Summary
여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.
Abstract
인할지 모터 신경은 자 궁 경부 모터 신경 c 3에서 발생 하는 대부분 포유류 종에서 C6 수준. Axonal 예측 인할지 신경 innervating 호흡기 횡 경 막에 수렴. 척수 조각에서 인할지 모터 뉴런 형태학 또는 생 화 확 적인 기준에 다른 모터 신경에서 확인 될 수 없습니다. 우리 쥐, 콜레라 독 소 단위 베타 (CTB)는 fluorophore를 활용의 다음 intrapleural 주사 인할지 모터 신경 셀 시체를 시각화에 대 한 절차의 설명을 제공 합니다. 이 형광 신경 해부학 추적 횡 경 막 신경 근육 학 교차로에서 잡, 인할지 축 삭을 따라 retrogradely 실시 인할지 셀 시체에 도달 하는 기능이 있다. Intrapleural CTB 배달의 두 방법 론 적 접근 비교: transthoracic 주사 대 transdiaphragmatic. 두 방법 모두 성공 하며 인할지 모터 뉴런 CTB 표시 된의 유사한 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 기술은 시각화 또는 다이어 프 램 인할지 회로에 초점을 맞춘 등 다양 한 실험 연구에서 인할지 모터 뉴런 계량에 적용할 수 있습니다.
Introduction
연구의 목표 마우스 척수 섹션에 인할지 모터 신경 (PhMN)를 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시 하는 것입니다. 흉 막 캐비티에 형광 신경 해부학 추적기의 주입은 횡 경 막에 인할지 신경 근육 학 계획에 도달 하 인할지 축 삭을 따라 역행 전송 인할지 셀 시체를 사용 하 여 전달 방법으로 선정 되었다. Intrapleural 전달의 두 가지 기술을 설명: transthoracic 대 transdiaphragmatic.
인할지 모터 뉴런 누구의 axons 궁극적으로 횡 경 막 자극 인할지 신경으로 수렴 하는 척추 릴레이 셀 있습니다. 이들은 더 낮은 모터 신경 inspiratory 드라이브 안구 호흡기 센터에서 수신 하 고 횡 경 막 신경-근육 접합부 (NMJ) 릴레이. PhMN는 각 hemicord, 중반-자 궁 경부 척추를 따라 실행 한 두 개의 모터 열으로 구성 되어 있습니다. 인간을 포함 한 포유류 종의 대부분, 인할지 모터 열 C61,2,3레벨 c 3에서에서 퍼졌다. 우리와 다른 PhMN 쥐와 쥐 척수4,5,6,,78c 3-c 5 수준에 집중 하는 것을 확인 했습니다. 인할지 셀의 지형 분포 되지 않습니다 무작위로. 모터 뉴런 innervating 횡 경 막의 sternal 부분 crural 부분 innervating 모터 신경은 더 꼬리 (C5)9반면 인할지 모터 풀 (C3)의 두개골 부분에 더 조밀 하 게 배포 됩니다. 또한, PhMN 복 부 경적 회색 문제에 각종으로 클러스터링 됩니다. C3 수준 인할지 셀 클러스터 거짓말 측면, 그때 그들은 ventrolateral 방향에서 이동 하 고 ventromedially는 가장 꼬리 레벨10,11에서 찾을 수 있습니다.
영감 중 그들의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것 건강 한 척수에서 PhMN를 정확 하 게 식별 하지만 또한 퇴행 성 질환 또는 척수의 외상 성 상해 등 병 적인 상태에 있는 동안 그들의 운명에 따라 매우 중요입니다. 때문에 PhMN 차이가 없습니다 형태학 상으로 다른 자 궁 경부 모터 신경에서 PhMN의 주 호흡기 센터8또는 격 막 NMJ7 또는 수준에서 신경 해부학 추적기의 대상된 배달에 의존 인할지 신경4. 추적 프로그램 신경 섬유에 의해 촬영 및 자 궁 경부 척추에 인할지 셀 시체까지 수행 어디에 직접 또는 간접 검출 시스템을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 역행 또는 참가자 추적기 어원이 같은 말의 광범위 한 범위와 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 추적 부여 없이, 주목할 만한, trans 시 냅 스 추적에 대 한 낮은 또는 높은 능력.
