando le forbici piccole, attentamente staccare la pelle da muscoli addominali attorno all'incisione. Questa procedura aiuterà alle cuciture i muscoli e la pelle apart alla fine dell'intervento chirurgico.
- Eseguire la laparotomia utilizzando piccole forbici. Aprire la cavità addominale eseguendo un'incisione di asola al livello dell'ombelico. Incidere i muscoli addominali lungo la linea bianca ("linea alba") fino al processo xifoideo.
- Al fine di visualizzare la superficie addominale del diaframma, retrarre i muscoli addominali utilizzando divaricatori commerciale o fatti in casa.
Nota: Questi divaricatori possono essere fatto da midi-formato clip di carta a forma di in L-gancio19. - Si estendono su entrambi i lati della laparotomia e nastro verso il basso i divaricatori per il cappotto di panca. Ottimizzare l'illuminazione del campo di vista in modo che la superficie addominale del diaframma non è più in penombra. Il più potente dispositivo di illuminazione per questo scopo è una lampada a LED con un fascio di luce orientabile.
- Utilizzando pinzette morbide in una mano, sollevare l'appendice xyphoid e tirare giù i lobi laterali del fegato (Figura 2A). Utilizzando piccole forbici in altra mano, accuratamente tagliata il legamento sospensore, senza danneggiare la colecisti o il diaframma (Figura 2B).
- Utilizzando pinzette morbide in una mano, sollevare l'appendice xyphoid. Afferrare la siringa Hamilton in altra mano. Tre siti di iniezione nel giusto hemidiaphragm a coprire rispettivamente sternale, mediale e le regioni crurale (Figura 3A, inserto in Figura 3B) di destinazione.
- Come lo spessore del diaframma è di circa 0,37 mm in topi7, inserire l'ago non più di 1 o 2 mm oltre il foglio di diaframma per prevenire danni ai polmoni durante la respirazione. Fornire 2,5 µ l di soluzione CTB (0,2% w/v) attraverso il diaframma giusto in ogni sito (Figura 4B). Stabilizzazione del diaframma non è necessaria.
- Ripetere questa procedura per i tre siti ipsilateral dell'iniezione (Figura 1A) e controlaterale per un'etichettatura bilaterale della piscina PhMN.
- Per chiudere il sito di laparotomia, suturare i muscoli addominali con resorbable sutura 4-0. Uso interrotti punti distanziati di 3 mm. pelle fiocco chiuso con clip di 9,0 mm ferita. Serrare staples per impedire che animali tirando fuori staples. Spazio staples distanti circa 5 mm. Non serrare eccessivamente le clip di ferita, come questo può portare a guarigione alterata.
- Pulire micro siringa con acqua distillata per evitare intasamenti. Lentamente, elaborare ed espellere 2 - 3 volte. Non aspirare aria nella siringa.
4. Intrapleural iniezione usando metodo Transthoracic
Nota: Questo metodo è ispirato alla procedura designata in ratti4 ed è stato adattato al mouse.
- Fissare il mouse anestetizzato a sinistra posizione decubitus laterale, su un rilievo di riscaldamento (Figura 4A).
- Identificare le costole di sesta e settima sotto alla piega del gomito tramite la palpazione manuale (Figura 4B).
- Mentre un assistente si estende giusti ribalta - e -arti posteriori (Figura 5A), inserire la siringa cranialmente orientata e tangenzialmente sotto la sesta o settima costola, 3 mm di profondità della pelle, con lo smusso verso il basso (Figura 1B e figura 5B).
- Elevare l'ago delicatamente per confermare, sollevando le costole, che è ben posizionato nella cavità toracica (Figura 5, inserti in Figura 1B).
- Stabilizzare i movimenti del torace di respirazione di esercitando una leggera pressione con due dita sulla parete di cassa.
- Tenendo la siringa in altra mano, consegnare 20 µ l di soluzione CTB (0,1% p/v) in una singola iniezione.
5. post-operatorio
- Immediatamente dopo la procedura, posare il mouse nella posizione decubitus laterale di destra su un pad omeotermi per il recupero. Questo assicura il tracciante per diffondere sul lato destro della cavità pleurica e permette di monitorare la respirazione dell'animale.
- Somministrare per via sottocutanea 1 mL di soluzione salina sterile i.p.. Se l'animale appare disidratata e/o svogliata, fornire iniezioni di follow-up.
- Somministrare per via sottocutanea 0,1 mg/kg della buprenorfina, due volte al giorno durante il primo post-ambulatorio due giorni, per ridurre al minimo qualsiasi potenziale dolore.
Nota: Molte istituzioni consiglierei analgesia multimodale per procedure invasive, come la laparotomia qui raffigurati. Questo potrebbe includere l'uso di un non-steroidei anti-infiammatori (FANS) e/o un agente anestetico locale al sito di incisione. Questi farmaci vengono solitamente consegnati prima della prima incisione per ridurre al minimo dolore Wind-up. - Monitorare gli animali al giorno fino a eutanasia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I topi C57bl/6J maschii (n = 18), età da 3 a 4 mesi sono stati inclusi nello studio. Al giorno 0 dell'esperimento, 8 topi ha subito una contusione C4 unilaterale, destra-parteggiata, secondo protocollo pubblicato7,18. Come procedura sham, 10 topi ha subito un laminectomy sopra C4 senza contusione. Al giorno 3, topi sono stati preparati per le iniezioni di intrapleurica di CTB-fluoroforo secondo le due diverse procedure sopra descritte. Al giorno 7, tutti i topi sono stati eutanasizzati dopo anestesia (ketamina 100 mg/kg e xilazina 5 mg/kg) e dissanguamento.
Tutta midolli spinali sono state raccolte, risolto in paraformaldeide e prelevate in saccarosio 30% secondo le procedure standard di laboratorio. L'ingrandimento cervicale è stato isolato, incorporate nel t.o.c. e cryosectioned disposti longitudinalmente o trasversalmente ad uno spessore di 30 µm.
Sezioni longitudinali spinale sono state osservate con un microscopio epifluorescente equipaggiato con cubo di filtro per l'analisi di fluorescenza (eccitazione: 560/20nm; Emissione: 635/30nm). Motoneuroni fluorescente nel corno ventrale sono stati identificati come una colonna lineare di celle da C3 a C5 livelli (Figura 6A, pannello superiore). Tutte le celle con etichettate sono state situate nella materia grigia ipsilateral e ha esibito la morfologia coerenza con motoneuroni (Figura 6B). In animali feriti, è stata osservata una perdita notevole di PhMN con etichetta a livello di C4, insieme con la rottura del tessuto spinale (asterisco in Figura 6A e C 6). CTB+ PhMNs sono stati contati manualmente ogni quinta sezione trasversale (intervallato da 150 µm) in midolli spinali illesi e C4-danneggiati (Figura 6). Una stima del numero totale di PhMNs con etichetta è stata calcolata moltiplicando il numero di cellule contate di CTB+ per 5. In topi sani illesi, il numero totale di PhMNs con etichetta al hemicord è stato stimato a 151 ± 9 quando si utilizza transdiaphragmatic (TDia) approccio, rispetto ai 178 ± 9 quando si utilizza il metodo transthoracic (TTho) (Figura 6). A seguito di lesioni C4, questi numeri è sceso rispettivamente a 59 ± 14 e 70 ± 10. In questo studio, sono stata evidenziata nessuna differenza statistica tra i due metodi di consegna intrapleural (p > 0.05, test U di Mann-Whitney; TDia contro TTho).
Figura 1. Intrapleural iniezioni utilizzando transdiaphragmatic o iniezioni transtoracica. Transdiaphragmatic approccio include una laparotomia, l'esposizione della superficie addominale del diaframma (in colore rosa) e tre iniezioni nelle regioni sternale, mediale e crurale. Per metodo transthoracic, il mouse è presentato in decubito laterale sinistro. Le costole di sesta e settima sono identificate sotto alla piega del gomito tramite la palpazione manuale B. L'ago viene inserito attraverso la pelle, il tessuto sottocutaneo, i muscoli toracici, i muscoli intercostali e la pleura parietale per raggiungere la cavità pleurica (asterix). S, sternale; m, mediale; c, crurale; S/SC, pelle e tessuto sottocutaneo; TM, muscoli toracici; IC, muscoli intercostali; PP; pleura parietale; L, polmone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Campo operatorio con una vista sul fegato, cistifellea e faccia addominale del diaframma. R. si noti il legamento sospensore tra la cistifellea e il diaframma. B. il legamento è accuratamente tagliato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Vista sul diaframma. Lo sternale (s), mediale (m) e crural zone (c) sono identificati nel giusto hemidiaphragm. R. si noti che la regione crurale è posteriore ai lobi del fegato. B. per iniettare CTB nello spazio pleurico, inserire l'ago in profondità attraverso il giusto hemi-diaframma di 1 mm. L'iniezione nell'area mediale è illustrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Metodo transthoracic. Mouse è posizionato in decubito laterale sinistro A. Identificare il margine costale del diaframma e la regione del gomito. B. I sesto e il settimo spazi intercostali sono identificati profonda