Vi beskriver en metode for å syntetisere biokompatible 10-nm gull nanopartikler, functionalized av belegg poly-etylenglykol på overflaten. Disse partiklene kan være brukt i vitro i vivo for å levere therapeutics til nanoskala mobilnettet og ekstracellulære områder som er vanskelige å finne med konvensjonelle hydrogenion størrelser.
Gull nanopartikler (AuNPs) har blitt brukt mye i medisinsk forskning på grunn av sin størrelse, biocompatibility og modifiserbare overflaten. Spesifikk målgruppe og stoffet levering er noen av programmene i disse AuNPs, men endothelial ekstracellulære matriser defensive egenskaper hemme partikkel opptak. For å løse dette problemet, beskriver vi en syntese metode for ultrasmall gull nanopartikler å forbedre vaskulær levering, med passelig funksjonelle grupper og polymer lengder for ytterligere justeringer. Protokollen gir 2.5 nm AuNPs som er avkortet med tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride (THPC). Utskifting av THPC med hetero-fungerende polyetylenglykol (PEG) på overflaten av AuNP øker etter radius til 10.5 nm samtidig tilby ulike funksjonsgruppene på overflaten. Den siste delen av protokollen inkluderer et valgfritt tillegg av en fluorophore som tillater AuNPs å bli visualisert under fluorescens spore hydrogenion opptak. Dialyse og lyophilization ble brukt til å rense og isolere i AuNPs. Disse fluorescerende nanopartikler kan visualiseres i vitro og i vivo eksperimenter på grunn av den biokompatible PEG malematerialer og fluorescerende sonder. I tillegg størrelse rekke disse nanopartikler gjengi dem en ideell kandidat for undersøkelser av glycocalyx uten å forstyrre normal blodkar-funksjonen, som kan føre til bedre levering og therapeutics.
Nanopartikler er brukt narkotika-leveranser og bildebehandling for sin evne til å navigere gjennom kroppen for å nå målet områder av interesse1,2. Partiklene kan akkumuleres i svulster via er lekk blodkar eller lokalisere hvor en mål ligand overexpressed og utsatt. Gull, spesielt, har blitt et vanlig hydrogenion materiale på grunn av sin unike kjemiske og fysiske egenskaper som påvirker transport og utgivelsen av therapeutics3. Gold er en effektiv hydrogenion materiale fordi overflaten kan endres for å binde til thiols og har høy biocompatibility på grunn av sin lav toksisitet4. AuNPs er i stand til å bli bærere av store biomolecular narkotika og har vært vellykket i å levere peptider nucleic syrer og proteiner, slik at AuNPs å være gunstig for målretting2,4.
Dessverre vært hydrogenion stoffet levering effektiviteten hemmet av den negativt ladde glycocalyx, som er den ekstracellulære strøk på membranen av mest pattedyrceller og pore størrelser opptil 7 nm5,6. Denne porestørrelse er mindre enn de fleste hydrogenion narkotika operatører, som har typisk diameter fra 50-200 nm. Under sykdom forhold blir disse glycocalyx porene større på grunn av fornedrelse, øke permeabiliteten gjennom til endotelceller. De fleste nanopartikler er imidlertid fortsatt for stor til å dra nytte av denne strukturelle endringen i glycocalyx. En implikasjon av dette filstørrelse mismatch er at konvensjonelt størrelse partikler ikke samarbeide godt med endotelceller som blodkar. Dette påvirker levering av intravenøst administrert partikler i endotelet, og kan også sies om partikkel transport gjennom blod hjernen barriere7,8,9,10.
En tilnærming for å bekjempe dette problemet er å benytte mindre partikler passerer gjennom små porene i glycocalyx. Her syntetisere vi en 10,5 nm ultrasmall gull hydrogenion, som normalt bør bli avskrekket av intakt, sunt glycocalyx. Når glycocalyx begynner å bli svekket, bør hydrogenion lett trenge cellene til økende porestørrelse. Protokollen i notatet detaljer en syntese av ultrasmall gull belagt med PEG, som øker biokompatibilitet og reduserer systemisk klaring4. PINNEN kan også inneholde flere typer funksjonelle grupper, åpner muligheter for Bøyning av målretting ligander, fluorophores og therapeutics. Tidligere tyder publiserte resultatene på at disse ultrasmall nanopartikler tendens til å bli tatt opp mer gunstig i områder av forstyrret endotelial glycocalyx funksjonen selv uten noen aktive målretting4,11. Dette angir gjennomførbarhet og viktigheten av å utnytte partikler av riktig størrelse for levering-programmer. Følgende protokollen presenterer syntese, rensing og karakterisering av PEG-belagt AuNPs (PEG-AuNP), med diskusjonen i skreddersy funksjonelle grupper og conjugations for andre programmer.
Denne teknikken er en effektiv metode for å syntetisere passelig, ultrasmall pinne belagt AuNPs. En viktig del av denne prosedyren er første dannelsen av THPC avkortet gull nanopartikler, som kan bekreftes av fargeendring fra gul til brun som vil skje etter at HAuCl4 er lagt til innholdet i runde bunnen kolbe (protokollen trinn 2.3). Ingen fargeendring angir at det er ingen nanopartikler dannet og at forbokstaven skritt bør være sjekket og gjentatt før du fortsetter. I tilfelle fargen endres til noe annet enn brown som vin rød eller grå, den resulterende partikler vil trolig ikke være rundt mål 2.5-nm og en ny bunke bør gjøres også.
Etter dannelsen av gull kjernen, utveksle THPC pinne og rensing prosedyrer inneholder flere viktige trinn for vellykket gjennomføring av protokollen. Blande natten tillater utskifting reaksjonen å gå. Mislykkede rensing kan oppstå hvis dialyse vannet ikke endres med foreskrevet frekvensen. Aggregering og nedbør av partikler kan også oppstå hvis partikler igjen i dialyse for mer enn 72 timer. Andre potensielle problemer kan observeres under fryser tørking. Hvis ultrasmall PINNEN belagt AuNP løsning ikke var helt frosset eller hvis lyophilizer ikke var satt opp riktig, kan det hende at prøver går tapt. Se håndboken til lyophilizer, som noen utstyr kan kreve forskjellige utvalg forberedelser.
Enkel syntese og biokompatibilitet av resulterende partikler representerer fordeler for å bruke disse PEG-AuNPs. Dessuten, har disse nanopartikler fordelen av å kunne samhandle med nanoskala cellulære strukturer som demonstrert av evnen til å identifisere dårligere glycocalyx ved opptak av disse nanopartikler. Denne fordelen kan utnyttes for utvikling av nye aterosklerose behandlinger og forebyggende tiltak. Utover hva vi presenterer her, en annen fordel med denne protokollen er at det gir omfattende tilpasning av partikler samt økt stabilitet og lagringsegenskapene ved thiol som inneholder pinne på gull nanopartikler4. Den andre enden av PEG kjeden kan inneholde alle funksjonsgruppe, og et mylder av molekyler kan bli bøyd i gruppene. I denne protokollen, knyttes alle tre vanlige funksjonelle grupper (metyl, carboxyl, og amino). PINNEN er valgt å prioritere fluorescerende oppdagelsen først, deretter muligheten til å innlemme en sekundær målretting moiety bruker karboksylsyre gruppen. Prosenter av disse gruppene kan bli forskjøvet basert på programmet, og lengder og figurer av polymerer kan justeres også.
For å måle partikkel opptak, konjugert vi en fluorescerende sonde til en av de funksjonelle gruppene. Det bør bemerkes at enhver Bøyning utover hva vi har beskrevet vil resultere i en endring av overflaten egenskapene til hydrogenion. Hver iterasjon av nanopartikler forhold til tilleggskomponenter og Bøyning reaksjoner bør testes for de ønskede egenskapene.
Denne metoden gir ultrasmall gull nanopartikler skal overvinne defensive egenskapene til endotelial ekstracellulære glycocalyx, som hindrer opptaket av konvensjonelt størrelse nanopartikler. Imidlertid gir den lille størrelsen til problemer med både bildebehandling og stoff lasting aspekt. Disse partiklene er betydelig mindre enn den typiske hydrogenion størrelse, og resultatet areal tilgjengelig for vedlegg legemiddelselskap og målretting moieties er sterkt redusert. Dette kan føre til problemer med å plukke opp individuelle signaler i bildebehandlingsprogrammer, men klynger av partikler kan fortsatt lett identifiseres, som vist i AC confocal bilder. Redusert overflaten for vedlegg ligander og therapeutics kan kreve mer partikler gis for å oppnå målet dosering krav. Imidlertid vil mindre partikler være mer effektiv levering når tar hensyn til glycocalyx.
Disse romanen ultrasmall partikler kan leveres til vanskelig å nå nanoskala områder i kroppen med et minimalt avbrudd for microenvironment. Tillegg av PINNEN gir økt biocompatibility og tilbyr funksjonelle grupper for tunge tilpasning av partikler for forskjellige programmer. Den mindre størrelsen sammenlignet med typisk nanopartikler kommer med noen svakheter, men hvis utviklet strategisk, ultrasmall partikkelen er en lovende tilnærming til av det vanskelig å trenge, intrikate og skjøre glycocalyx i vaskulære målretting og stoffet levering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Northeastern University kjemisk ingeniørfag avdelingen, gi oppstart midler og Tier 1 Pilot studie stipend fra Northeastern University Provost Office, NIH K01 HL125499 og NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Forfatterne vil også gjerne takke Thomas J. Webster og hans lab for deres hjelp som Nanomedicine vitenskap og Technology Center og farmasøytisk Sciences avdeling på Northeastern University.
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles – P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |