Summary
Her beskriver vi en protokoll for å identifisere phrenic motor neurons i mus etter intrapleural levering av fluorophore konjugert kolera gift delenhet beta. To teknikker sammenlignes for å injisere pleural hulrommet: transdiaphragmatic versus transthoracic tilnærminger.
Abstract
Phrenic motor neurons er cervical motor neurons stammer fra C3 C6 nivåer i mest pattedyrarter. Axonal anslag konvergere i phrenic nerver innervating åndedrettsorganene membranen. I ryggmargen skiver, kan ikke phrenic motor neurons identifiseres fra andre motor neurons på morfologiske eller biokjemiske kriterier. Vi gir en beskrivelse av prosedyrer for å visualisere phrenic motor neuron cellen legemer i mus, følgende intrapleural injeksjoner av kolera gift delenhet beta (CTB) konjugert til en fluorophore. Denne fluorescerende nevroanatomi tracer har muligheten til å bli fanget i membran nevromuskulær krysset, utføres retrogradely langs phrenic axons og nå de phrenic cellen legemer. To metodologiske tilnærmingsmåter intrapleural CTB levering sammenlignes: transdiaphragmatic versus transthoracic injeksjoner. Begge tilnærminger er vellykket og tilsvarende antall CTB-merket phrenic motor neurons. Avslutningsvis kan disse teknikkene brukes for å visualisere eller kvantifisere phrenic motor neurons i ulike eksperimentelle studier som de fokusert på membran-phrenic kretsene.
Introduction
Målet med undersøkelsen er å presentere en pålitelig metode for å identifisere phrenic motor neurons (PhMN) på musen ryggmargen deler. Injeksjon av en fluorescerende nevroanatomi tracer i pleural hulrom ble valgt som leveringsmåte å nå de phrenic nevromuskulær anslagene til membranen og bruke retrograd transport langs phrenic axons for å merke phrenic cellen legemer. To teknikker for intrapleural levering er beskrevet: transdiaphragmatic mot transthoracic.
Phrenic motor neurons er spinal relé celler som axons konvergere i phrenic nerver, som til slutt innervate mellomgulvet. Dette er lavere motor neurons mottar Inspiratorisk stasjonen fra bulbar åndedretts sentrene og formidle dem til membran Nevro-muskulære veikryss (NMJ). PhMN er strukturert i to motor kolonner, en for hver hemicord, kjører langs midten av cervikal ryggraden. I de fleste pattedyrarter, inkludert mennesker, spre phrenic motor kolonnene fra nivåer C3 C61,2,3. Vi og andre har bekreftet at PhMN konsentrert i C3-C5 nivåer i rotte og mus ryggmargen4,5,6,7,8. Topografiske distribusjon av phrenic celler er ikke tilfeldig; motor neurons innervating den sternal delen av mellomgulvet distribueres mer tett i skallen del av phrenic motoren bassenget (C3), mens motor neurons innervating delen crural er mer caudal (C5)9. Videre PhMN klynger vekslet i ventral horn grå materie. På C3 nivå, i klynger av phrenic celler ligger lateralt, så de skifte i en ventrolateral retning og finnes ventromedially på mest caudal nivåer10,11.
Gitt deres avgjørende rolle under inspirasjon, er det av største viktighet å nøyaktig identifisere PhMN i sunn ryggmargen, men også følge deres skjebne under pathological betingelser, for eksempel degenerative sykdommer eller traumatisk skader i ryggmargen. Siden PhMN ikke avviker morphologically fra andre cervical motor neurons, identifikasjon av PhMN er avhengig av målrettet levering av nevroanatomi tracers enten på nivået av primære åndedretts sentre8, eller på membran NMJ7 eller i phrenic nerve4. Tracer opptas av nervefibrene og fraktet til phrenic cellen legemer i cervical ryggraden, der det kan visualiseres ved hjelp av direkte eller indirekte oppdagingssystemer. Retrograde eller anterograd tracers er kommersielt tilgjengelig med et bredt spekter av conjugates. Merke, hver tracer er utstyrt med nei, lav eller høy evner for trans synaptic sporing.
