Summary
Følgende protokollen fokuserer på etableringen av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkomspesialitet (m). Denne modellen kan hjelpe oss å forstå molekylær bakgrunnen og farmakologiske profil av disse sjeldne malignitet og kan representere et utgangspunkt for videre forskning å bedre STS ledelse.
Abstract
Bløtvev sarkomer (m) representerer et spekter av heterogene malignitet med en vanskelig diagnose, klassifisering og management. Hittil har mer enn 50 histologiske undergrupper av disse sjeldne solide tumorer blitt identifisert. Dermed sine ekstraordinære mangfold og lav forekomst er vår forståelse av disse svulstene biologi fortsatt begrenset. Pasient-avledede kulturer representerer den ideelle plattformen STS patofysiologi og farmakologi. Vi utviklet dermed menneskelige prekliniske modell m fra svulst prøver høstet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection. Pasient-avledede STS cellekulturer var Hentet fra den kirurgiske prøver av collagenase fordøyelse og isolert av filtrering. Cellene ble regnet, seeded, og igjen i 14 dager i standard monolayer kulturer og deretter behandlet av nedstrøms. Før du utfører molekylære eller farmasøytiske analyser, etablering av STS primære kulturer ble bekreftet gjennom evalueringen av cytomorphologic funksjoner og, når immunohistochemical markører. Denne metoden representerer en nyttig verktøyet 1) for å studere den naturlige historien disse dårlig utforsket malignitet og 2) for å teste effekten av ulike å lære mer om deres virkningsmekanismer.
Introduction
Bløtvev sarkomer (m) inkluderer et spekter av heterogene lesjoner av mesenchymal opprinnelse 1% av alle solide svulster1,2, og den nye Verdens helseorganisasjon klassifiseringen gjenkjenner tilstedeværelsen av mer enn 50 forskjellige subtyper3. Blant disse er de vanligste histotypes adipocyte sarkom eller liposarcoma og leiomyosarcoma, sto for 15% og 11% av alle voksne m, henholdsvis4,5. Selv om STS kan utvikle i ulike deler av kroppen, er armer og retroperitoneum de vanligste stedene, forekommer i 60% og 20% av tilfellene, henholdsvis6.
Hjørnesteinen i terapi for lokalisert sykdom er bredt kirurgisk resection, mens fordelene med adjuvant og neoadjuvant kjemoterapi er fortsatt uklart og regnes kun i Utvalgte tilfeller7. I innstillingen metastatisk kjemoterapi er standarden på omsorg, men viser begrensede resultater8. En bedre forståelse av molekylærbiologi m vil bidra til å forbedre det gjeldende differensialdiagnose, optimalisere tilgjengelige behandlingene og identifisere nye mål for terapi.
I denne sammenheng, er forskning på kreft utført i mange år med udødeliggjort cellen linjer9. Disse eksperimentelle modeller er vanligvis kultivert i standard monolayer støtter eller implantert i immunodeficient gnagere å etablere i vivo xenograft modeller10. Udødeliggjort cellelinjer representerer et håndterlig og lett til store materiale som et stort antall forskning eksperimenter kan utføres. De er faktisk den rimeligste og mest brukt verktøyet i preklinisk studier11.
Imidlertid celle basert kreft modeller har også noen begrensninger, f.eks langvarig kultur i et monolayer system med et økende antall passeringer induserer fenotypiske og genetiske drift, gjør cellene mindre sannsynlig for å recapitulate nøkkel svulst funksjoner. Videre linje cellekulturer ikke reprodusere celle til celle samhandling og signalnettverk molekyl crosstalk som etterligner biologisk atferd av svulster og karakterisere svulst microenvironment. Disse problemene danner grunnlaget for gapet mellom prekliniske og kliniske resultater12eksisterende.
Gitt ovenfor, har interessen for pasient-avledede primære kulturer økt13. Faktisk reduserer eksisjon av ondsinnethet og normalt vev risikoen for å miste kreft cellen fenotypen og heterogenitet, dermed tilby utgangsmaterialet som er mer representativt for svulst microenvironment. Videre kan bruk av fersk svulst høstet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection vi undersøke enkelt svulster og sammenligne ulike lesjoner fra samme del av pasientens kropp14. Av ovennevnte årsaker gir vev-avledet cellekulturer et verdifullt materiale for å studere svulst patofysiologi og farmakologi15,16,17, spesielt i m som kommersielt tilgjengelig sarkomspesialitet linjer er begrenset18. Vi dermed optimalisert en metode for å etablere en pasient-avledede STS primære cellekultur fra inngrep forbrukeravgift svulst vev13,19,20. Våre metoden består av disaggregating svulst prøven i liten vev fragmenter etterfulgt av natten enzymatisk vev dissosiasjon å få en enkeltcelle suspensjon. Dagen enzymatisk fordøyelsen stoppes ved å legge friske kultur medier og fått suspensjon er filtrert for å fjerne vev fragmenter, celle-aggregat, og overflødig matrix materiale eller rusk. Til slutt, en brøkdel av isolerte kreftceller er cytospinned på glass lysbilder, fast og lagret for nedstrøms analyse rettet mot bekrefter etableringen av STS primære kultur av cytomorphological, immunohistochemical og molekylære cytogenetic evaluering (f.eks fisk analyse av MDM2 forsterkning representerer den standard differensialdiagnose for et godt differensiert liposarcoma og den dedifferentiated liposarcoma) 4. de gjenværende cellene er sådd i en standard monolayer kultur for gene expression profilering og farmakologiske studier. Alle eksperimenter utføres ved hjelp av lav passasje primære kulturer å unngå valg av bestemte kreft subclones og analyseres av en erfaren sarkomspesialitet patolog. Dermed har vi laget en fullstendig menneske STS ex-vivo modell13,19,20. Denne allsidige, lett å håndtere modell kan representere et nyttig verktøy for ulike typer prekliniske forskning, f.eks å identifisere nye molekylære markører for diagnose og prognosen eller å få en dypere forståelse av aktiviteten og mekanismer handlingen av standard og nye legemidler som brukes i forvaltningen av m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
STS celler er isolert fra en svulst masse inngrep forbrukeravgift fra pasienter med STING. Protokollen er godkjent av den lokale etikk og utføres etter god klinisk praksis retningslinjer og erklæring i Helsinki. Alle pasienter ga skriftlig samtykke i studien. Den kirurgiske prøver er analysert av en erfaren sarkomspesialitet patologen og behandlet innen 3 timers operasjon.
1. svulst prøvetaking og behandling:
- Samle svulst prøver ved hjelp av en sarkomspesialitet patologen i en 100-mL steril urin container med 50 mL av DMEM lav glukose medium forseglet med en parafin film.
- Lagre prøver på 4 ° C for maksimalt 3 h etter svulst eksisjon.
- Utføre alle følgende under sterilt vev kultur hette.
- Sterilisere panseret med 70% etanol og bruke sterilt hansker.
- Sterilisere stål inox pinsett med 70% etanol (bruk et sterilt gasbind).
- Fjerne parafin filmen fra beholderen urin og kast.
- Vask utvendig av urin container med 70% etanol.
- Åpne en firkantet Petriskål.
- Åpne beholderen urin og overføre de svulst prøvene i kvadrat Petriskål bruke steriliserte stål inox pinsett.
- Vask svulst prøver med PBS to ganger.
- Åpne sterilt kirurgisk skalpell.
- Fint makulere den svulst prøver i 1-2 mm3 stykker.
- Samle en fjerdedel av totale eksemplet i en 2-mL tube.
- Legg 1 mL av trizol-reagensen (kjøpt) til røret og umiddelbart fryse-80 ° c (prøven vil bli brukt i nedstrøms for STS gene expression evalueringen).
- Hente resten av fint strimlet svulst materiale i en 15-mL tube.
- Legge til 4 mL collagenase type I-løsning (collagenase type jeg er oppløst i PBS, i en konsentrasjon av 4 µg/mL).
- Fortynne collagenase type I-løsning med 4 mL DMEM høy kultur medier (siste konsentrasjon av collagenase typen er 2 µg/mL).
- Lukk den 15-mL tuben og forsegle med parafin film.
- 15-mL tube innlegge en rullende shaker i en inkubator på 37 ° C i gripende forhold i 15 min å aktivere fordøyelsen.
- Etter 15 min lagre røret i rullende shaker under omrøring forhold ved romtemperatur over natten.
- Dagen satt 15-mL tube under sterilt panseret.
