Summary
Beschrijven we een methode voor de synthese van biocompatibel 10-nm gouden nanodeeltjes, matiemaatschappij door poly-ethyleen-glycol coating op het oppervlak. Deze deeltjes kunnen worden gebruikt in vitro en in vivo voor het leveren van therapeutics nanoschaal cellulaire en extracellulaire ruimten die zijn moeilijk toegankelijk met conventionele nanoparticle maten.
Abstract
Gouden nanodeeltjes (AuNPs) hebben is gebruikt uitgebreid in medisch onderzoek als gevolg van hun grootte, biocompatibiliteit en aanpasbaar oppervlak. Specifieke targeting en drug delivery zijn enkele van de toepassingen van deze AuNPs, maar endothelial extracellulaire matrices defensieve eigenschappen belemmert deeltje opname. Om dit probleem te verhelpen, beschrijven we een synthese methode voor resolutiemicroscopen gouden nanodeeltjes om vasculaire levering, met aanpasbare functionele groepen en polymeer lengtes voor verdere aanpassingen. Het protocol opbrengsten 2,5 nm AuNPs die zijn afgetopt met tetrakis (hydroxymethyl) fosfonium chloride (THPC). De vervanging van THPC met hetero-functionele polyethyleenglycol (PEG) op het oppervlak van de AuNP verhoogt de hydrodynamische straal naar 10.5 nm terwijl het verstrekken van verschillende functionele groepen op het oppervlak. Het laatste deel van het protocol bevat een optionele toevoeging van een fluorophore om de AuNPs te worden gevisualiseerd onder fluorescentie om bij te houden van de opname van de nanoparticle. Dialyse en lyofilisatie werden gebruikt om te zuiveren en te isoleren van de AuNPs. Deze fluorescerende nanodeeltjes kunnen worden gevisualiseerd in zowel in vitro als in vivo experimenten als gevolg van de biocompatibel PEG conserveren en fluorescerende sondes. Bovendien maken de groottewaaier van deze nanodeeltjes hen een ideale kandidaat voor de glycocalyx indringende zonder te onderbreken van de normale therapieën functie, wat tot verbeterde levering en therapeutics leiden kan.
Introduction
Nanodeeltjes hebben vereffend voor drug delivery en imaging voor haar vermogen om te navigeren door het lichaam te bereiken van de doelgebieden voor belang1,2. De deeltjes kunnen accumuleren binnen tumoren via de lekkende therapieën of lokaliseren waar een doel-ligand is overexpressie en blootgesteld. Goud, in het bijzonder uitgegroeid tot een veelgebruikte nanoparticle materiaal vanwege haar unieke chemische en fysische eigenschappen die invloed hebben op het vervoer en de introductie van therapeutics3. Goud is een effectieve nanoparticle materiaal omdat het oppervlak kan worden gewijzigd om te binden aan thiolen en heeft hoge biocompatibiliteit vanwege zijn lage toxiciteit4. AuNPs kunnen worden dragers van grote biomoleculaire drugs en geslaagd in het leveren van peptiden, nucleïnezuren en proteïnen, waardoor AuNPs als gunstig voor het targeten van2,4.
Nanoparticle drug delivery effectiviteit heeft helaas belemmerd door de negatief geladen glycocalyx, die de extracellulaire jas aan het membraan van meest zoogdiercellen en heeft porie maten van maximaal 7 nm5,6. Deze poriegrootte is kleiner dan de meeste nanoparticle drug vervoerders, die hebben typische diameters variërend van 50-200 nm. Onder ziekten worden deze poriën glycocalyx groter als gevolg van aantasting, vergroten van de permeabiliteit via naar de endotheliale cellen. Meeste nanodeeltjes zijn echter nog steeds te groot om te profiteren van deze structurele verandering in de glycocalyx. Een consequentie van deze € žgroottewanverhoudingâ € is dat conventioneel formaat deeltjes geen gunstig interactie met endotheliale cellen die lijn van de bloedvaten. Dit is van invloed op de levering van intraveneus toegediend deeltjes in het endotheel, en kan ook worden gezegd van deeltje transport via het bloed hersenen barrière7,8,9,10.
