Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera phrenic motoriska nervceller hos möss efter intrapleural leverans av fluorophore konjugerat kolera toxin subenhet beta. Två tekniker jämförs för att injicera pleural hålighet: transdiaphragmatic kontra transtorakal metoder.
Abstract
Phrenic motoriska nervceller är livmoderhalscancer motoriska nervceller med ursprung från C3 till C6 nivåer i de flesta däggdjursarter. Axonal prognoser konvergerar i phrenic nerver innervating respiratoriska membranet. I ryggmärgen skivor, kan inte phrenic motoriska nervceller identifieras från andra motoriska nervceller på morfologiska eller biokemiska kriterier. Vi tillhandahåller en beskrivning av förfaranden för att visualisera phrenic motorneuronen cellen organ hos möss, följande intrapleural injektioner av kolera toxin subenhet beta (CTB) konjugerat till en fluorophore. Detta fluorescerande neuroanatomiska tracer har förmågan att fångas upp i mellangärdet neuromuskulära korsningen, retrogradely ryckas phrenic axoner och nå de phrenic cell organ. Två metoder intrapleural CTB leveransdatum jämförs: transdiaphragmatic kontra transtorakal injektioner. Båda metoderna är framgångsrika och resultera i liknande antal CTB-märkt phrenic motoriska nervceller. Sammanfattningsvis, kan dessa tekniker användas för att visualisera eller kvantifiera de phrenic motoriska nervcellerna i olika experimentella studier som de fokuserade på den membran-phrenic kretsen.
Introduction
Syftet med studien är att lägga fram en tillförlitlig metod för att identifiera phrenic motoriska nervceller (PhMN) på mus ryggmärgen sektioner. Injektion av fluorescerande neuroanatomiska spårämne i pleural hålighet valdes som leveransmetod att nå phrenic neuromuskulära prognoserna på membranet och använda retrograd transport längs phrenic axoner för att namnge phrenic cellen organ. Två tekniker intrapleural leveranssätt beskrivs: transdiaphragmatic kontra transtorakal.
Phrenic motoriska nervceller är spinal relä celler vars axoner konvergerar in phrenic nerver, som i slutändan innerverar membranet. Dessa är lägre rörelse neuronerna emot inspiratorisk enheten från bulbar respiratoriska centra och vidarebefordra det till membran neuro-muskulära korsningar (NMJ). PhMN är strukturerade i två motor kolumner, en för varje hemicord, kör längs mitten av-halsryggen. De flesta däggdjur, inklusive människor, sprida phrenic motor kolumnerna från nivåer C3 till C61,2,3. Vi och andra har bekräftat att PhMN koncentreras till C3-C5 nivåer i råtta och mus ryggmärgen4,5,6,7,8. Topografiska fördelningen av phrenic celler är inte slumpmässigt; motoriska nervceller innervating de sternala delen av membranet distribueras mer tätt i den kraniella delen av phrenic motor poolen (C3), medan motor neuron innervating den crural delen är mer kaudalt (C5)9. Dessutom är PhMN grupperade omväxlande i den ventrala horn grå substans. På C3-nivå, kluster av phrenic celler ligga sidled, då de skifta i en ventrolaterala riktning och ventromedially hittas på mest kaudala nivåer10,11.
Med tanke på deras avgörande roll under inspiration, är det av yttersta vikt att korrekt identifiera PhMN i friska ryggmärgen men också följa deras öde under sjukdomstillstånd, till exempel degenerativa sjukdomar eller traumatiska skador i ryggmärgen. Eftersom PhMN inte skiljer sig morfologiskt från andra livmoderhalscancer motoriska nervceller, bygger identifiering av PhMN på riktade leverans av neuroanatomiska spårämnen antingen på nivå i primära respiratoriska centra8, eller på den membran NMJ7 eller den phrenic nerv4. Spårämne är tas av nervfibrer och transporteras upp till phrenic cell organ i halsryggen, där det kan visualiseras med hjälp av direkta eller indirekta detektionssystem. Retrograd eller anterograd spårämnen är kommersiellt tillgängliga med ett brett spektrum av konjugat. Anmärkningsvärd, varje spårämne begåvas med nej, låga eller höga förmågor för trans synaptic spårning.
I den aktuella studien valde vi den beta subuniten av kolera toxinet (CTB) functionalized med Alexa Fluor 555 (hädanefter benämnd CTB-fluorophore) som en fluorescerande etikett, möjliggör en direkt visualisering av PhMN på frysta ryggmärgen sektioner. CTB beskrivas brukar som monosynaptic spårämne även om experimentella data tenderar att visa en transneuronal passage12. CTB har förmågan att binda ganglioside GM1 på plasmamembranet av nervänden. CTB är internaliserad via clathrin-beroende eller -oberoende mekanismer och traffics genom trans-Golgi nätverket i det endoplasmatiska retiklet i en retrograd mode13,14. Internalisering och retrograd transport verkar vara beroende på aktin cytoskelettet15,16 samt på mikrotubulära nätverket17.
För att påvisa nyttan av CTB som retrograd neuroanatomiska spårämne märkning membran-PhMN kretsar, levererades CTB-fluorophore intrapleurally. CTB administrerades med hjälp av två tekniker: ena ingår en laparotomi och flera transdiaphragmatic injektioner; den andra en, mindre invasiva, används en unik transtorakal injektion. Fyra dagar senare, fluorescently-märkt PhMNs kvantifierades i cervikala ryggmärgen från både från friska och spinally-skadade (C4) djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det experimentellt protokollet genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv för djur Experiment (2010/63/EU, 86/609/EEG och 87-848/EEG) och godkändes av den djur etik kommittén universitet av Namur (etik projektet n ° 17-284 ). Figur 1 illustrerar de två respektiva metoderna: transdiaphragmatic eller transtorakal injektioner. Använda C57bl/6J hanmöss (n = 18), åldern från 3 till 4 månader i studien.
1. beredning av CTB lösning
- För transdiaphragmatic injektioner:
- Lös upp CTB kraften i sterilt vatten till koncentrationen av 0,2% (w/v).
- Ladda 7,5 µL CTB lösning (0,2% w/v) i en steril 10-µL-mikrosprutan med en fastsatt 33-gauge nål (trubbiga eller kort avfasning) för varje mus.
- Transtorakal injektionsvätska:
- Lös upp CTB kraften i sterilt vatten i koncentrationen 0,1% (w/v).
- Ladda 20 µL av CTB lösning (0,1% w/v) i en steril spruta 500-µl-insulin med avfasade 27 gauge nål för varje mus.
Obs: Se till att använda destillerat och sterilt vatten och CTB-Pulvret löses upp ordentligt. Lösningen kan förvaras vid 4 ° C för en månad (får ej frysas). En fällning kan bilda efter några dagar. Lösningen till rumstemperatur och blanda väl med en pipett före användning.
2. Förberedelser före Intrapleural injektioner
- Sterilisera kirurgiska verktyg före operation, med hjälp av autoklav eller glaspärla autoklaven. Förbered en ren bänk kappa göra operation och att avyttra de kirurgiska verktyg.
Obs: Alla material som används under det kirurgiska ingreppet bör vara sterila. Instrument som inte kan steriliseras som mikrosprutan torkas med ett desinfektionsmedel (klorhexidin) eller bör endast avsedd för engångsbruk. Kirurgen ska tvätta sina händer med ett desinfektionsmedel (klorhexidin scrub) innan början av operationen. Kirurgen bör bära sterila handskar, en ansiktsmask och en ren klänning. - Väga djur och administrera en lämplig dos av anestesi: intraperitoneal injektion av bedövningsmedel cocktail (e.g. ketamin 100 mg/kg och xylazin 5 mg/kg).
- Nypa tå och/eller kontrollera för förlusten av palpebrala reflex att avgöra om musen är ordentligt bedövas. Applicera en veterinär salva för att skydda hornhinnan.
- Raka försiktigt den ventrala hud (för transdiaphragmatic förfarande) eller högersidig bröstkorg huden (för transtorakal förfarande), med hjälp av elektriska hårklippningsmaskiner. Raka väl och bred nog för att förhindra hår få i fältet operation.
- Säkerställa aseptiska förhållanden genom applicering av 10% jodlösning på den rakade området. Skrubba operationsområdet med jodlösning, vara noga med att skrubba från mitten av webbplatsen mot periferin.
- Använd en homeothermic pad under hela operationen för att underhålla djurets kroppstemperatur.
