Vi beskriver en metode til at syntetisere biokompatible 10-nm guld nanopartikler, functionalized af belægning poly-ethylen glycol på overfladen. Disse partikler kan være brugt i in vitro og i vivo til at levere therapeutics til nanoskala cellulære og ekstracellulære rum der er vanskelige at adgang med konventionelle nanopartikel størrelser.
Guld nanopartikler (AuNPs) har været brugt i udstrakt grad i medicinske forskning på grund af deres størrelse, biokompatibilitet og modificerbare overflade. Specifikke målretning og drug delivery er nogle af anvendelserne af disse AuNPs, men endotel ekstracellulære matricer defensive egenskaber hæmmer partikel optagelse. For at løse dette problem, beskriver vi enmetode syntesen for ultrasmå guld nanopartikler til at forbedre vaskulær levering, med tilpasselig funktionelle grupper og polymer længder for yderligere justeringer. Protokollen udbytter 2,5 nm AuNPs, der er et loft med tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chlorid (THPC). Udskiftning af THPC med hetero-funktionelle polyethylenglycol (PEG) på overfladen af AuNP øger den hydrodynamiske radius til 10.5 nm samtidig forskellige funktionelle grupper på overfladen. Den sidste del af protokollen omfatter en valgfri tilføjelse af en fluorophore at give AuNPs til visualiseres under fluorescens at spore nanopartikel optagelse. Dialyse og ingot blev brugt til at rense og isolere AuNPs. Disse fluorescerende nanopartikler kan visualiseres i både in vitro og i vivo forsøg på grund af den biokompatible PIND belægning og fluorescerende sonder. Derudover størrelsesområde af disse nanopartikler gengive dem en ideel kandidat til sondering af glycocalyx uden at forstyrre normale Vaskulaturen funktion, hvilket kan føre til forbedret levering og therapeutics.
Nanopartikler har været anvendt til medicinafgivelse og billedbehandling for sin evne til at navigere gennem kroppen til at nå målet områder af interesse1,2. Partiklerne kan ophobes i tumorer via utætte Vaskulaturen eller lokalisere hvor en target ligand er overexpressed og udsat. Guld, specielt, er blevet et almindeligt anvendte nanopartikel materiale på grund af sin unikke kemiske og fysiske egenskaber, der påvirker transport og frigivelse af therapeutics3. Guld er en effektiv nanopartikel materiale, fordi dens overflade kan ændres til at binde til dithioler og har høj biokompatibilitet på grund af sin lav toksicitet4. AuNPs kan være bærere af store Biomolekylær narkotika og har haft succes i at levere peptider, nukleinsyrer og proteiner, så AuNPs at være gunstig for målretning2,4.
Desværre er nanopartikel drug delivery effektivitet blevet hæmmet af de negativt ladede glycocalyx, som er den ekstracellulære frakke på membranen af mest pattedyrceller og pore størrelser på op til 7 nm5,6. Denne porestørrelse er mindre end de fleste nanopartikel drug luftfartsselskaber, som har typiske diametre spænder fra 50-200 nm. Under sygdomstilstande blive disse glycocalyx porer større på grund af nedbrydning, øget permeabilitet gennem i endothelial celler. De fleste nanopartikler er dog stadig for store til at drage fordel af denne strukturelle ændring i glycocalyx. En konsekvens af denne uoverensstemmelse i størrelse er, at konventionelt mellemstore partikler ikke interagerer positivt med endothelceller denne linje blodkar. Dette påvirker levering af intravenøst administreret partikler i endotelet, og kan også siges om partikel transport gennem den blod hjerne barrieren7,8,9,10.
En metode til at bekæmpe dette problem er at udnytte mindre partikler til at passere gennem de små porer i glycocalyx. Her, syntetisere vi en 10,5 nm ultrasmå guld nanopartikel, som normalt bør være afskrækket af intakt, sunde glycocalyx. Når glycocalyx begynder at blive forringet, nanopartikel bør let trænge ind celler gennem stigende porestørrelse. Protokollen i dette papir beskriver en syntese af ultrasmå guld kerne beklædt med PIND, som øger biokompatibilitet og reducerer systemiske clearance4. STANGEN kan også indeholde flere typer af funktionelle grupper, åbner muligheder for konjugation af målretning ligander, fluorophores og therapeutics. Tidligere viser offentliggjorte resultater, at disse ultrasmå nanopartikler tendens til at blive taget mere positivt i regioner af forstyrret endotel glycocalyx funktion selv uden nogen aktiv målretning4,11. Dette angiver muligheden og vigtigheden af at udnytte partikler af korrekt størrelse for levering programmer. Følgende protokol præsenterer syntesen, oprensning og karakterisering af den PIND-coated AuNPs (PEG-AuNP), med diskussionen af skræddersy funktionelle grupper og bøjninger for andre programmer.