- Forsiktig filtrere celle suspensjon gjennom et 100 µm sterilt filter knyttet til toppen av en 50-mL tube.
- Filteren vaskes med DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
- Forkaste 100 µm sterilt filteret, lukke 50 mL tube og sentrifuger 225 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast nedbryting av invertere røret.
- Nytt suspendere cellene med 1-2 mL DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
Merk: Volumet avhenger av mengden av svulst eksempel behandlet. - Telle celler med en Neubauer kammer.
- Fortynne eksempel 1:2 i trypan blå og bruke 10 µL av fortynning telle celler.
- Telle minst to ganger og beregne gjennomsnittet av replikat vite gjennomsnittlig antall celler samlet.
- Plate celler i en standard monolayer kultur på en tetthet 80 000 celler/cm2.
Merk: Alltid inkludere kontroller eksperimenter. Utføre minst 3 teknisk gjentak for hver tilstand. Utføre minst 2 biologiske gjentak. Prekliniske farmakologi, genuttrykk og protein uttrykk analyser, bør eksperimenter utføres med et lavt antall kultur passasjer innen 30-45 dager celle frø for å unngå å miste kreft cellen fenotyper. - Fargemaskin eksempel forberedelse.
- Samle 100 000 celler i 200 µL DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
- Pipetter løsningen (200 µL pipette) inn et engangs trakten utstyrt med et filter og montert med et glass lysbilde.
- Åpne cytocentrifuge og sette inn prøvene.
- Kjøre cytocentrifuge 18.6 x g for 20 min.
- Kast trakten utstyrt med filteret.
- Fix lysbildene i aceton på 10 min etterfulgt av kloroform i 5 min.
- Lagre lysbilder på 20 ° C.
Merk: Tine og hydrat prøvene før farging og utføre den flekker følge instruksjonene fra produsenten. Forbered minst 3 teknisk gjentak.
2. M cellekulturer:
- Endre media en gang i uken (DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin).
- Kast kultur medium med en 200-1000 µL pipette.
- Legge til nye friske mediet bruker en 200-1000 µL pipette.
- Cellen passasje:
- Koble celler når der er rundt 90%:
Merk: STS celle kultur forsterkning bør utføres en gang i uken basert på kultur betingelsene. - Forkaste medium, vask med PBS og legge 2-3 mL av trypsin 1 x i PBS
Merk: Volumet av trypsin brukes, avhenger av mengden kulturperler celler innhentet. - Inkuber celler for 3-5 minutter på 37 ° C.
- Samle frittliggende celler fra platen med en 200-1000 µL pipette.
- Pipetter frittliggende cellene i en 15-mL tube og legge 4 mL DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
- Sentrifuge 225 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast nedbryting.
- Nytt suspendere celle pellet ved å legge til 1 mL av DMEM høy kultur medier med 10% fosterets bovin serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
- Frø cellene i en ny kultur plate eller en kolbe med siste volum i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Ikke dele celler mer enn 1:3.
- Koble celler når der er rundt 90%:
3. nedstrøms analyser:
Merk: En rekke forskjellige eksperimenter kan utføres ved hjelp av denne modellen (se nedenfor). Det er derfor avgjørende å bestemme under designfasen av studien hvilke analyser utføres slik at et tilstrekkelig antall prøver og gjentak kan tilberedes.
- Spredning analyser som MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
- Apoptotisk analyser som terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick slutten merking (tunnel) analysen
- Immunohistochemical analyse
- Gene expression analyse
- Western blot analyse
- ELISA-analysen
- Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse
- I vivo xenograft modell
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi laget en enkel metode for å skaffe etableringen av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkom og rapportere her et eksempel på resultatene på en bestemt m histotype13. Protokollen ble brukt for etablering av primære kulturer i ulike m histotypes inkludert Reproduksjonsvinduet liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, udifferensierte pleomorphic sarkomspesialitet, GIST og desmoid fibromatosis.
Suksessraten for etablering av primære kulturer var 54% (13 primære kulturer fra 24 STS kirurgisk prøver) for kirurgiske prøver fra pasienter behandlet med kjemoterapi, strålebehandling eller ikke behandles. Derimot var 72% (13 primære kulturer fra 18 STS kirurgisk prøver) for kirurgiske prøver bare fra ubehandlede pasienter.
Kreftceller ble isolert fra en godt-differentiated/dedifferentiated liposarcoma (ALT/DDLPS) kirurgisk fjernet fra en 54 år gammel pasient. MDM2 forsterkning analyse, er utført for standard differensial diagnostisering av ALT/DDLPS og gjennomgått av en erfaren sarkomspesialitet patolog var positive, bekrefter tilstedeværelsen av en ALT/DDLPS lesjon (figur 1A). Fargemaskin analyse MDM2 forsterkning i isolerte kreftceller bekreftet etableringen av en pasient-avledede ALT/DDLPS primære kultur (94.6% av kultivert celler var positivt for MDM2 forsterkning) (figur 1B). Den primære kulturen fortsatte å spre etter passasjer i standard monolayer kulturer og celle levedyktighet ble overvåket av MTT og tunnel analysen.
Denne modellen aktivert vi tester følsomheten av ALT/DDLPS primære kultur på ulike medikamenter brukt eller under klinisk evaluering for behandling av ALT/DDLPS som ifosfamide (IFO), epirubicin (EPI), kombinasjonen IFO + EPI, trabectedin (TRABE), og eribulin (ERI), utføres med MTT analysen. Resultatene bekrefter følsomheten av kulturer til kjemoterapi (figur 2A). Den mest aktive behandlingen var IFO + EPI, en første-linje behandling brukes i avansert eller metastatisk ALT/DDLPS. Videre ble celle morfologi undersøkt etter narkotika eksponering, resultater ing morfologiske endringer i den primære kulturen med hensyn til kontroll og resultatene av cytotoksiske analysen (figur 2B). Som nevnt i protokollen, kan flere nedstrøms analyser utføres med denne modellen. Figur 3 gir en skjematisk fremstilling av metoden og inkluderer en tidslinje som eksperimentene som skal utføres for å oppnå translasjonsforskning resultat.
Figur 1 . Etablering av pasient-avledede primære kultur ALT/DDLPS. A) In situ hybridisering (fisk) utført for å oppdage MDM2 forsterkning i en pasient vev prøven (100 X bildet). B) In situ hybridisering (fisk) utført for å oppdage MDM2 forsterkning i en primær kultur (100 X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kjemoterapi i en ALT/DDLPS primære kultur. A) cellene ble behandlet med: ifosfamide (IFO), epirubicin (EPI), IFO + EPI, trabectedin (TRABE), og eribulin (ERI). Tre uavhengige gjentak ble utført for hvert eksperiment. Dataene er presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil (SE), som nevnt, med n som angir antall gjentak. Forskjeller mellom gruppene ble vurdert av en tosidige Student t-test, * p < 0,05. B) bilder av ALT/DDLPS primære kultur etter narkotika eksponering (2 X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : STS primære kultur modell. Skjematisk fremstilling av prekliniske modellen STS primære kultur inkludert tidslinjen og mulig nedstrøms analysene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veldefinert prekliniske modeller for å belyse molekylær bakgrunnen av svulster forutsi dårlig prognose og utvikle nye strategier for kreftpasienter. Dette er spesielt viktig for sjeldne svulster STS som høy heterogenitet i morfologi, aggressiv potensial, og kliniske atferd utfordringer vår forståelse av STS biologi og pasient ledelse21. Videre de få kommersielle sarkomspesialitet celle linjene tilgjengelig begrenser prekliniske undersøkelser i denne gruppen av mesenchymal svulster18. Ex vivo modellene representerer dermed en verdifull forskning ressurs for STS. Vi utviklet en fullstendig menneske i vitro modell m fra kirurgisk resected tumor vev (Figur 3). Under optimalisering metoden, var flere kritiske spørsmålene tas opp og løses. Det første problemet bekymret tidsintervallet mellom kirurgisk behandling og eksempel behandling. Først da svulst prøver kom våre biosciences laboratory etter en viss tid, var de lagret over natten på 4 ° C og behandlet neste dag. STS celler isolert fra disse prøvene utstilt lav spredning aktivitet og dårlig levedyktighet i standard monolayer kultur. Dette kan delvis tilskrives faktum at hele svulst prøven er holdt i en lengre periode i urin container før behandles. Vi dermed endret starttidspunktet for prøven behandling til maksimalt 3 h etter operasjonen for å sikre at den primære kulturen fortsatte å spre i standard monolayer kultur og viser god levedyktighet. Vi har også optimalisert celle disaggregation prosessen: liten homogen vev fragmenter er nødvendig for å lette enzymatisk fordøyelsen, og dette ble oppnådd ved hjelp av en skalpell. Videre, selv om protokollen arbeidet med prøver av forskjellige størrelser, etablering av en primære kultur fra av begrenset størrelse (< 2 cm) er vanskeligere å oppnå. Collagenase konsentrasjonen var en annen viktig sak fordi for høy anenzyme konsentrasjon kan forårsake mobilnettet stress, fører til fenotypiske endringer i STS primære kultur eller en nedgang i svulst celle overlevelse. God enzymatisk fordøyelse er nødvendig å skille celler fra matrix materiale og rusk. Vi endelig optimalisert enzym konsentrasjonen bruke i fordøyelsen fase. Videre å begrense mobilnettet stress og skaffe næringsstoffer for STS celler i isolasjon fasen suspendert vi re enzymet i kultur medier i stedet for andre reagenser som PBS. Til slutt avslørte flere eksperimenter utført på forskjellige STS primære kulturer som liposarcoma og myxofibrosarcoma endringer i genuttrykk over tid og økt følsomhet for kjemoterapi13,20. Disse funnene er knyttet til langvarig kultur pasient-avledede STS celler i et monolayer system med et økende antall passeringer, begge som induserer fenotypiske og genetiske drift. Redusere påliteligheten til dette kultur-systemet over tid å recapitulate tumor vev, som tidligere vist, representerer en av de viktigste begrensningene for ex vivo modeller22,23. Vi dermed optimalisert protokollen reduserer i å utføre eksperimenter (innen 30-45 dager av svulst celle seeding) og bruker lav passasje kulturer for å oppnå reproduserbare og translasjonsforskning resultater. Videre de primære kulturene kan fryses, men deres påfølgende levedyktighet er avhengig av flere faktorer, inkludert svulst beliggenhet, STS histotype, mengden av kirurgiske prøven og antall kultur passasjer utført.
Systemet har mange fordeler, i.e. det er en fullstendig menneske prekliniske modell, i motsetning til andre Trouble-baserte sarkomspesialitet cellen linje modeller24,25,26,27. Videre mens bekreftelse av etableringen av STS primære kulturer, oppnås ved cytomorphological, immunohistochemical og molekylære cytogenetic evaluering, er med støtte fra en erfaren sarkomspesialitet patolog obligatorisk i vårt protokollen , dette er ikke alltid tilfelle for andre STS primære kultur modeller. I noen papirer, ble nedstrøms analyse av celler fra kirurgisk eksemplarer utført uten å bekrefte diagnosen m celle prosenten i de primære kulturer28. Vårt system er også allsidig, reproduserbare og kan brukes til å utføre en rekke eksperimenter. Videre kan celle såing, og eksterne stimuli endres for å studere spesifikke funksjoner og svar. Utviklingen av denne modellen aktivert vi følsomheten til pasient-avledede STS celler på ulike medikamenter brukt eller under klinisk evaluering for behandling av m. Denne modellen, derfor representerer et viktig prekliniske verktøy for å forutsi respons på behandling og hvis ytterligere optimalisert, kan potensielt brukes til å forbedre personlig terapi. Det kan også brukes til å identifisere diagnostiske eller prognostiske molekylære markører, spesielt viktig omg hvor noen bestemt biomarkers er tilgjengelig. En av begrensningene av protokollen er den relativt korte tiden utføre nedstrøms etter etablering av primære kulturen. Protokollen kan forbedres ved å utføre gene expression profilering og klynger analyse for både svulst og primære kulturer stammer fra samme pasient over tid å vurdere kapasitet av primære kulturen å etterligne heterogenitet av tumor vev, spesielt for de m histotypes som en diagnostisk markør ikke er tilgjengelig. Slike analyser vil også bidra til ytterligere karakterisere hvordan cellene i innhentet kulturen avvike fra de som stammer direkte fra svulst prøver.
Avslutningsvis er etableringen av robust prekliniske modeller essensielt for å drive vår forståelse av svulst patologi. Vi tror at vår modell vil bidra til å avdekke molekylære mekanismer som er ansvarlig for dårlig prognose m og bidrar til identifisering av nye strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Gráinne Tierney for redaksjonell bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