3. Intrapleural injektioner med Transdiaphragmatic metod
- Fastställa den sövda mus i ryggläge på en värmedyna. Placera en rullade kompress under halsen på djuret. För en vuxen mus, använda en rullade kompress av 0.5 tum i tjocklek. Tejpa här pad till kirurgi styrelsen att undvika rörelse om någon.
- Med hjälp av en skalpell blad, incisionsfilm ventrala huden längs mittlinjen: gör ett snitt från xiphoid process till navelregionen medan stretching huden sidled med andra handen för att göra huden spänd. Applicera inte för mycket tryck på bladet att undvika att skada underliggande organ.
- Med liten sax, lossa försiktigt huden från magmusklerna runt snittet. Detta förfarande kommer att hjälpa vid sömnad musklerna och huden apart i slutet av operationen.
- Utföra laparotomi med liten sax. Öppna bukhålan genom att utföra ett knapphål snitt i nivå med umbilicus. Incisionsfilm magmusklerna längs den vita linjen (”linea alba”) upp till den xiphoid processen.
- För att visualisera buk ytan av membranet, dra magmusklerna använder kommersiella eller hemmagjord upprullningsdon.
Obs: Dessa upprullningsdon kan göras från midi-storlek gem formas till L-krok19. - Sträcka ut båda sidorna av laparotomi och tejpa ner upprullningsdon att bänken pälsen. Optimera belysningen av synfältet så att buken ytan av membranet är inte mer i halvskuggan. Mest kraftfulla belysning enhet för detta ändamål är en LED-lampa med en orientable ljusstrålen.
- Med mjuk pincett i ena handen, lyft upp xyphoid appendix och dra ner den laterala loberna i levern (figur 2A). Använda liten sax i andra handen, skära försiktigt bort den uppskjutande ligamentet, utan att skada gallblåsan eller membranet (figur 2B).
- Med mjuk pincett i ena handen, lyft upp xyphoid appendix. Förstå Hamilton sprutan i andra handen. Inriktas på tre platser i injektion i den högra hemidiaphragm respektive täcka den sternala, mediala och Regionkommittén crural (figur 3A, infällda i figur 3B).
- Som membran tjockleken är omkring 0,37 mm i möss7, infoga den nålen inte mer än 1 eller 2 mm utanför bladet membran att förebygga lung skada under andning. Leverera 2,5 µL CTB lösning (0,2% w/v) genom rätt membranet på varje plats (figur 4B). Stabilisering av membranet krävs inte.
- Upprepa proceduren för tre ipsilaterala platserna för injektion (figur 1A) och contralaterally för en bilaterala märkning av PhMN poolen.
- För att stänga webbplatsen laparotomi, sutur magmusklerna med resorberbara 4-0 sutur. Användning avbrutna maskor fördelade med 3 mm. stapelvara hud sluten med 9,0 mm sår klipp. Dra åt häftklamrar för att hindra djur från att dra bort häftklamrar. Utrymme klammer ca 5 mm mellanrum. Dra inte alltför hårt såret klippen, eftersom detta kan leda till försämrad läkning.
- Rena mikro spruta med destillerat vatten för att förhindra igensättning. Långsamt utarbeta och driva ut 2 - 3 gånger. Inte dra in luft i sprutan.
4. Intrapleural injektion med transtorakal metod
Obs: Denna metod är inspirerad från det förfarande som beskrivs i råttor4 och anpassades till musen.
- Fastställa sövda musen i vänster laterala decubitus position, på en värmedyna (figur 4A).
- Identifiera de sjätte och sjunde revben under armbåge regionen genom manuell palpation (figur 4B).
- Medan en assistent sträcker sig rätt fore - och -bakbenen (figur 5A), infoga sprutan cranially orienterad och tangentiellt under sjätte eller det sjunde revbenet, 3 mm djup från huden, med den fasade kanten ner (figur 1B och figur 5B).
- Höj nålen försiktigt för att bekräfta, genom att lyfta revbenen upp, att det är väl positionerat i brösthålan (figur 5 c, inläggningar i figur 1B).
- Stabilisera andningen rörelser av bröstkorgen genom att applicera lätt tryck med två fingrar på bröstkorgen.
- Medan du håller sprutan i andra handen, leverera 20 µL av CTB lösning (0,1% w/v) i en injektion.
5. postoperativ vård
- Omedelbart efter ingreppet, lägga musen i höger lateral decubitus position på en homeothermic pad för återvinning. Detta säkerställer spårämne att sprida på höger sida av pleural hålighet och möjliggör övervakning djurets andning.
- Administrera 1 mL steril koksaltlösning i.p. subkutant. Tillhandahålla uppföljning injektioner om djuret visas uttorkad eller håglös.
- Administrera subkutant 0,1 mg/kg av buprenorfin, två gånger dagligen under de första två dagar efter operationen, att minimera potentiella smärta.
Obs: Många institutioner skulle rekommendera multimodal analgesi för invasiva ingrepp, såsom den laparotomi som skildras här. Detta skulle kunna omfatta användning av en icke-steroida anti-inflammatoriska (NSAID) läkemedel eller en lokalbedövning agent på webbplatsen snitt. Dessa läkemedel levereras vanligtvis före första snittet att minimera wind-up smärta. - Övervaka djur dagligen upp till dödshjälp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57bl/6J hanmöss (n = 18), i åldern från 3 till 4 månader ingick i studien. På dag 0 i experimentet genomgick 8 möss en ensidig C4 kontusion, högersidig, enligt publicerade protokoll7,18. Som bluff förfarande genomgick 10 möss en laminektomi ovanpå C4 utan kontusion. På dag 3, var möss förberedda för de intrapleural injektionerna av CTB-fluorophore enligt de två olika förfaranden som beskrivs ovan. Dag 7, var alla möss avlivas efter anestesi (ketamin 100 mg/kg och xylazin 5 mg/kg) och exsanguination.
Hela ryggmärgen skördades, fast i PARAFORMALDEHYD och cryoprotected i 30% sackaros enligt standard lab förfaranden. Cervikal utvidgningen isolerades, bäddat in in i O.C.T. och cryosectioned längden eller tvären med en tjocklek på 30 µm.
Spinal längdsnitt observerades med en epifluorescerande Mikroskop som är utrustat med filter kub för fluorescens analys (Excitation: 560/20nm; Utsläpp: 635/30nm). Fluorescerande motoriska nervceller i ventrala horn identifierades som en linjär kolumn med celler från C3 till C5 nivåer (figur 6A, övre panelen). Alla märkta celler var belägna i den ipsilaterala grå substans och uppvisade morfologi överensstämmer med motoriska nervceller (figur 6B). Skadade djur observerades en slående förlust av märkt PhMN på C4 nivå, tillsammans med spinal vävnad störningar (asterisk i figur 6A och 6 C). CTB+ PhMNs räknades manuellt varje femte tvärgående avsnittet (avstånd av 150 µm) i oskadd och C4-skadade ryggmärgen (figur 6 c). En uppskattning av det totala antalet märkta PhMNs beräknades genom att multiplicera antalet räknade CTB+ celler med 5. I oskadd friska möss uppskattades det totala antalet märkta PhMNs per hemicord till 151 ± 9 när du använder transdiaphragmatic (TDia) metod, jämfört med 178 ± 9 när med transtorakal (TTho) metod (figur 6 d). Efter C4 skada sjönk dessa siffror respektive till 59 ± 14 och 70 ± 10. I denna studie var inga statistiska skillnader framgår mellan de två metoderna för intrapleural leverans (p > 0,05, Mann-Whitney U test; TDia kontra TTho).