Een benadering ter bestrijding van dit probleem is om het gebruik van kleinere deeltjes passeren de kleine poriën in het glycocalyx. We vatten hier een 10.5 nm resolutiemicroscopen gouden nanoparticle, die normaal gesproken zouden worden afgeschrikt door intact, gezonde glycocalyx. Zodra de glycocalyx begint te worden aangetast, moet de cellen door de toenemende poriegrootte gemakkelijk doordringen in de nanoparticle. Het protocol in dit document geeft een synthese van resolutiemicroscopen gouden kern bedekt met PEG, dat verhoogt de biocompatibiliteit en vermindert de systemische goedkeuring4. De PEG kan bevatten ook verschillende soorten functionele groepen, openen van mogelijkheden voor conjugatie therapeutiek, liganden en fluorophores te targeten. Eerder gepubliceerde resultaten wijzen erop dat deze resolutiemicroscopen nanodeeltjes neiging om komen meer gunstig in regio's van verstoorde endothelial glycocalyx functie zelfs zonder een actief gericht op4,11. Dit geeft aan de haalbaarheid en het belang van het gebruik van deeltjes van de juiste grootte voor levering toepassingen. Het volgende protocol presenteert de synthese, zuivering en de karakterisatie van de PEG-gecoate AuNPs (PEG-AuNP), met de discussie voor de afstemming van de functionele groepen en vervoegingen voor andere toepassingen.
Protocol
1. voorbereiding of aanschaf van stamoplossingen (bij kamertemperatuur worden opgeslagen of bevroren tot gebruik)
- Bereid een stamoplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) door ontbinding van 400 mg NaOH in 10 mL ultrazuiver water op kamertemperatuur, en de materialen goed te mengen.
Opmerking: Ultrapure water wordt gedefinieerd als water zonder verontreinigingen zoals deeltjes, bacteriën, nucleasen, ionen of sporen van organische stoffen. Een zuiveringsinstallatie wordt gebruikt voor het verkrijgen van de ultrapure water, resulterend in de soortelijke weerstand van maximaal 18.2 mΩ·cm, wijzen op een lage anionogene verontreiniging. Het gebruik van verkrijgbare gebotteld ultrazuiver water wordt niet aanbevolen. Voortaan zal dit ultrazuiver water worden verwezen als water, tenzij anders aangegeven. - Bereiden van een stamoplossing van 6M NaOH door ontbinding 2.4 g NaOH in 10 mL water en slaat u de oplossing op kamertemperatuur.
- Bereid een stamoplossing van 250 mM chloroauric zuur (HAuCl4) door de ontbinding van 1 g gedroogde HAuCl4 in 10.16 mL water. Verdunnen 1 mL 250 mM HAuCl4 en 9 mL water te werken concentratie van 25 mM HAuCl4te verkrijgen. De oplossing van de4 HAuCl bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
- Bereid een 0,1 M carbonaat buffer met een pH 8,8, door ontbinding van 84 mg natriumbicarbonaat in 10 mL water en pH 8,8 aanpassen door het toevoegen van 6 M NaOH van stap 1.2. De carbonaat buffer bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
- Meng 20 mL tetrazolium samengestelde, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium zout (MTS), met een stabilisator, fenazine ethosulfate (PSE) (Zie Tabel van materialen). Het mengsel van MTS/PSE in aliquots (voor een maximum van 10 bevriezen-ontdooien cycli) bewaren bij-20 ° C in het donker.
2. Samenvatting van de gouden Nanoparticle kernen
- Bereid een verdunde THPC-oplossing door het toevoegen van 12 µL van 80% THPC in water tot 1 mL water in de buis van een microcentrifuge bij kamertemperatuur.
- Veilig een maatkolf van 100 mL ronde onderkant boven het midden van een magnetische roer plaat. 45 mL water giet in de kolf en roer het water op 300 rpm met behulp van een kleine ei-vormige magnetische roer bar. Voeg 0,5 mL 1 M NaOH en 1 mL verdunde THPC oplossing. Blijven roeren het reactiemengsel krachtig gedurende 5 min.
- Blijven roeren van het mengsel en voeg toe 2 mL 25 mM HAuCl4 oplossing. De kleur van het mengsel verandert van geel tot donkerbruin binnen seconden, die aangeeft dat de vorming van THPC AuNPs afgetopt met een negatieve lading. Roer het mengsel voor een extra 15 min te voorzien in volledige vorming van de gouden kernen.
3. de toevoeging van het polymeer Corona rond de gouden nanodeeltjes
- Tijdens de periode van 15 min in stap 2.3 is beschreven, bereiden de PEG oplossingen door elk van de volgende handelingen uit in 1 mL water in 4 mL glazen flesjes: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.
Opmerking: De resulterende concentraties moet 8.8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH en 3,75 M COOH-PEG-SH. - Na het verminderen van de roeren snelheid van de oplossing in de kolf met ronde bodem aan 100 rpm, toevoegen dat de PEG-oplossingen voor de oplossing van THPC afgetopt AuNPs ontkleuring. Roer het mengsel voorzichtig 's nachts, bij kamertemperatuur, om ervoor te zorgen efficiënte verwijdering van THPC en de vervanging ervan door PEG blijven.
- Gebruiken voor de volgende 72 uur, een 12-14 kDa molecuulgewicht cutoff cellulose membraan te dialyze het stirred mengsel tegen een 4 L emmer water geroerd op 60 rpm. De uiteinden van de membranen binden door dialyse clips en breng de oplossing kwantitatief via pipet.
Opmerking: Dit proces van de dialyse met de 12-14 kDa cutoff membraan alleen verwijdert spoorverontreiniging PEG, THPC en andere chemische reagentia, door diffusie langs een gradiënt van de concentratie. - Om te handhaven van de hoge concentratie verloop en continue verspreiding te bevorderen, door het water te veranderen elke 2 h gedurende de eerste 6 uur en elke 6-12 h voor de resterende 66 h.
Opmerking: Het doel van dit schema water wijzigen is aan de snelle verspreiding die vroeg op, treedt op in de aanvankelijk hoge concentratie in het monster. Het proces van dialyse beschreven hierboven bladeren de semi-gezuiverde, nanoparticle-oplossing omdat nanoparticles, precipitaten, aggregaten en andere onzuiverheden groot formaat de poriën van de 12-14 kDa cutoff membraan niet kunnen passeren. - Filtreer de oplossing van de semi-gezuiverde nanoparticle in een conische buis van 50mL, met behulp van een filter van 0,2 µm spuit de resterende precipitaten, aggregaten, en andere groot formaat onzuiverheden te verwijderen.
- Plaats van de conische buis in een vriezer-80 ° C en laat de gezuiverde oplossing van de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) te bevriezen voor ongeveer 5 h.
- Gebruik een bevriezing van de droger om te lyophilize van de gezuiverde PEG-AuNP.
- De droge, gezuiverde PEG-AuNP bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
4. conjugating Fluorophores met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester op de NH2 groepen op de PEG-AuNP
- Veilig een maatkolf van 50 mL ronde onderkant boven het midden van een magnetische roer plaat. Vul de maatkolf met 18 mL water toe en roer het water op 100 rpm met behulp van een magnetische roer ei-vormige bar.
- Weeg 2 mg van het gelyofiliseerd PEG-AuNP in een conische buis van 4 mL, met een hoge precisie benchtop-kleurenschaal. Gebruik een anti-statische kanon om statische lading en vasthouden van het poeder van de PEG-AuNP op het oppervlak van de buis te elimineren. Voeg 2 mL water aan de buis. Giet de 2 mL PEG-AuNP oplossing in de kolf met ronde bodem voor verdere reconstructie in een totaal van 20 mL water. Roer het mengsel op 100 rpm met behulp van een magnetische roer ei-vormige bar blijven.
- Voeg 1 mL 0,1 M, pH 8,8 carbonaat buffer naar de 20 mL van synthetisch AuNP opgenomen in de kolf met ronde bodem. Blijven roeren.
- 5 µL van 10 mg/mL fluorescerende NHS ester in dimethylsulfoxide toevoegen.
Opmerking: Een fluorescente kleurstof kan worden gebruikt in dit proces. Roer de fluorescerende PEG's nachts. Houd het bij kamertemperatuur en bedekt met folie. - Voor de volgende 72 h, Verwijder overtollige fluorophores met behulp van het protocol beschreven in stap 3.3. Kort, dialyze de stirred mengsel met behulp van een emmer 4 L water en een 12-14 kDa molecuulgewicht cutoff cellulose membraan. Het water veranderen elke 2 h voor de eerste 6 h en elke 6-12 uur voor de resterende 66 h.
- Verkrijgen van 1 mL van de gezuiverde fluorescerende PEG-AuNP oplossing, om te worden gebruikt voor de karakterisering van het onderstaande beschreven in hoofdstuk 5. Bevriezen en lyophilize van de resterende oplossing voor fluorescerende nanodeeltjes in poeder vorm voor opslag bij 4 ° C, zoals beschreven in stappen 3.5-3.7.
- Een 0,2 µm spuit filter te steriliseren en te verwijderen van elke potentiële precipitaten eenmaal gereconstitueerd voor cel cultuur toepassingen gebruiken.
5. de karakterisering van nanodeeltjes fluorescerende gepegyleerde goud
- Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voor het visualiseren van de gouden nanoparticle kern en kwantificeren van de maten
- Drop 10 µL van de gezuiverde oplossing voor fluorescerende PEG-AuNP op een koolstof gecoat netraster TEM.
- Na 5 min, kunt een stuk filtreerpapier zorgvuldig pit weg overtollige vocht vanaf de rand van het TEM-raster tot een film met de TL die Peg-AuNPs wordt achtergelaten.
- De fluorescerende PEG-AuNPs bekijken 80 kV en bij een vergroting van 50.000-150, 000. Digitale foto's te nemen.
Opmerking: Alleen de gouden kern zullen zichtbaar omdat de PEG niet elektron dicht op de TEM is. - Met behulp van een meetinstrument software, stel de metingsschaal in correlatie met de schaal bar. Bereken de diameter van ongeveer 20 gouden kernen, en controleer de gemiddelde gouden kerndiameter.
Opmerking: De TEM imaging systeem plaatst automatisch een schaal bar op de digitale foto's.
- Meting van de hydrodynamische nanoparticle grootte met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS)
- Pipetteer 1 mg gelyofiliseerd THPC beklede AuNPs in een microcentrifuge buis met behulp van de in stap 4.2 beschreven aanpak. Overdracht van 1 mg van gelyofiliseerd PEG-AuNP in een aparte buis. Voeg 1 mL water aan elke buis toe en breng elke AuNP oplossing over in een doorzichtige plastic 1 mL.
- Plaats een cuvet in een DLS-instrument en meten van sferische hydrodynamische diameters met behulp van het deeltje analyzer software die is ingebouwd in het systeem van Distributielijsten.
- Plot de gemeten hydrodynamische diameters met behulp van een histogram-indeling.
Opmerking: Het histogram zal nanodeeltjes groeperen op grootte. De grootste groep van nanodeeltjes zal verduidelijken de diameter die de grootte van de AuNPs gesynthetiseerd in dit protocol het best beschrijft.
- Fluorimetrische fluorescentie bevestiging
Opmerking: Dezelfde steekproef en cuvette uit stap 5.2 kunnen worden gebruikt voor het meten van fluorescent signaal.- De cuvette uit de Distributielijsten verwijderen en invoegen in een spectrofluorometer. Set de excitatie golflengte 633 nm en lees de uitgestoten fluorescentie langs een golflengtebereik van 650-800 nm signalen.
- Bevestigen dat de piek ongeveer 665 nm, die met de uitstoot piek voor NHS correleert.
Opmerking: Pas de excitatie en emissie golflengten volgens de fluorophore gebruikt in het proces.
- MTS assay11 om te beoordelen van de biocompatibiliteit
- In een 96-Wells duidelijk onder steriele Weefselkweek behandeld plaat, Pipetteer 100 µL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM; aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline/streptomycine) en 3,2 x 103 cellen in elk putje.
Opmerking: In deze studie, rat vet pad endotheliale cellen worden gebruikt. Een totaal van 21 putten worden gebruikt om te voorzien in 3 replicatieonderzoeken voor elk van de 7 verschillende nanoparticle concentraties (zie stap 5.4.3 voor specifieke concentraties van belang). - De cellen groeien tot confluentie in vochtigheid en 5% CO2 gecontroleerd starterscentra bij 37 ° C11toestaan.
- Bereiden van individuele microcentrifuge buizen, elk met 300 µL van DMEM met nanodeeltjes van verschillende concentraties. Deze studie vereist 7 verschillende buizen van DMEM met de volgende concentraties van PEG-AuNP: 0 µg Mo/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg Mo/mL en 1000 µg Fe/mL.
- De DMEM van de buis gecombineerd. Vul de putten in drievoud met 100 µL van DMEM media met 0, 10, 50, 100, 250, 500 of 1000 µg Mn/mL AuNP.
- Kunnen cellen en nanodeeltjes aan mede Incubeer gedurende een vooraf bepaalde tijdsduur, hier voor 16 h.
- Ontdooien in de buurt van het einde van de incubatieperiode, de MTS/PES mengsel uit stap 1.5.
- Na incubatie, gecombineerd de DMEM en de geschorste, losjes gekoppelde nanodeeltjes de putjes. Voeg 100 µL van verse DMEM samen met 20 µL van MTS/PES oplossing te verkrijgen van 1:5 MTS/PES DMEM ratio volgens protocol van de fabrikant. Incubeer de cellen met MTS/PES bij 37 ° C gedurende 2 uur.
Opmerking: Deze incubatietijd 2 h wordt bepaald door de metabole activiteit van endotheliale cellen en kan worden verhoogd tot maximaal 4 uur voor andere celtypes. Binnen de periode van 2 uur, is de MTS gemetaboliseerd door de endotheliale cellen in gekleurde formazan dat vermengt zich met de DMEM. Biocompatibiliteit van PEG-AuNP en de waarschijnlijkheid van de levensvatbaarheid van de cellen zal worden aangetoond met meer gekleurde formazan. Toxiciteit van PEG-AuNP en de kans dat de cellen sterven getoond met minder intense kleur. - Colorimetrische analyses van elk putje uit te voeren door het lezen van de absorptie bij 492 nm met een compatibel afleesapparaat.
- Bereken de gemiddelde absorptie van drievoudige extinctie waarden voor elke concentratie nanoparticle. Verdeel de gemiddelde absorptie door de waarde uit het gemiddeld extinctie in putten met 0 µg Mo/mL nanodeeltjes.
Opmerking: Deze putjes waarin geen AuNPs dienen als besturingselementen voor het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen van het percentage in reactie op nanoparticle behandeling toegediend in andere wells.
- In een 96-Wells duidelijk onder steriele Weefselkweek behandeld plaat, Pipetteer 100 µL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM; aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline/streptomycine) en 3,2 x 103 cellen in elk putje.
- Fluorescentie confocale microscopie beoordelingvan de nanoparticle opname in aanhangend endotheliale cellen met intact of disfunctionele glycocalyx11
- Zaad 1.0 x 104 cellen/cm2 rat vet pad endotheliale cellen op steriele 12 mm glas coverslips en cellen voeden met DMEM aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline/streptomycine. De cellen groeien tot volledige confluentie in vochtigheid en CO2 gecontroleerd starterscentra bij 37 ° C, voor ongeveer 3 dagen toestaan.
- Voeg behandelingen om te wijzigen de glycocalyx, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, degradeert 2 h behandeling van de gekweekte endotheliale cellen met 2.5 x 10-6 IU heparinase III enzym de glycocalyx door specifiek het splijten van haar heparan sulfaat component.
Opmerking: Gezonde glycocalyx kan worden gemodelleerd door de endotheliale cellen groeien, zoals beschreven in stap 5.5.1 zonder de toevoeging van afbraak enzymen. - Incubeer de endotheliale cellen met fluorescerende AuNPs op 550 µg/mL voor 16 h of andere gewenste tijdstip met de endothelial glycocalyx intact gelaten of gesmolten disfunctionele.
- Voorzichtig wassen de cellen met 2 mL van 37 ° C 1% bovien serumalbumine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; met 100 mg/L calcium en magnesium 100 mg/L). Onderdompelen van de cellen in 2 mL zuiver paraformaldehyde van 2% en 0,1% Glutaaraldehyde in PBS, en laat de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur vast te stellen.
- Verwijder de aldehyde fixing oplossing en wassen van de cellen met kamertemperatuur PBS voor drie 5-min cycli.
- Bloot endotheliale cellen 2% geit serum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren aspecifieke bandplaatsen voor primair antilichaam verlijmen. Cellen moeten volledig worden gedekt door de blokkerende oplossing.
- Incubeer endotheliale cellen overnachting met 1% anti-heparan sulfaat primair antilichaam in 2% geit serum in PBS in 4 ° C op het etiket van de heparan sulfaat component van de glycocalyx. Ervoor zorgen dat de vaste cellen volledig in contact met de antilichaam-oplossing.
- De volgende dag wassen het antilichaam met kamertemperatuur PBS voor drie cycli van 10 min.