I denne studien valgte vi beta delenhet i kolera giften (CTB) functionalized med Alexa Fluor 555 (heretter referert til som CTB-fluorophore) som en fluorescerende etikett, slik at en direkte visualisering av PhMN på frosne ryggmargen deler. CTB er vanligvis beskrevet som en monosynaptic tracer selv om eksperimentelle data har tendens til viser en transneuronal passasjen12. CTB har evnen å binde ganglioside GM1 plasma membranen av nerve slutt. CTB er internalisert via clathrin-avhengige eller -uavhengig mekanismer og trafikker gjennom trans-Golgi nettverket i det endoplasmatiske retikulum i en retrograd mote13,14. Internalisering og retrograd transport synes å være avhengig på utgangen cytoskjelett15,16 og de microtubule nettverk17.
For å demonstrere nytten av CTB som en retrograd nevroanatomi tracer merking membran-PhMN krets, ble CTB-fluorophore levert intrapleurally. CTB ble administrert bruker to teknikker: den første som inkluderte en laparotomy og flere transdiaphragmatic injeksjoner; den andre en, mindre invasiv, brukes en unik transthoracic injeksjon. Fire dager senere, fluorescently-merket PhMNs kvantifisert i cervical ryggmargen fra både fra sunn og spinally skadet (C4) dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentell protokollen ble utført i samsvar med det europeiske fellesskap-direktiver for dyr eksperimentet (2010/63/EU, 86/609/EØF og 87-848/EEC) og ble godkjent av det dyr etikk komiteen av universitetet Namur (etikk prosjekt n ° 17-284 ). Figur 1 viser de to respektive tilnærmingene: transdiaphragmatic eller transthoracic injeksjoner. Bruke mannlige C57bl/6J mus (n = 18), i alderen 3 til 4 måneder i studien.
1. forberedelse CTB løsning
- For transdiaphragmatic injeksjoner:
- Oppløse CTB kraften i sterilt vann til konsentrasjonen av 0,2% (w/v).
- Laste inn 7,5 µL CTB løsning (0,2% w/v) i et sterilt 10-µL-microsyringe med en vedlagt 33-gauge nål (sløv eller kort bevel) for hver musen.
- For transthoracic injeksjon:
- Oppløse CTB kraften i sterilt vann til konsentrasjonen av 0,1% (w/v).
- Laste 20 µL av CTB løsning (0,1% w/v) i sterilt 500-µl-insulin sprøyte med en skrå 27-gauge nål for hver musen.
Merk: Kontroller at du bruker destillert og sterilt vann og riktig oppløse den CTB pulveret. Løsningen kan holdes på 4 ° C for en måned (fryser). En utløse kan danne etter noen dager. Ta løsningen til romtemperatur og bland godt med en pipette før bruk.
2. forberedelse før Intrapleural injeksjoner
- Sterilisere kirurgiske redskaper før kirurgi, bruker autoklav eller glass-perle sterilisere. Forberede en ren benk pels for kirurgi og kast de kirurgiske redskaper.
Merk: Materiale brukt under den kirurgiske prosedyren skal sterilt. Instrumenter som ikke kan steriliseres som microsyringe tørkes med en desinfiserende (chlorhexidine) eller skal bruke én bare. Kirurgen bør vaske hans/hennes hender med en desinfiserende (chlorhexidine kratt) før begynnelsen av operasjonen. Kirurgen bør ha sterilt hansker, en ansiktsmaske og en ren kjole. - Veie dyr og administrere en passende dose anestesi: intraperitoneal injeksjon av bedøvende cocktail (f.eks ketamin 100 mg/kg og xylazine 5 mg/kg).
- Knip tå og/eller kontroller for tap av palpebral reflex til bestemmer Hvis musen er riktig anesthetized. Søke en veterinær salve for å beskytte hornhinnen.
- Barbere nøye ventrale huden (for transdiaphragmatic prosedyre) eller høyre-sidig thorax huden (for transthoracic prosedyre), med elektrisk hårklippere. Barbere godt og bred nok for å unngå å få hår i feltet kirurgi.
- Sikre aseptiske forhold av aktuell anvendelse av 10% joden løsning på barberte området. Skrubbe kirurgiske området med jod løsningen, være forsiktig å skrubbe fra midten av området mot periferien.
- Bruk en homeothermic styreplate gjennom kirurgi for å opprettholde dyrets kroppstemperatur.
3. Intrapleural injeksjoner med Transdiaphragmatic tilnærming
- Legge ned bedøvet musen i supine posisjon på en varmeputen. Plassere en rullet gauze pute under halsen av dyret. For en voksen mus, bruk en rullet gauze pute av 0,5 tomme i tykkelse. Tape denne pad til kirurgi styret unngå bevegelse eventuell.
- Ved hjelp av en skalpell blad, incise ventrale huden langs midtlinjen: gjøre et snitt fra xiphoid prosessen til umbilical regionen mens strekker seg huden sidelengs med andre hånden til å gjøre huden stram. Gjelde ikke for mye press på bladet til å unngå å skade underliggende organer.
- Med liten saks, nøye løsne huden fra magemusklene rundt innsnitt. Denne fremgangsmåten vil hjelpe på søm musklene og huden fra hverandre på slutten av operasjonen.
- Utføre laparotomy med liten saks. Åpne bukhulen ved å utføre en knapphull snitt på nivå med navlen. Incise magemusklene langs hvit ("linea alba") til xiphoid prosessen.
- For å visualisere abdominal overflaten av mellomgulvet, trekke magemusklene bruke kommersielle eller hjemmelaget retractors.
Merk: Disse retractors kan gjøres fra midi-størrelse binders formet i L-krok19. - Strekk ut begge sider av laparotomy og tape ned retractors til benken pelsen. Optimalisere belysning av synsfeltet slik at abdominal overflaten av membranen er ikke lenger inne penumbra. Den kraftigste belysning enheten for dette formålet er en LED-lampe med en ensidige lysstråle.
- Ved hjelp av myk pinsett i den ene hånden, løft opp xyphoid vedlegg og trekke ned lateral lobes av leveren (figur 2A). Bruke liten saks i derimot klipp nøye av suspensory ligament, uten å skade galleblæren eller membranen (figur 2B).
- Ved hjelp av myk pinsett i den ene hånden, løft xyphoid vedlegg. Grip den Hamilton syringe i den andre hånden. Mot tre steder av injeksjon i den høyre hemidiaphragm henholdsvis dekke sternal, medialt og crural regioner (figur 3A, innfelt i figur 3B).
- Membran tykkelsen er rundt 0.37 mm i mus7, sett den nål mer enn 1 eller 2 mm utover membran arket å forhindre lungen skader under puste. Levere 2,5 µL CTB løsning (0,2% w/v) gjennom høyre membranen på hvert område (figur 4B). Stabilisering av membranen er ikke nødvendig.
- Gjenta denne fremgangsmåten for de tre ipsilateral nettstedene av injeksjon (figur 1A), og contralaterally for en bilaterale merking av PhMN.
- For å lukke laparotomy området, Sutur magemusklene med resorbable 4-0 Sutur. Bruk avbrutt masker linjeavstand av 3 mm. stift huden lukket med 9.0 mm sår klipp. Stram staples å forhindre dyr fra trekke av stifter. Plass staples ca 5 mm fra hverandre. Må ikke strammes såret klippene, da dette kan føre til nedsatt helbredelse.
- Ren mikro sprøyte med destillert vann for å hindre tilstopping. Sakte utarbeide og utvise 2 - 3 ganger. Ikke trekke luft i sprøyten.
4. Intrapleural injeksjon med Transthoracic tilnærming
Merk: Denne metoden er inspirert av fremgangsmåten som er beskrevet i rotter4 og tilpasset til musen.
- Legge ned bedøvet musen venstre lateral liggesår posisjon, på en varmeputen (figur 4A).
- Identifisere sjette og sjuende ribben under albuen regionen ved manuell palpasjon (figur 4B).
- Mens assistent utvider høyre forgrunnen - og -bakbeina (figur 5A), Monter sprøyten og cranially orientert og tangentially under sjette eller syvende ribbe, 3 mm dyp fra huden, med skråkant ned (figur 1B og figur 5B).
- Heve nålen forsiktig for å bekrefte, ved å løfte ribbeina, at det er godt posisjonert i bryst hulrom (figur 5C, insets i figur 1B).
- Stabilisere puste bevegelser av brystet ved å bruke lett trykk med to fingre på brystveggen.
- Mens du holder sprøyten i den andre hånden, levere 20 µL av CTB løsning (0,1% w/v) i en enkelt injeksjon.