현재 연구에서 우리가 선택 했다 콜레라 독 소 (CTB) 알 렉 사 Fluor 555 (이제부터 CTB fluorophore 라고도 함)와 공업화의 beta 소 단위 형광 라벨으로 냉동된 척수 섹션에 PhMN의 직접적인 시각화 수 있도록. CTB는 실험 데이터는 transneuronal 통로12를 표시 하는 경향이 있지만 일반적으로 monosynaptic 추적 프로그램 설명. CTB은 ganglioside GM1 신경 결말의 원형질 막에 바인딩할 수가 있습니다. CTB는 역행 패션13,14에서 바인딩과 그물에 clathrin-또는-독립적인 메커니즘 및 trans Golgi 네트워크를 통해 트래픽을 통해 내 면. 국제화와 역행 전송 microtubule 네트워크17에 뿐만 아니라 말라 골격15,16 에 종속 될 것 같다.
퇴행 성 신경 해부학 추적 프로그램 다이어 프 램 PhMN 회로 라벨로 CTB의 유용성을 입증, CTB fluorophore intrapleurally는 전달 했다. CTB 두 가지 기법을 사용 하 여 관리 했다: 첫 번째 포함는 개복 술과 여러 transdiaphragmatic 주사; 번째, 보다 적게 침략 적, 독특한 transthoracic 주사를 사용합니다. 4 일 후, 붙일 레이블 PhMNs에서 건강에서 그리고 spinally 부상 (C4) 동물에서 경부 척수에 정량 했다.
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Protocol
실험 프로토콜 (2010/63/EU, 86/609/EEC 및 87-848/EEC) 동물 실험에 대 한 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 실시 하 고는 동물 윤리 위원회의 대학의 Namur (윤리 프로젝트 n ° 17-284에 의해 승인 되었다 ). 그림 1 은 2 개의 각각 접근 묘사: transdiaphragmatic 또는 transthoracic 주사. 남성 C57bl/6J 마우스를 사용 하 여 (n = 18), 연구에서 4 개월에서 3 세.
1입니다. CTB 솔루션의 준비
- Transdiaphragmatic 주사:
- 메 마른 물 0.2% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.
- 각 마우스에 대 한 연결 된 33-게이지 바늘 (무딘 또는 짧은 경사) 살 균 10-µ L-microsyringe에서 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 7.5 µ L를 로드 합니다.
- Transthoracic 주입:
- 메 마른 물 0.1% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.
- 각 마우스에 대 한 베벨된 27 게이지 바늘으로 살 균 500 µ l 인슐린 주사기에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L를 로드 합니다.
참고: 소 주 하 고 살 균 수를 사용 하 고 제대로 CTB 분말을 용 해 합니다. 솔루션 4 ° C에서 한 달 동안 보관 하실 수 있습니다 (고정 되지 않습니다). 침전 물은 몇 일 후 양식 수 있습니다. 실내 온도에 해결책을 가져오고 사용 하기 전에 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
2입니다. Intrapleural 주사 전에 준비
- 고압 또는 유리 비드 소독 기를 사용 하 여 수술 전에 수술 도구를 소독. 깨끗 한 벤치 코트 수술 도구를 처리 하 고 수술을 할 준비.
참고: 수술 중에 사용 하는 어떤 물자 든 지 살 균 해야 합니다. 악기는 microsyringe 살 균 제 (액체) 닦 여야 한다 또는 같은 살 균 될 수 없는 단일 사용만. 외과 수술의 시작 전에 살 균 제 (액체 스크럽)와 그녀의 손을 씻어 해야 합니다. 외과 의사는 메 마른 장갑, 안 면, 그리고 깨끗 한 가운 착용 해야 한다. - 마 취의 적절 한 복용량을 관리 하 고 동물, 무게: 칵테일 마 취의 복 주입 (예: 마 취 제 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg).
- 발가락을 꼬집어 하거나 마우스 제대로 마 취 여부를 확인 하 십시오 반사의 손실에 대 한 확인 합니다. 각 막을 보호 하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.
- (Transdiaphragmatic 프로시저)에 대 한 복 부 피부 또는 오른쪽 면 흉부 피부 (transthoracic 절차), 전기 헤어 클리퍼 스를 사용 하 여 신중 하 게 면도. 잘 충분히 넓은 방지 하 고 수술 필드에 지 고 머리를 면도.
- 면도 영역에 10% 요오드 솔루션의 국 소 응용 프로그램에 의해 무 균 상태를 확인 합니다. 주변으로 사이트의 중심에서 스크럽 주의 요오드 솔루션 외과 사이트 스크럽.
- 수술 내내 homeothermic 패드를 사용 하 여 동물의 체온을 유지 하기 위해.
3. Intrapleural 주사 Transdiaphragmatic 접근을 사용 하 여
- 생리대에 부정사 위치에 마 취 마우스 내려 놓. 동물의 목 아래 압 연된 거 즈 패드를 놓습니다. 성인 마우스 두께에서 0.5 인치 연된 거 즈 패드를 사용 합니다. 움직임이 있는 경우를 피하기 위해 수술 보드에이 패드를 테이프.
- 메스 블레이드를 사용 하 여 incise는 중간에 따라 복 부 피부: 피부 긴장 늦추지 수 있도록 다른 한편으로 옆으로 피부를 스트레칭 하는 동안 탯 줄 지역 칼 과정에서 절 개. 내부 장기의 손상을 방지 하려면 블레이드에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.
- 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 피부 절 개 주위 복 부 근육에서 분리 합니다. 이 절차는 근육과 피부 수술의 끝에 떨어져 바느질에 도움이 됩니다.
- 개복 술 작은 위를 사용 하 여 수행 합니다. 수행은 배꼽의 수준에서 buttonhole 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다. 흰색 라인을 따라 복 부 근육을 incise ("교육 알바") 칼 과정까지.
- 횡 경 막의 복 부 표면, 시각화 하기 위해 상업적 또는 수 제 견인 기를 사용 하 여 복 부 근육을 철회.
참고: 이러한 견인 기 L-후크19에 midi 크기 종이 클립에서 만들 수 있습니다. - 개복 술, 그리고 벤치 코트를 브래킷으로 아래로 테이프의 양쪽 모두에 밖으로 스트레칭. 횡 경 막의 복 부 표면은 penumbra에 더 이상 시야의 조명 최적화. 이 목적에 대 한 가장 강력한 조명 장치를 통해 광선으로 LED 램프입니다.
- 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여, xyphoid 부록을 들어올린 풀 간 (그림 2A)의 측면 돌출부 다운. 다른 한편으로는, 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 잘라 매 다 인 대, 쓸 개 또는 횡 경 막 (그림 2B) 손상 없이.
- Xyphoid 부록을 들어올려 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여. 반면에 해밀턴 주사기를 파악. 중간 및 crural 지역 (그림 3A, 그림 3B에서 삽입 된) 각각 sternal, 커버를 오른쪽 hemidiaphragm에 주입의 3 개 사이트를 대상.
- 다이어 프 램 두께 쥐7약 0.37 m m으로, 호흡 시 폐 방지에 다이어 프 램 시트 넘어 바늘 1 개 이상 또는 2 m m를 삽입 합니다. 각 사이트 (그림 4B)에서 오른쪽 격 막 통해 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 2.5 µ L를 제공 합니다. 횡 경 막의 안정화 필요 하지 않습니다.
- 주사 (그림 1A)의 3 동측 사이트 및 contralaterally PhMN 풀의 양자 라벨에 대 한이 절차를 반복 합니다.
- 개복 술 사이트를 닫으려면 resorbable와 복 부 근육을 4-0 봉합 사 봉합. 사용 중단된 바늘 간격으로 3 m m. 주식 피부 상처 9.0 m m 클립 폐쇄. 스테이플 미루어에서 동물을 방지 하기 위해 스테이플 조입니다. 공간에는 약 5 m m 떨어져 스테이플링을 수행합니다. 할 하지 지나치게 조여 상처 클립으로이 장애 치유 이어질 수 있습니다.
- 막힘을 방지 하기 위해 증류수로 깨끗 한 마이크로 주사기. 천천히 그리고 추방 2-3 번. 주사기로 공기를 그릴 하지 않습니다.
4. Intrapleural 주입 Transthoracic 접근을 사용 하 여
참고:이 방법은 쥐4 에 설명 된 절차에서 영감을 하 고 마우스에 적응 했다.
- 마 취 마우스 왼쪽 옆 decubitus 위치가 열 패드 (그림 4A)에 누워.
- 수동 촉진 (그림 4B)에 의해 팔꿈치 영역 아래 여섯 번째와 일곱 번째 갈비뼈를 식별 합니다.
- 조 수 바로 앞-및 뒷 다리-팔 다리 (그림 5A)를 확장 하는 동안 cranially 중심 및 접선 여섯 번째 또는 일곱 번째 갈비뼈, 3 밀리미터 깊은 (그림 1B 및 그림 5B) 경사와 피부에서 주사기를 삽입 합니다.
- 부드럽게 흉 강 (그림 5C, 그림 1B에서인세트)에 잘 위치, 갈비뼈를 올려서 확인 하 바늘을 상승 합니다.
- 가슴 벽에 두 개의 손가락으로 약간의 압력을 적용 하 여 가슴의 움직임을 호흡 안정.
- 다른 손에 주사기를 들고, 하는 동안 단일 주사에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L을 제공 합니다.
5. 수술 치료
- 절차 후 즉시 복구에 대 한 homeothermic 패드에서 바로 옆 decubitus 위치에 마우스를 놓는다. 이 흉 막 구멍의 오른쪽에 확산 추적을 보장 하 고 동물의 호흡을 모니터링을 위한 수 있습니다.
- 살 균 염 분 솔루션 i.p.의 1 mL를 피하 관리 합니다. 동물 나타나면 탈수 또는 무관심 후속 주사를 제공 합니다.
- Buprenorphine의 0.1 mg/kg 피하 관리 처음 이틀 후 수술, 어떤 잠재적인 통증을 최소화 하는 동안 하루에 두 번.
참고: 많은 기관 여기 그려져 개복 술과 같은 침략 적인 절차에 대 한 복합 진통을 권하고 싶습니다. 이 비 스테로이드 항 염증 제 (NSAID) 약 절 개 사이트에 로컬 마 취 에이전트의 사용을 포함할 수 있습니다. 이 약물은 일반적으로 바람 통증을 최소화 하기 위해 첫 번째 절 개 전에 전달 됩니다. - 동물 안락사까지 매일 모니터링 합니다.
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Representative Results
남성 C57bl/6J 마우스 (n = 18), 4 개월에서 3 세 연구에 포함 됐다. 실험의 하루 0, 8 마우스 게시 프로토콜7,18에 따라 일방적인 C4 타 박상을, 오른쪽 면을 받았다. 가짜 프로시저로 10 쥐 박상 없이 C4 위에 laminectomy를 받았다. 3 일에 쥐 위에서 설명한 두 가지 절차에 따라 CTB fluorophore의 intrapleural 주사에 대 한 준비가 되어 있었다. 7 일에 모든 마우스 마 취에 따라 안락사 했다 (마 취 제 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg) 및 exsanguination.
전체 척수 paraformaldehyde 및 표준 실험실 절차에 따라 30% 자당에서 cryoprotected 고정 수확 했다. 자 궁 경부 확대가 했다 고립 된, 포함 된 O.C.T.와 cryosectioned로 경도 또는 종횡 30 µ m 두께.
경도 척추 섹션 형광 분석을 위한 필터 큐브를 갖춘 epifluorescent 현미경으로 관찰 되었다 (여기: 560/20nm; 방출: 635/30nm). 복 부 경적에 형광 모터 뉴런 C5 수준 (그림 6A, 상단 패널)에서 c 3 셀의 선형 열으로 확인 되었다. 모든 레이블이 셀 동측 회색 문제에 고 전시 형태와 모터 뉴런 (그림 6B). 부 상당한 동물, 레이블이 지정 된 PhMN의 눈에 띄는 손실 척추 조직 장애 ( 그림 6A 와 6 C별표) 함께 C4 수준에서 관찰 되었다. CTB+ PhMNs 수동으로 모든 5 가로 섹션 (150 µ m에 의해 간격) 손상 되지 않은 및 C4 부상 척추 코드 (그림 6 c)을 계산 했다. 레이블이 지정 된 PhMNs의 총 수의 추정 계산된 CTB+ 세포의 수 5를 곱하여 계산 됩니다. 손상 되지 않은 건강 한 쥐, transthoracic (TTho) 접근 (그림 6D)를 사용 하 여 때 178 ± 9에 비해 transdiaphragmatic (TDia) 방식을 사용 하는 151 ± 9에서 hemicord 당 레이블된 PhMNs의 총 수 추정 되었다. C4 부상, 다음이 번호 59 ± 14와 70 ± 10 각각 떨어졌다. 이 연구에서 통계적 차이가 intrapleural 배달의 두 가지 방법 사이 입증 했다 (p > 0.05, 맨-휘트니 U 테스트; TTho 대 TDia)입니다.
그림 1입니다. Transdiaphragmatic 또는 transthoracic 주사를 사용 하 여 Intrapleural 주사. Transdiaphragmatic 접근 sternal, 중간 및 crural 지역 A에 개복 술, 복 부는 횡 경 막 (핑크 색상)의 노출 및 3 주사를 포함합니다. Transthoracic 접근 방식, 마우스 왼쪽된 옆 decubitus 위치에 놓여 있다. 여섯 번째와 일곱 번째 갈비뼈 수동 촉진 B팔꿈치 지역에서 식별 됩니다. 바늘 피부, 피하 조직, 흉부 근육, 있는 근육과 흉 막 캐비티 (아스테릭스) 도달 정수 리 늑 막 통해 삽입 됩니다. S, sternal; m, 중간; c, crural; S/SC, 피부 및 피하 조직; TM, 흉부 근육; IC, 늑 근육; pp; 정수 리 늑 막; L, 폐입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 간, 담 낭, 횡 경 막의 복 부 얼굴에 볼 수 있는 수술 필드. A. Note 담 낭, 횡 경 막 사이 매 다 인 대. B. 인 대 신중 하 게 차단 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 횡 경 막에 보기. Sternal (s), 중간 (m) 및 crural (c) 영역 오른쪽 hemidiaphragm에서 식별 됩니다. A. Note crural 지역 간 엽에 후부 이다. B. CTB 흉 막 공간에 삽입, 삽입 바늘 1 m m 오른쪽 hemi-다이어 프 램을 통해 깊은. 중간 영역에 주입은 그림된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Transthoracic 접근. 마우스 왼쪽된 옆 decubitus A에 배치 됩니다. 횡 경 막과 팔꿈치 지역 늑 골 한계를 식별 합니다. B. 여섯 번째 그리고 일곱 번째 있는 공간 깊은 팔꿈치 영역에 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 여섯 번째 그리고 일곱 번째 있는 공간 깊은 팔꿈치 영역에 식별 됩니다. A. 앞과 뒷 다리 사지 확장 됩니다. B. 주사기는 cranially 및 접선 여섯 번째 또는 일곱 번째 갈비뼈, 3mm 경사 거꾸로 있는 근육을 통해 깊은 삽입. C. 바늘은 부드럽게 상승 하 고 갈비뼈는 흉 강에 바늘 위치 잘 확인 하. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. Intrapleurally 주입 쥐의 복 부 경적 회색 문제에 CTB+ 셀. A. spinally 쥐는 마우스에는 자 궁 경부 척수 레벨 c 3에서 c 5에 따라 배포 CTB+ 인할지 모터 신경. Contused 마우스에 조직 장애는 C4 수준 (아스테릭스)+ CTB 인할지 모터 뉴런의 손실 일방적으로 관찰 됩니다. B. 레이블이 CTB+ 세포 동측 회색 문제에 고 전시 형태 모터 뉴런와 일치. C. 척수의 가로 단면 척수 손상 되지 않은 (왼쪽) 및 부상된 (오른쪽) 마우스에 따라 특정 거리에서 CTB+ 세포의 수를 측정 하는 데 사용 했다. D. CTB 정량화+ 셀 transdiaphragmatic (TDia) 또는 intrapleural CTB 배달 transthoracic (TTho) 접근 손상 되지 않은 또는 손상 된 쥐에서 동측 hemicord에서 발견. 바 대표 250 µ m. 데이터 평균 ± 표준 오차 (SEM) 의미의로 표현 되었다. n = 5-7 쥐 각 TDia 그룹; n = 각 TTho 그룹에 3 쥐. 비 parametrical 맨-휘트니 U 테스트를 수행한 그리고 p로 크게 다른 결과 고려 했다 < 0.05. p < 0.001 쥐는 C4 부상 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
성인 쥐의 어떤 긴장 든 지 또는 어떤 실험 패러다임 다이어 프 램 PhMN 회로의 무결성을 평가 해야 되 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 루 경화 증 (ALS) 및 자 궁 경관 척수 상해 (cSCI) PhMN 손실, 인할지 축 삭 및 후속 호흡 타협의 참가자 퇴보와 관련 된 조건들이 있습니다. ALS 또는 cSCI의 동물 모델 histopathological와 기능 호흡 적자 인간의 질병에서 관찰 모방. 이러한 모델에서 조직학 기술 평가 PhMN 생존 다음 PhMN neuroprotection18,20,21을 목표로 하는 다양 한 치료 내정간섭에 자주 적용 됩니다. 다이어 프 램 NMJ에 통풍 관 또는 axonal 전송의 문제는 CTB 신경 셀 시체에서 누적 금액을 타협 의심할 여 지 없이 것입니다. 인할지 축 삭 또는 PhMN 변성의 손실 분명 척수에 CTB retrotransported의 금액을 줄일 것 이다.
Intrapleural 관리의 각 접근 자체 프로 있으며 공업 Transdiaphragmatic 주사는 매우 침략 적, 개복 술 및 dehiscence 및 기관 돌출을 방지 하기 위해 모든 피부 층의 주의 깊은 바느질 필요로 합니다. 정상적인 호흡22 개복 술을 방해 하 고 하나 배제할 수 없다 PhMN 활동 또는 역 전송 효율에 영향을 미칠 수 있습니다 그. 그러나, 주입 하는 동안 횡 경 막의 직접적인 시각화 성공적인 대상으로 흉 막 공간의 모든 시간을 보장 합니다. Transthoracic 주사 transdiaphragmatic 주사에 비해 최소한-침략 적 되 고 따라서 간주 될 수 있습니다 절차 구체화를 위한 "3 Rs" 개념의 맥락에서. 1 개의 결점은의 증가 가능성 (예: 피하 조직 또는 흉 벽) 경험이 사용자에 대 한 대상에서.
Intrapleural 형광 CTB 관리, 다음 그것은 가능성이 그 어떤 모터 신경 근육 흉 막 캐비티 안 대기에 투영 표시 됩니다, PhMN, 있는 모터 뉴런 또는 brainstem 모터 신경의 다른 인구를 포함 하 여. 성인 쥐, Mantilla 그 외 여러분 있는 모터 뉴런 일부 지 루트 신경 절 신경4흉부 척수의 복 부 경적에 또한 표시 했다 시연 했다. 우리가 결코 쥐의 자 궁 경부 척수 보다 다른 사이트에서 CTB 표시 된 셀의 존재를 확인 했습니다.
실험 설정/모델에 따라 결과 측정 자 궁 경부 척수, 각 PhMN의 위치에 대 한 기하학적 데이터의 상세한 분석에 따라 PhMNs의 칼럼 형식 배열에 포함 될 수 있습니다 또는, 설명 여기, PhMN의 정량화 수입니다. PhMN 총계의 정확한 평가 기술 고려 사항 및 간 평가자 신뢰도;에 따라 달라 집니다. 때문에 CTB 형광 강도, 신경 소마 크기 또는 배경 착 색의 다양성. CTB fluorophore의 transdiaphragmatic 주사를 사용 하 여 우리의 경험에서 우리는 예상 120 및 180 셀, 다른 그룹8데이터 보다 조금 덜 수 사이의 범위에 마우스 hemicord 당 PhMN의 수입니다. 사실, 연구의 두 가지 제한이 있습니다. 첫째, 동물의 제한 된 수 transthoracic 접근을 사용 하 여 주입 하 고 두 번째 PhMN 풀의 완전 한 라벨에 불확실 있다. (신경 transection) 후 복 각 인할지 신경 또는 형광 신경 해부학 추적 프로그램으로 intraneural 주사는 모든 PhMNs를 더 정확 하 게 사용할 수 있는 상호 보완적인 기술. 미래 연구에 대 한이 좋습니다 PhMNs 계산 stereology 같은 공평한 방법으로.
우리의 경험에서 우리가 결코 출혈 등이 절차에 따라 매 어떤 명백한 호흡기 적자 또는 합병증 (호흡 곤란)를 관찰 했습니다. 그러나, 격 막 transdiaphragmatic 주사 하는 동안 손상 된 경우 선명 베벨 또는 작은 직경의 바늘을 사용 하십시오.
피하기 위해 동물 죽음 동안 또는 수술 후 신중 하 게 칵테일 마 취에서 각 구성 요소의 농도 확인 합니다. 간, 소장, 쓸 개 또는 횡 경 막의 표면에 부상 하는 피하십시오.
아니 또는 여러 문제로 인해 수 PhMN의 낮은 라벨. 경우 transthoracic 주입 흉 막 캐비티를 그리 워, 다시 및 수동 촉진 하 여 갈비뼈 아래 바늘 삽입 됩니다 확인 하거나 하지 않습니다 피부를 통해 밖으로 팝업. 아니 거품 CTB 솔루션의 주입에 형성 한다. 신경 세포에서 CTB의 국제화는 pH 의존23또한 기억: 산 성 및 중성 pH는 최적의 기본 pH는 독 소의 통풍 관을 손상 하는 동안. CTB 분말 물, 염 분 또는 PBS 버퍼를 resuspend 하는 것이 좋습니다. 신경 세포 체에서 레이블이 지정 된 독 소의 유지 시간을 고려 하십시오. 우리의 경험에서 우리 4 일 및 intrapleural 납품 후 2 주 간의 시간 창에서 CTB 표시 된 셀을 검출할 수 있었다. 전송 역행 하는 할당 된 시간을 감소 또는 조직에서 형광 CTB의 최적의 검출 타협할 수 intrapleural 납품 및 희생 사이 시간.
피하기 위해 형광 페이딩 적절 한 통 메서드를 사용 합니다. 버퍼링 된 4 %paraformaldehyde 동물의 시체를 perfusing 하는 것이 좋습니다. 일단 척수 수확 품 어 같은 정착 액에 하룻밤. Cryoprotect 침 몰까지 72 시간에 대 한 자당 30% 솔루션에 코드는 다음 O.C.T. 매체에 자 궁 경부 확대 (약 8 m m)를 포함 합니다. 탈수 하거나 파라핀에 샘플을 포함 하지 마십시오. 전체 게시물 처리 하는 동안 빛에서 척추 샘플 또는 조직 단면도 보호 한다. 고정된 전체 척수 지켜질 수 있다 4 ° C에서 몇 달 동안 thimerosal cryoprotectant 솔루션에 추가 하는 경우 (추가 하지 않으면 나트륨 아 지 드 그것 형광 페이딩 자극 것입니다). 조직 섹션 멀리 빛 달 동안-20 ° C에서 보관할 수 있습니다. 마지막으로, 우리 안티-페이딩 시 약으로 슬라이드 마운트를 좋습니다. 형광 사라졌고, 경우 CTB immunohistochemistry를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 로버트 Graffin, 폴 Duhant에 감사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
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