Figur 1. Intrapleural injektioner med transdiaphragmatic eller transtorakal injektioner. Transdiaphragmatic synsätt inkluderar en laparotomi, exponering av buken ytan av membranet (i rosa färg) och tre injektioner i regionerna sternala, mediala och crural A. Transtorakal strategi, är musen lagd i vänstra laterala decubitus position. Sjätte och sjunde revbenen identifieras under armbåge regionen genom manuell palpation B. Nålen förs in genom huden, subkutan vävnad, bröstkorgens muskler, av intercostalmusklerna och de parietala pleura att nå pleural hålighet (asterix). S, sternala; m, mediala; c, crural; S/SC, hud och subkutan vävnad; TM, bröstkorgens muskler; IC, muskulaturen; PP; parietala pleura; L, lung. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Operationsområdet med utsikt på levern, gallblåsan och buken ansikte av membranet. A. Observera den uppskjutande ligamentet mellan gallblåsan och mellangärdet. B. ligamentet är noggrant avskuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Visa på membranet. Sternala (s), mediala (m) och crural (c) områden identifieras i den högra hemidiaphragm. A. Observera att regionen crural posteriort lever loberna. B. för att injicera CTB i pleura rymden, stick in nålen 1 mm djupa genom rätt hemi-membranet. Injektion i det mediala området är illustrerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Transtorakal strategi. Musen är placerad i vänstra laterala decubitus A. Identifiera den revbens marginalen av membranet och regionen armbåge. B. de sjätte och sjunde interkostal utrymmena identifieras djup till regionen armbåge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. De sjätte och sjunde interkostal utrymmena identifieras djup till regionen armbåge. A. Fore - och bakbenen förlängs. B. sprutan är cranially orienterade och tangentiellt in under sjätte eller det sjunde revbenet, 3 mm djup genom av intercostalmusklerna, med fasning upside-down. C. nålen är försiktigt förhöjd och revbenen lyfts för att bekräfta nålen är väl positionerat i brösthålan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. CTB+ celler i ventrala horn grå frågan om intrapleurally-insprutning möss. A. i spinally-oskadd mus, CTB+ phrenic motoriska nervceller fördela längs den cervikala ryggmärgen från nivå C3 till C5. Contused mus följs vävnad störningar ensidigt med förlust av CTB+ phrenic motoriska nervceller på C4-nivå (asterix). B. märkt CTB+ celler var belägna i den ipsilaterala grå substans och uppvisade morfologi överensstämmer med motoriska nervceller. C. tvärgående delar av ryggmärgen har använts för att kvantifiera antalet CTB+ celler på specifika sträckor längs ryggmärgen i oskadd (vänster) och skadade (höger) möss. D. kvantifiering av CTB+ celler som finns i den ipsilaterala hemicord i oskadd eller skadade möss, enligt transdiaphragmatic (TDia) eller transtorakal (TTho) strategi intrapleural CTB leverans. Barer representera 250 µm. Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). n = 5-7 möss i varje TDia grupp; n = 3 möss i varje TTho grupp. Icke-parametrical Mann-Whitney U test utfördes och resultat ansågs som signifikant för p < 0,05. p < 0.001 för oskadd kontra C4 skada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs häri kan tillämpas till någon stam av vuxna möss eller några experimentella paradigm där integriteten av membran-PhMN kretsen bör utvärderas. Exempelvis är amyotrofisk lateralskleros (ALS) och cervikal ryggmärgsskada (cSCI) villkor som är förknippade med PhMN förlust, anterograd degeneration av phrenic axoner och efterföljande respiratorisk kompromiss. Djurmodeller av ALS eller cSCI härma histopatologiska och funktionella respiratoriska underskott som observerats i mänskliga sjukdomar. I dessa modeller används histologiska tekniker ofta för att utvärdera PhMN överlevnad följande olika terapeutiska interventioner som syftar till PhMN neuroprotektion18,20,21. Några problem upptag på membranen NMJ eller axonal transport kommer utan tvekan att kompromissa mängden CTB ackumuleras i de neuronala cell organ. Förlust av phrenic axoner eller PhMN degeneration kommer uppenbarligen minska mängden CTB retrotransported in i ryggmärgen.
Varje strategi intrapleural administration har sin egen proffs och cons. Transdiaphragmatic injektioner är ganska invasiv, vilket nödvändiggör laparotomi och försiktig sömnad av alla lager av huden för att förhindra sårruptur och orgel utstick. Laparotomi stör normal andning22 och man kan inte utesluta att det kan påverka PhMN aktivitet eller retro-transport effektivitet. Dock säkerställer direkt visualisering av membranet under injektionen framgångsrika inriktning pleural utrymme hela tiden. Transtorakal injektioner är minimalinvasiv jämfört med transdiaphragmatic injektioner och kan således betraktas som ett förfarande för förädling, i samma anda som ”tre Rs-konceptet. En nackdel är den ökade risken för att vara off-target för en oerfaren användare (t.ex. i den subkutana vävnaden eller i bröstkorgen).