5. postoperativ pleie
- Umiddelbart etter inngrepet, lå musen høyre lateral liggesår posisjon i en homeothermic pad for utvinning. Dette sikrer tracer å spre på høyre side av pleural hulrommet tillater overvåking dyrets puste.
- Administrere 1 mL av sterilt saltvann IP subcutaneously. Gi oppfølging injeksjoner hvis dyret vises dehydrert og/eller sløv.
- Administrere subcutaneously 0,1 mg/kg av buprenorfin, to ganger om dagen under de første to dager etter operasjonen, minimere noen potensielle smerte.
Merk: Mange institusjoner vil anbefale flere analgesi for invasiv prosedyrer, for eksempel laparotomy avbildet her. Dette kan omfatte bruk av en ikke-steroide antiinflammatoriske (NSAID) medisiner og/eller en lokal bedøvelse agent på webområdet snitt. Disse medikamentene vanligvis leveres før den første snittet til å minimere opptrekkbare smerte. - Overvåke dyr daglig til euthanasia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannlige C57bl/6J mus (n = 18), alderen 3 til 4 måneder ble inkludert i studien. På dag 0 av eksperimentet gjennomgikk 8 mus en ensidig C4 contusion, høyre-sidig, ifølge publiserte protokollen7,18. Som humbug prosedyre gjennomgikk 10 mus en laminectomy på C4 uten contusion. På dag 3 var mus forberedt intrapleural injeksjoner av CTB-fluorophore ifølge de forskjellige fremgangsmåtene som beskrevet ovenfor. På dag 7, alle mus var euthanized etter anestesi (ketamin 100 mg/kg og xylazine 5 mg/kg) og exsanguination.
Hele spinal snorer var høstes, fast i paraformaldehyde og cryoprotected i 30% sukrose i henhold til standard lab prosedyrer. Cervical utvidelse ble isolert, innebygd i O.C.T. og cryosectioned langs eller tverrgående på tykkelse på 30 µm.
Langsgående spinal delene ble observert med en epifluorescent mikroskop utstyrt med filteret kuben for fluorescens analyse (eksitasjon: 560/20nm; Utslipp: 635/30nm). Fluorescerende motor neurons i ventral horn ble identifisert som en lineær kolonne av celler fra C3 til C5 nivåer (figur 6A, øvre panel). Alle merkede celler lå i ipsilateral grå materie og utstilt morfologi samsvar med motor neurons (figur 6B). I skadde dyr, ble slående tap av merket PhMN observert på C4 nivå, sammen med spinal vev avbrudd (stjerne i figur 6A og 6 C). CTB+ PhMNs ble manuelt regnet hver femte tverrstilt delen (linjeavstand av 150 µm) i uskadet og C4-skadet spinal snorer (figur 6C). En vurdering av antall merket PhMNs ble beregnet ved å multiplisere antall telt CTB+ celler med 5. I uskadet sunne mus, ble antall merket PhMNs per hemicord anslått til 151 ± 9 ved transdiaphragmatic (TDia) tilnærming, sammenlignet med 178 ± 9 ved transthoracic (TTho) tilnærming (figur 6D). Etter C4 skade, disse tallene falt henholdsvis til 59 ± 14 og 70 ± 10. I denne studien var ingen statistisk forskjeller dokumentert mellom de to metodene for intrapleural levering (p > 0,05, Mann-Whitney U test; TDia mot TTho).
Figur 1. Intrapleural injeksjoner med transdiaphragmatic eller transthoracic injeksjoner. Transdiaphragmatic tilnærmingen omfatter en laparotomy, eksponering av abdominal overflaten av mellomgulvet (i rosa farge) og tre injeksjoner i regionene sternal, mediale og crural A. Transthoracic tilnærming, er musen lagt i venstre lateral liggesår posisjon. Sjette og sjuende ribbeina er identifisert under albuen regionen av manuell palpasjon B. Nålen er satt inn gjennom huden, subkutant vev, thorax musklene, interkostalrom musklene og parietal pleura nå pleural hulrommet (asterix). S, sternal; m, mediale; c, crural; S/SC, hud og underhud vev; TM, thorax muskler; IC, interkostalrom muskler; PP; parietal pleura; L, lunge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kirurgiske feltet med utsikt over lever, galleblæren og abdominal ansiktet av mellomgulvet. A. Merk suspensory ligament mellom gallbladder og membran. B. ligament er nøye avskåret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utsikt over membranen. Sternal (s), mediale (m) og crural (c) områder identifiseres i den høyre hemidiaphragm. A. Merk at regionen crural bakenfor leveren lobes. B. for å injisere CTB i pleural plass, setter du inn nålen 1 mm dyp gjennom høyre hemi-membranen. Injeksjon i mediale området er illustrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Transthoracic tilnærming. Musen er plassert i venstre lateral liggesår A. Identifisere kyst margin membranen og albue-regionen. B. de sjette og sjuende interkostalrom områdene identifiseres dypt til albuen regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. De sjette og sjuende interkostalrom områdene identifiseres dypt til albuen regionen. A. forgrunnen - og bakbeina er utvidet. B. sprøyten er cranially orientert og tangentially inn under sjette eller syvende ribbe, 3 mm dyp gjennom interkostalrom muskler, med skråkant opp-ned. C. nålen er forsiktig opphøyet og ribbeina løftes for å bekrefte nålen er godt posisjonert i bryst hulrom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. CTB+ celler i ventral horn grå materie intrapleurally-injisert mus. A. spinally uskadet musen, CTB+ phrenic motor neurons distribuere langs cervical ryggmarg fra nivå C3 til C5. Contused musen, er vev avbrudd observert ensidig med tap av CTB+ phrenic motor neurons på C4 nivå (asterix). B. merket CTB+ celler lå i ipsilateral grå materie og utstilt morfologi samsvar med motor neurons. C. tverrgående deler av spinal snorer ble brukt om å kvantifisere antall CTB+ celler for spesifikk avstander langs ryggmargen uskadet (venstre) og skadet (høyre) mus. D. kvantifisering av CTB+ celler i den ipsilateral hemicord i uskadet eller skadet mus, i henhold til transdiaphragmatic (TDia) eller transthoracic (TTho) tilnærming intrapleural CTB levering. Barer representerer 250 µm. Data ble uttrykt som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM). n = 5-7 mus i hver TDia gruppe; n = 3 mus i hver TTho gruppe. Non-parametrical Mann-Whitney U tester ble utført og resultater ble vurdert som svært forskjellig p < 0,05. p < 0.001 uskadet versus C4 skade. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan brukes å belastning av voksen mus eller noen eksperimentelle paradigme der integriteten av membran-PhMN kretsene bør vurderes. For eksempel, er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og cervical ryggmargsskade (cSCI) betingelser knyttet PhMN tap, anterograd degenerasjon av phrenic axons og påfølgende åndedretts kompromiss. Dyremodeller ALS eller cSCI etterligner histopathological og funksjonelle åndedretts underskudd i menneskelige sykdommer. I disse modellene, er histologiske teknikker ofte brukt for å evaluere PhMN overlevelse etter ulike terapeutiske tiltak med sikte på PhMN neuroprotection18,20,21. Noen problemer med opptak på membran NMJ eller axonal transport vil utvilsomt kompromiss mengden CTB akkumulert i neuronal cellen legemer. Phrenic axons eller PhMN degenerering åpenbart reduserer mengden CTB retrotransported i ryggmargen.
Begge fremgangsmåtene for intrapleural administrasjon har sine egne fordeler cons. Transdiaphragmatic injeksjoner er ganske invasiv, nødvendiggjør laparotomy og forsiktig sømmer for alle hud lag å hindre dehiscence og orgel protrusion. Laparotomy forstyrrer vanlig åndedrett22 og en kan ikke utelukke at det kan påvirke PhMN aktivitet eller retro-transport effektivitet. Imidlertid sikrer direkte visualisering av mellomgulvet under injeksjon vellykket målretting av pleural plass hele tiden. Transthoracic injeksjoner er minimal-invasiv sammenlignet transdiaphragmatic injeksjoner og kan dermed betraktes som en prosedyre for foredling, i fotsporene til "Tre Rs" konseptet. En ulempe er økt sannsynlighet for å være off-målet for en uerfaren bruker (f.eks i subkutant vev eller i brystveggen).