per regione del gomito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. I sesto e il settimo spazi intercostali sono identificati profonda per regione del gomito. A. arti anteriori e posteriori sono estesi. B. la siringa è orientata cranialmente e tangenzialmente inserita sotto la sesta o settima costola, 3 mm di profondità attraverso i muscoli intercostali, con la smussatura capovolta. C. l'ago delicatamente è elevata e le costole sono sollevate per confermare l'ago è ben posizionato nella cavità toracica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Cellule CTB+ nella materia grigia corno ventrale dei topi iniettati intrapleurally. R. nel topo di livello spinale illeso, CTB+ frenici motoneuroni distribuire lungo il midollo spinale cervicale da livello C3 a C5. Nel topo contusa, la rottura del tessuto è osservata unilateralmente con perdita di neuroni di motore frenici CTB+ a livello di C4 (asterix). B. con l'etichetta CTB+ cellule erano situate nella materia grigia ipsilateral ed hanno esibito morfologia coerenza con i neuroni di motore. C. sezioni trasversali dei midolli spinali sono stati usati per quantificare il numero delle cellule CTB+ a distanze specifiche lungo il midollo spinale in illeso (sinistra) e feriti (a destra) topi. Cellule di quantificazione di CTB+ D. trovate il hemicord ipsilateral in topi illesi o feriti, secondo il transdiaphragmatic (TDia) o il metodo transthoracic (TTho) di consegna CTB intrapleural. Barre rappresentano 250 µm. i dati sono stati espressi come media ± errore standard della media (SEM). n = 5-7 topi in ogni gruppo di TDia; n = 3 topi in ogni gruppo TTho. Sono stati eseguiti test di Mann-Whitney U non-parametrici e risultati sono stati considerati come significativamente differenti per p < 0.05. p < 0,001 per illeso contro lesioni C4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo descritto nel presente documento può essere applicato a qualsiasi ceppo di topi adulti o a qualsiasi paradigma sperimentale in cui l'integrità della circuiteria diaframma-PhMN dovrebbe essere valutato. Per esempio, sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e lesioni del midollo spinale cervicale (cSCI) sono condizioni associate alla perdita di PhMN, anterograda degenerazione degli assoni frenici e successivo compromesso respiratorio. Modelli animali di ALS o cSCI imitano istopatologico e funzionale respiratorio deficit osservato nelle malattie umane. In questi modelli, tecniche istologiche sono spesso applicate per valutare seguente di sopravvivenza PhMN vari interventi terapeutici volti a PhMN neuroprotection18,20,21. Qualsiasi difficoltà di assorbimento al diaframma NMJ o trasporto assonale sarà senza dubbio compromesso la quantità di CTB accumulato nei corpi delle cellule neuronali. Perdita di assoni frenici o degenerazione PhMN ovviamente diminuirà la quantità di CTB retrotransported nel midollo spinale.
Ogni approccio dell'amministrazione intrapleural ha un proprio Pro e cons. Transdiaphragmatic iniezioni sono piuttosto invasive, rendendo necessaria la laparotomia e impunture attenta di tutti gli strati della pelle per evitare la deiscenza e protrusione dell'organo. La laparotomia interferisce con la normale respirazione22 e uno non può escludere che potrebbe compromettere l'efficienza di attività o retrò-trasporto PhMN. Tuttavia, la visualizzazione diretta del diaframma durante l'iniezione assicura successo targeting dello spazio pleurico per tutto il tempo. Transtoracica iniezioni sono minimamente invasivo rispetto alle iniezioni di transdiaphragmatic e quindi possono essere considerate come una procedura per la raffinatezza, la vena del concetto di "Tre r". Uno svantaggio è la maggiore probabilità di essere fuori bersaglio per un utente inesperto (ad es. nel tessuto sottocutaneo o nella parete toracica).
In seguito a somministrazione di fluorescente-CTB intrapleurica, è probabile che qualsiasi proiezione su muscoli che allineano la cavità pleurica del neurone di motore sarà etichettato, tra cui PhMN, intercostale motoneuroni o diverse popolazioni di neuroni di motore del tronco cerebrale. In ratti adulti, Mantilla et al hanno dimostrato che i neuroni di motore dell'intercostale anche sono stati etichettati nel corno ventrale del midollo spinale toracico, come pure alcuni neuroni del ganglio di radice dorsale4. Mai abbiamo verificato la presenza di cellule con etichetta CTB in altri siti rispetto al midollo spinale cervicale in topi.
A seconda delle impostazioni/modelli sperimentali, misure di risultato possono includere la disposizione colonna di PhMNs lungo il midollo spinale cervicale, analisi dettagliata dei dati geometrici circa la posizione di ogni PhMN o, come descritto qui, la quantificazione dei PhMN numero. La valutazione accurata del numero totale di PhMN dipende da considerazioni tecniche e affidabilità inter-valutatore; a causa della variabilità della CTB intensità di fluorescenza, neurone soma dimensioni o una colorazione di fondo. Nella nostra esperienza utilizzando le iniezioni transdiaphragmatic di CTB-fluoroforo, abbiamo stimato il numero di PhMN per hemicord del mouse in un range tra 120 e 180 cellule, un numero di un po' meno dati da altri gruppi di8. Infatti, ci sono due limitazioni dello studio. In primo luogo, un numero limitato di animali vengono iniettato utilizzando il metodo transthoracic e in secondo luogo, vi è incertezza sull'etichettatura completa di piscina PhMN. Tuffo del nervo frenico (dopo il transection del nervo) o iniezioni intraneural con tracciante fluorescente neuroanatomical sono tecniche complementari che possono essere utilizzate per contrassegnare più accuratamente tutti i PhMNs. Per gli studi futuri, è consigliabile contare PhMNs da metodi imparziali come ansia.
Nella nostra esperienza, non abbiamo mai osservato alcun evidente deficit respiratorio o complicazioni (distress respiratorio) come sanguinamento o pneumotorace seguendo questa procedura. Tuttavia, se il diaframma è stato danneggiato durante le iniezioni di transdiaphragmatic, considerare l'utilizzo di un ago di diametro inferiore o con smusso più nitida.
Per evitare morte animale durante o dopo l'intervento chirurgico controllare attentamente le concentrazioni di ogni componente nell'anestetico cocktail. Evitare lesioni sulle superfici del fegato, l'intestino, la cistifellea o il diaframma.
No o etichettatura basso di PhMN potrebbe essere dovuto a diversi problemi. Se l'iniezione transthoracic non trova la cavità pleurica, ri-fare e controllare tramite la palpazione manuale che l'ago è inserito sotto le costole o non pop fuori attraverso la pelle. Non dovrebbe bolle all'iniezione di soluzione CTB. Ricordate anche che che l'interiorizzazione di CTB nella cellula nervosa è pH-dipendente23: pH acidi e neutrali sono ottimali, mentre pH di base altera l'assorbimento della tossina. È consigliabile per risospendere polvere CTB in acqua, in soluzione fisiologica o in tampone PBS. Considerare il tempo di persistenza della tossina con etichetta nel corpo cellulare neuronale. Nella nostra esperienza, potremmo rilevare cellule CTB-identificato in una finestra di tempo tra quattro giorni e due settimane dopo il parto intrapleural. Diminuendo il tempo allocato per retrogrado trasporto o aumentando il tempo tra consegna intrapleural e sacrificio potrebbe compromettere il rilevamento ottimo di fluorescente-CTB nel tessuto.
Per evitare la fluorescenza di sbiadisc utilizza metodo fissativo adeguato. Suggeriamo che irrora il corpo dell'animale con paraformaldeide al 4% tamponata. Una volta che il midollo spinale è raccolto, incubare il fissativo stesso durante la notte. Cryoprotect il cavo nella soluzione di saccarosio al 30% per 72 ore fino al naufragio, quindi incorporare l'ingrandimento cervicale (circa 8 mm) nel mezzo di o.c.t.. Non disidratare o incorporare il campione in paraffina. Proteggere i campioni spinali o sezioni di tessuto dalla luce durante tutta la post lavorazione. Midolli spinali interi fisse può essere mantenuti a 4 ° C per mesi se il thimerosal è aggiunto alla soluzione crioprotettore (non aggiungere sodio azide come provocherà lo sbiadisc fluorescenza). Sezioni di tessuto possono essere conservate a-20 ° C per mesi lontano dalla luce. Infine, consigliamo di montare i vetrini con un reagente anti-affievolimento. Se la fluorescenza è sbiadito, è ancora possibile rilevare CTB usando immunohistochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Robert Graffin e Pauline Duhant per il loro supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