Efter intrapleural lysrör-CTB administrering är det troligt att någon motorneuron som projicerar på muskler som kantar Plura kommer märkas, inklusive PhMN, interkostal motoriska nervceller eller olika populationer av hjärnstammen motoriska nervceller. Hos vuxna råttor visat Mantilla et al. att interkostal motoriska nervceller var också märkt i ventrala horn bröstkorg ryggmärgen, liksom vissa dorsalrotsganglier ganglion nervceller4. Vi har aldrig kollat förekomsten av CTB-märkt celler i andra platser än den cervikala ryggmärgen hos möss.
Beroende på de experimentella inställningar/modellerna, resultatåtgärder kan inkludera columnar arrangemanget av PhMNs längs den cervikala ryggmärgen, detaljerad analys av geometriska data om positionen för varje PhMN eller, som beskrivs här, kvantifiering av PhMN nummer. Korrekt utvärdering av totala PhMN beror på tekniska överväganden och mellan utvärderaren tillförlitlighet. på grund av variationer i CTB fluorescensintensiteten, neuron soma storlek eller bakgrundsfärgning. Vår erfarenhet använder transdiaphragmatic injektioner av CTB-fluorophore har vi beräknat antalet PhMN per mus hemicord i ett intervall mellan 120 och 180 celler, ett antal lite mindre än data från andra grupper8. Det finns faktiskt två begränsningar av studien. Först ett begränsat antal djur injiceras med metoden transtorakal och andra finns det en osäkerhet på komplett märkning av PhMN pool. Phrenic nerv dopp (efter nerv transection) eller intraneural injektion med fluorescerande neuroanatomiska tracer är kompletterande tekniker som kan användas för att mer exakt märka alla PhMNs. För framtida studier, är det rekommenderat att räkna PhMNs av opartiska metoder såsom stereology.
Vår erfarenhet har vi aldrig observerat några uppenbara respiratoriska underskott eller komplikationer (andnöd) såsom blödning eller pneumotorax efter proceduren. Dock om membranet har skadats under transdiaphragmatic injektionerna, överväga att använda en nål av mindre diameter eller med skarpare avfasning.
För att undvika djurs död under eller efter operationen noga kontrollera koncentrationerna av varje komponent i bedövningsmedlet cocktail. Undvika skador på ytor av levern, tarmen, gallblåsan eller membranet.
Ingen eller låg märkning av PhMN kan bero på flera problem. Om transtorakal injektionen missar pleural hålighet, åter göra och kontrollera genom manuell palpation att nålen sitter under revbenen eller inte pop ut genom huden. Inga bubblor bör bilda vid injektion av CTB lösning. Kom också ihåg att att internalisering av CTB i cellen nervös är pH-beroende23: sura och neutrala pH är optimala medan grundläggande pH försämrar upptaget av toxinet. Det rekommenderas att resuspendera CTB pulver i vatten, saltlösning eller PBS-bufferten. Överväga persistens tiden av märkt toxinet i neuronala cellkroppen. Vår erfarenhet kan vi upptäcka CTB-märkt celler i ett tidsfönster mellan fyra dagar och två veckor efter intrapleural leverans. Minska tid som tilldelats bakåtsträvande transport eller öka tiden mellan intrapleural leverans och offer kan äventyra optimal detektering av lysrör-CTB i vävnaden.
Undvik att använda fluorescens fading lämplig fixativ metod. Vi föreslår att startas djurets kropp med buffrad 4% PARAFORMALDEHYD. När ryggmärgen är skördat, inkubera i samma fixeringsvätskan över natten. Cryoprotect i sladden i 30% sackaroslösning i 72 timmar tills sjunker, sedan bädda in cervikal utvidgningen (ca 8 mm) i O.C.T. medium. Inte torkar ut eller bädda in provet i paraffin. Skydda spinal prover eller vävnadssnitt från ljus under hela efterbehandling. Fast hela ryggmärgen kan förvaras vid 4 ° C i månader om timerosal läggs till den frysskyddmedel lösningen (Lägg inte natriumazid som det kommer att framkalla fluorescens blekning). Vävnadssnitt kan förvaras vid-20 ° C för månader borta från ljus. Slutligen rekommenderar vi för att montera glasen med en anti-fading reagens. Om fluorescensen har bleknat, är det fortfarande möjligt att upptäcka CTB med immunohistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att Robert Graffin och Pauline Duhant för deras tekniska support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