Etter intrapleural fluorescerende-CTB administrasjon er det sannsynlig at noen motoriske nervecellen projisere på musklene fôr pleural hulrommet merket, inkludert PhMN, interkostalrom motor neurons eller forskjellige populasjoner av hjernestammen motor neurons. I voksen rotter vist Mantilla et al. at interkostalrom motor neurons ble også merket i ventral horn av thorax ryggmargen, samt noen dorsal root ganglion neurons4. Vi har aldri sjekket tilstedeværelsen av CTB-merket cellene i andre områder enn cervical ryggmargen i mus.
Avhengig av eksperimentelle innstillinger/modeller utfallsmål kan inkludere kolonne ordningen med PhMNs langs cervical ryggmargen, detaljert analyse av geometriske data om plasseringen av hver PhMN, eller som beskrevet her, kvantifisering av PhMN nummer. Nøyaktig evaluering av PhMN totalt avhengig av tekniske betraktninger og inter evaluator pålitelighet; på grunn av variasjon av CTB fluorescens intensitet, Nevron soma størrelse eller bakgrunn flekker. Vår erfaring med transdiaphragmatic injeksjoner av CTB-fluorophore, har vi anslått antall PhMN per musen hemicord mellom 120 og 180 celler, litt mindre enn data fra andre grupper8flere. Det er faktisk to begrensninger av studien. Først et begrenset antall dyr er injisert ved hjelp av transthoracic tilnærming og andre det er en usikkerhet på komplett merking av PhMN. Phrenic nerve dukkert (etter nerve transection) eller intraneural injeksjoner med fluorescerende nevroanatomi tracer er komplementære teknikker som kan brukes til å mer nøyaktig merke alle PhMNs. For fremtidige studier anbefales det å telle PhMNs av upartiske metoder som stereology.
I vår erfaring, har vi aldri observert noen åpenbare åndedretts underskudd eller komplikasjoner (luftveissykdom) som blødning eller pneumotoraks denne fremgangsmåten. Men hvis membranen er blitt skadet under transdiaphragmatic injeksjoner, vurdere å bruke en nål i mindre diameter eller med skarpere skråkant.
For å unngå dyr død under eller etter operasjonen nøye sjekke konsentrasjonen av hver komponent i anesthetic cocktail. Unngå å gjøre skader på overflater av leveren, tarmen, galleblæren eller mellomgulvet.
Ikke eller lav merking av PhMN det kan være flere problemer. Hvis transthoracic injeksjon savner pleural hulrom, på nytt og kontroller ved manuell palpasjon at nålen settes under ribbeina eller ikke pop ut gjennom huden. Noen bobler bør form på injeksjon av CTB løsning. Husk også at at internalization CTB i nervøs cellen er pH-avhengig23: syreholdig og nøytralt pH er optimale mens grunnleggende pH svekker opptaket av giften. Det anbefales å resuspend CTB pulver i vann, saltvann eller PBS buffer. Vurdere utholdenhet tid merket giften i neuronal celle kroppen. I vår erfaring, kan vi finne CTB-merket celler i et tidsvindu mellom fire dager og to uker etter intrapleural levering. Redusering av tiden tildeles retrograd transport eller økende tiden mellom intrapleural levering og offer kan kompromittere optimal påvisning av fluorescerende-CTB i vevet.
For å unngå bruk fluorescens falming skikkelig etappe, den stabiliserende metoden. Vi foreslår at perfusing dyr kroppen med bufret 4% paraformaldehyde. Når ryggmargen er høstet, ruge i den samme bindemiddel over natten. Cryoprotect ledningen i sukrose 30% løsning for 72 timer før synker, deretter legge cervical utvidelsen (ca 8 mm) i O.C.T. medium. Ikke tørke eller bygge inn prøven i parafin. Beskytt spinal prøver eller vev deler fra lys under hele etter behandlingen. Fast hele spinal snorer kan holdes på 4 ° C for måneder hvis thimerosal legges til kryoprotektant løsning (ikke Legg Natriumazid som det vil provosere fluorescens falming). Vev inndelinger kan oppbevares på 20 ° C for måneder unna lys. Til slutt anbefaler vi for å montere lysbildene med en anti-filtrert reagens. Hvis fluorescensen har falmet, er det fortsatt mulig å oppdage CTB bruker immunohistochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Robert Graffin og Pauline Duhant deres kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