- Incubeer de endotheliale cellen met 1:1,000 verdunning van de passende fluorescerende secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, in het donker of bedekt met aluminiumfolie.
- Het secundaire antilichaam met kamertemperatuur PBS wassen voor drie cycli van 10 min.
- Monteer het dekglaasje aan in Microscoop dia's met behulp van een anti-fade montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) voor kernen kleuring. Verzegel de rand van het dekglaasje aan met behulp van nagellak.
- Beeld de fluorescerende immunostained endothelial cel monsters met confocale microscopie, veel rode, blauwe en groene kanalen gebruiken om te visualiseren de kernen, heparan sulfaat glycocalyx en nanoparticles, respectievelijk.
Representative Results
De kunstmatige AuNPs, bekleed met THPC of PEG (figuur 1A en figuur 1B, respectievelijk), worden beeld met TEM en de deeltjes maten zijn gemeten met behulp van de TEM en de DLS om de verdeling van de grootte van de juiste nanoparticle. Figuur 2 toont het TEM-beeld van een monster THPC-AuNP bij 80 kV en 150.000 x vergroting. De diameters van de THPC-AuNP deeltjes variëren van 2-3 nm, gebaseerd op de kalibratiebalk in TEM beelden. De grootte van deze THPC-AuNP blijkt ook uit de Distributielijsten grootte meting histogram weergegeven in afbeelding 2, in die de THPC gecoat AuNP is aangetoond dat een piek op 2,5 nm. PEGylation is niet zichtbaar onder TEM omdat de polymeren niet elektron dicht. TEM beeldvorming van PEG-AuNP monsters bevestigt alleen maar de aanwezigheid van individuele verspreide deeltjes, die verwachting omdat de PEG polymeer corona rond nanoparticles hulp bij preventie van aggregatie. Voor deze PEG-AuNP monsters, de DLS grootte meting histogram toont een verschuiving in de piek tot ongeveer 10.5 nm op de Distributielijsten. Bijlagen van verdere liganden of drugs op functionele groepen zal invloed hebben op de grootte van de nanoparticle evenals en in aanmerking moeten worden genomen bij het meten van de diameter.
De toevoeging van de fluorophore (Figuur 1 c) wordt bevestigd met behulp van een Fluorimeter voor het meten van fluorescentie signaal van een steekproef van nanodeeltjes, zoals afgebeeld in Figuur 3. Als enthousiast met een golflengte van 633 nm, de emissie is gemeten om te beschikken over een maximale termijn tussen de 660 en 672 nm, die overeenkomt met de productinformatie van de fabrikant van de maximale emissie bij 665 nm. Bevestiging van andere fluorescerende sondes moet worden gecontroleerd op een vergelijkbare manier te zorgen voor fluorescerende reactie.
De biocompatibiliteit van de deeltjes en de levensvatbaarheid van de verwante cellen worden beoordeeld met behulp van de MTS-bepaling te controleren van de relatieve celmetabolisme van MTS na een incubatieperiode van 16 h met verschillende concentraties van de nanodeeltjes. De fluorophore geconjugeerd PEGylated AuNPs toont geen significante toxiciteit, zoals aangegeven door de vergelijkbare niveaus van de levensvatbaarheid van de cellen op alle concentraties tot 1 mg/mL (figuur 4A). Deze biocompatibiliteit kan veranderen afhankelijk van de therapeutische of de ligand gekoppeld aan de resterende functionele groepen verder aanpassen van de deeltjes. Drug bijlagen neigen te verhogen van toxiciteit, maar afhankelijk van de concentraties van de werken, het mag niet van invloed op de levensvatbaarheid op een significante wijze.
Opname van TL, PEGylated AuNPs (Figuur 1 c) door Adherente cellen wordt beoordeeld met behulp van endotheliale cellen van het vet pad van gekweekte rat met intact of disfunctionele glycocalyx (figuur 4B). De disfunctionele glycocalyx voorwaarden worden bereikt door toevoeging van heparinase III enzym aan de cultuur, wat resulteert in een verslechtering van de heparan sulfaat glycocalyx component en de matrix12in gevaar te brengen. Figuur 4B toont de verschillende niveaus van opname van PEG-AuNPs, als de rode stippen op de transversale weergave van de representatieve endotheliale cellen. Een gezonde glycocalyx ontmoedigt opname van deze gouden nanodeeltjes, maar een substantiële toename wordt waargenomen wanneer het enzym is werknemer11. Dit resultaat benadrukt het potentieel van deze resolutiemicroscopen nanodeeltjes aan te leveren therapeutics endotheliale cellen in een wijze gecontroleerd door verschillende interacties die zijn gebaseerd op de gezondheid van glycocalyx.
Figuur 1: schema van goud nanoparticle. (A) THPC gecoat AuNP nanosphere voor vervanging van de PEG. (B) PEGylated AuNP met 3 types van PEG opzeggingen, met inbegrip van COOH, NH2en CH3. Blauwe golven vertegenwoordigen het polymeer. (C) geconjugeerd nanodeeltjes voor fluorescentie imaging. Rode sterren Toon de fluorophores geconjugeerd met NH2 functionele groepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: het formaat van de metingen van gouden nanodeeltjes. Links: TEM van gouden nanodeeltjes vóór toevoeging van PEG bij 80 kV en 150.000 X vergroting, met schaal bar komt te staan. Rechts: Histogram van de grootte van de nanoparticle gemeten door DLS vóór (AuNP) en na (PEG-AuNP) de THPC vervanging met PEG. De resultaten van de Distributielijsten voor THPC beklede AuNP kwantificeren wat is gevisualiseerd door TEM. De resultaten van de DLS PEG-gecoate AuNP overwinnen de uitdaging van het onvermogen om te visualiseren van PEG door TEM als gevolg van de polymeren niet zijnde elektron dicht. Een TEM van PEG-AuNP zal tonen alleen de kern gouden nanodeeltjes en zal er hetzelfde uitzien als een THPC-afgetopte AuNP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gegevens van de fluorescentie van de fluorescerende PEG-AuNP. De piek van de fluorescentie op 667 nm wedstrijden de uitstoot van de fluorophore geconjugeerd met PEG-AuNP. A.U.: willekeurige eenheden.
Figuur 4: cel interacties met de fluorescerende PEG-AuNP. (A) cel levensvatbaarheid (MTS metabolisme) plot voor rat vet pad endotheliale cellen na 16u co incubatie met fluorescerende PEG-AuNP. (B) Confocal transversale beelden van vaste rat vet zeem endotheliale cellen gekleurd met DAPI voor de kernen (blauw) en antilichamen tegen heparan sulfaat, een glycocalyx component (groen). Afbeelding bovenz─│de is een gezonde glycocalyx en bodem is een aangetaste glycocalyx laag; Er is aanzienlijk meer rode fluorescentie van de nanodeeltjes in het monster met aangetaste glycocalyx. De bar van de schaal is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Deze techniek is een effectieve methode voor de synthese van aanpasbare, dat resolutiemicroscopen PEG gecoat AuNPs. Een belangrijk onderdeel van deze procedure is dat de initiële vorming van THPC afgetopt goud nanodeeltjes, die kan worden bevestigd door de kleur te veranderen van geel tot bruin dat optreden zal nadat HAuCl4 is toegevoegd aan de inhoud van de kolf met ronde bodem (Protocol stap 2.3). Geen kleurverandering geeft aan dat er geen nanodeeltjes die gevormd zijn en dat de eerste stappen die moeten worden gecontroleerd en herhaald voordat u verdergaat. In het geval dat de kleur in iets anders dan brown zoals wijn rood of grijs verandert, de resulterende deeltjes zal waarschijnlijk niet worden rond de doelgroep 2,5 nm en een nieuwe batch moet eveneens worden gemaakt.
Na de vorming van de gouden kern, de uitwisseling van THPC voor PEG en de zuiveringsprocedures bevatten verscheidene belangrijke stappen voor de succesvolle voltooiing van het protocol. 'S nachts mengen voorziet in de vervanging reactie naar voltooiing. Mislukte zuivering kan voorkomen als het water van de dialyse is niet veranderd met de voorgeschreven frequentie. Aggregatie en neerslag van de deeltjes kunnen ook optreden als de deeltjes in dialyse voor meer dan 72 uur zitten. Andere potentiële problemen kon worden waargenomen tijdens bevriezen drogen. Als de resolutiemicroscopen PEG bekleed AuNP oplossing was niet volledig bevroren of als de lyophilizer niet correct is ingesteld, kunnen de monsters worden verloren. Raadpleeg de handleiding van de lyophilizer, zoals sommige apparatuur moet u mogelijk verschillende staalvoorbereiding.
Het gemak van de synthese en de biocompatibiliteit van de resulterende deeltjes vertegenwoordigen voordelen voor het gebruik van deze PEG-AuNPs. Bovendien, hebben deze nanodeeltjes het voordeel dat ze kunnen werken met nanoschaal cellulaire structuren, zoals blijkt uit de mogelijkheid om het aangetaste glycocalyx identificeren door opname van deze nanodeeltjes. Dit voordeel kan worden benut voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën van atherosclerose en preventieve maatregelen. Verder dan wat we hier aanwezig, een ander voordeel van dit protocol is dat het voorziet in uitgebreide aanpassing van de deeltjes evenals stabiliteit en opslagmogelijkheden verhoogd door thiol met PEG op de gouden nanodeeltjes4. Het andere uiteinde van de keten van PEG kan bevatten functionele groep, en een horde van moleculen kan aan deze groepen worden vervoegd. In dit protocol, alle drie gemeenschappelijke functionele groepen zijn aangesloten (methyl, carboxyl, en amino). De verhouding van de PEG is gekozen te prioriteren fluorescerende detectie eerst, dan de mogelijkheid om op te nemen van een secundaire targeting deel daarvan met behulp van het carbonzuur-groep. De ratio's van deze groepen kunnen worden getweaked op basis van de toepassing en de lengtes en vormen van de polymeren vallende kunnen ook worden aangepast.
Voor het meten van deeltje opname, geconjugeerd we een fluorescente sonde naar een van de functionele groepen. Opgemerkt moet worden dat eventuele vervoeging dan wat wij hebben beschreven in een verandering van de oppervlakte-eigenschappen van de nanoparticle resulteren zal. Elke iteratie van de nanodeeltjes met betrekking tot de aanvullende componenten en vervoeging reacties moet worden getest voor de gewenste eigenschappen.
Deze methode levert resolutiemicroscopen gouden nanodeeltjes die bestemd zijn om te overwinnen de defensieve eigenschappen van het endotheel extracellulaire glycocalyx, die belemmert de opname van conventioneel formaat nanodeeltjes. Echter, de geringe omvang leent voor moeilijkheid in zowel de beeldvorming en de drug laden aspect. Deze deeltjes zijn aanmerkelijk kleiner dan de groottewaaier van de typische nanoparticle, en dientengevolge de oppervlakte beschikbaar voor bijlagen van therapeutics en targeting wordt sterk is verminderd. Dit kan leiden tot problemen oppakken van individuele signalen in beeldtoepassingen, hoewel de clusters van deeltjes kunnen nog steeds gemakkelijk worden geïdentificeerd, zoals wordt weergegeven in de confocal beelden. De verminderde oppervlakte voor bijlagen targeting liganden en therapeutics wellicht meer deeltjes worden toegediend om de dosering doelvoorschriften. De kleinere deeltjes zullen echter efficiënter in de levering wanneer rekening wordt gehouden met de glycocalyx.
Deze roman resolutiemicroscopen deeltjes zijn geschikt voor levering in moeilijk te bereiken nanoschaal plekken in het lichaam met een minimale verstoring van de communicatie. De toevoeging van de PEG zorgt voor verhoogde biocompatibiliteit en biedt functionele groepen voor zware aanpassing van de deeltjes voor uiteenlopende toepassingen. De kleinere omvang in vergelijking met typische nanodeeltjes komt met enkele tekortkomingen, maar als strategisch ontwikkeld, het resolutiemicroscopen deeltje is een veelbelovende aanpak voor accommodatie van de moeilijk te penetreren, ingewikkelde en fragiele glycocalyx in vasculaire targeting en drug delivery.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Northeastern University Chemical Engineering Department, verlenen Start-up middelen en een Tier 1 Pilot studie subsidie uit de noordoostelijke Universiteit Provost Office, NIH K01 HL125499 en NSF-IGERT NSF/DGE-096843. De auteurs ook bedank Thomas J. Webster en zijn lab voor hun hulp, evenals de nanogeneeskunde wetenschap en Technology Center en farmaceutische wetenschappen departement op Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
| Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
| Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
| Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
| Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
| Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
| Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
| Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
| Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
| 10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |
References
- Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
- Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
- Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
- Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
- Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
- Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
- Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
- Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
- Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).