Denne teknik er en effektiv metode til syntese tilpasselig, ultrasmå PIND belagt AuNPs. En vigtig del af denne procedure er den første dannelse af THPC udjævnede guld nanopartikler, som kan bekræftes ved farveskift fra gul til brun der vil forekomme efter HAuCl4 er blevet tilføjet til indholdet i rund bund kolbe (protokol trin 2.3). Ingen farveændring angiver at der ingen nanopartikler dannet, og at de første skridt bør kontrolleres og gentaget, før du fortsætter. I tilfældet farven ændres til noget andet end brown såsom vin rød eller grå, de resulterende partikler vil sandsynligvis ikke være omkring mål 2,5 nm og et nyt parti skal gøres så godt.
Efter dannelsen af den guld kerne, udveksling af THPC for PIND og rensning procedurer indeholder flere vigtige skridt for en vellykket gennemførelse af protokollen. Blande natten giver mulighed for udskiftning reaktion til at gå til færdiggørelse. Mislykkede rensning kunne opstå, hvis vandets dialyse ikke er ændret med de foreskrevne frekvenser. Sammenlægning og udfældning af partikler kan også opstå, hvis partiklerne er tilbage i dialyse i mere end 72 timer. Andre potentielle problemer kunne konstateres under fryse tørring. Hvis de ultrasmå PIND belagt AuNP løsningen ikke var helt frosset eller hvis lyophilizer ikke blev oprettet korrekt, kan prøver gå tabt. Se i brugervejledningen til den lyophilizer, som nogle udstyr kan kræve forskellige prøve præparater.
Lethed af syntese og biokompatibilitet af de resulterende partikler repræsenterer fordele for at bruge disse PEG-AuNPs. Derudover har disse nanopartikler fordelen at være i stand til at interagere med nanoskala cellulære strukturer, som det fremgår af evnen til at identificere forringet glycocalyx ved optagelsen af disse nanopartikler. Denne fordel kan udnyttes til udvikling af nye åreforkalkning behandlingsformer og forebyggende foranstaltninger. Ud over hvad vi præsenterer her, en anden fordel ved denne protokol er at det giver mulighed for omfattende tilpasning af partikler samt øget stabilitet og opbevaring kapaciteter ved at knytte thiol indeholdende PIND på guld nanopartikler4. Anden enden af PIND kæden kan indeholde enhver funktionel gruppe, og et utal af molekyler kan være konjugeret til disse grupper. Denne protokol knyttes alle tre fælles funktionelle grupper (methyl, carboxyl, og amino). Forholdet mellem PIND er valgt at prioritere fluorescerende påvisning først, så muligheden for at indarbejde en sekundær målretning gruppe ved hjælp af gruppen carboxylsyre. Nøgletal for disse grupper kan være sammenknebne baseret på programmet, og længder og udformninger af polymerer kan justeres så godt.
For at måle partikel optagelse, konjugeret vi en fluorescerende sonde til en af de funktionelle grupper. Det skal bemærkes, at enhver konjugation ud over hvad vi har beskrevet vil resultere i en ændring af nanopartikel overflade egenskaber. Hver iteration af nanopartikler med hensyn til yderligere komponenter og konjugation reaktioner bør testes for de ønskede egenskaber.
Denne metode opretter ultrasmå guld nanopartikler beregnet til at overvinde de defensive egenskaber af i endothelial ekstracellulære glycocalyx, som hæmmer optagelsen af konventionelt mellemstore nanopartikler. Men den lille størrelse egner til vanskeligheder i både billedbehandling og narkotika lastning aspekt. Disse partikler er betydeligt mindre end det typiske nanopartikel størrelsesområde, og følgelig areal til vedhæftede filer i therapeutics og målretning fraspaltning formindskes stærkt. Dette kan føre til vanskeligheder afhente individuelle signaler i imaging programmer, selv om klynger af partikler kan stadig nemt identificeres, som vist i de Konfokal billeder. Den reducerede overflade for vedhæftede filer af målretning ligander og therapeutics kan kræve flere partikler skal indgives for at opnå målet dosis krav. Men de mindre partikler bliver mere effektiv i levering når tages hensyn til glycocalyx.
Disse roman ultrasmå partikler er i stand til levering i vanskelige at nå nanoskala områder inden for kroppen med minimal afbrydelse af mikromiljø. Tilsætning af STANGEN giver mulighed for øget biokompatibilitet og tilbyder funktionelle grupper for tunge tilpasning af partikler til forskellige applikationer. Den mindre størrelse i forhold til typiske nanopartikler kommer med nogle mangler, men hvis udarbejdes strategisk, de ultrasmå partikel er en lovende tilgang til indkvartering af de vanskeligt at trænge ind, indviklede, og skrøbelige glycocalyx i vaskulær målretning og drug delivery.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Northeastern University Chemical Engineering Department, give Start-up midler og en Tier 1 Pilot studie tilskud fra Northeastern University Provst Office, NIH K01 HL125499 og NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Forfatterne vil også gerne takke Thomas J. Webster og hans lab for deres bistand samt Nanomedicin Science og Technology Center og Pharmaceutical Sciences Department på Northeastern University.
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles – P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |