Summary
Следующий протокол фокусируется на создании основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные (STS). Эта модель может помочь нам лучше понять молекулярных фон и фармакологические профиль этих редких злокачественных опухолей и может стать отправной точкой для дальнейших исследований, направленных на совершенствование управления STS.
Abstract
Сарком мягких тканей (STS) представляют спектр гетерогенных злокачественных опухолей с сложный диагноз, классификации и управления. К настоящему времени было выявлено более чем 50 гистологических подтипов этих редких солидных опухолей. Таким образом ввиду их чрезвычайного разнообразия и низкий уровень заболеваемости, наше понимание биологии этих опухолей по-прежнему ограничен. Пациент производные культуры представляют собой идеальную платформу для изучения патофизиологии STS и фармакологии. Таким образом мы разработали человека доклинических модель STS, начиная от опухоли образцы заготавливаемым от пациентов, перенесших хирургической резекции. Пациент производные STS клеточных культур были получены от хирургического образцов коллагеназы пищеварение и изоляции путем фильтрации. Клетки были подсчитаны, семенами и оставили на 14 дней в стандартных монослоя культур и затем обрабатывается течению анализа. Прежде чем выполнять молекулярные или фармацевтического анализа, создание STS первичных культур было подтверждено путем оценки cytomorphologic функций и, при наличии, иммуногистохимических маркеров. Этот метод представляет собой полезный инструмент 1) для изучения естественной истории эти плохо изучены злокачественных опухолей и 2) для проверки воздействия различных наркотиков в попытке узнать больше об их механизмов действий.
Introduction
Сарком мягких тканей (STS) включают в себя спектр гетерогенных поражения мезенхимальных происхождения приходится 1% всех твердых опухолей1,2, и новой классификации Всемирной организации здравоохранения признает наличие более чем 50 3различные подтипы. Среди них наиболее распространенными histotypes являются Адипоцит саркома или липосаркома и лейомиосаркома, приходится 15% и 11% всех взрослых STS, соответственно4,5. Хотя STS может развиваться в различных частях тела, конечностей и retroperitoneum являются наиболее распространенными сайты, происходящих в 60% и 20% случаев, соответственно6.
Краеугольным камнем терапии для локализованных болезни является широкая хирургической резекции, тогда как преимущества адъювантов и неоадъювантной химиотерапии остаются неясными и рассматриваются только в отдельных случаях7. В параметре метастазами, химиотерапии является стандарт медицинской помощи, но показывает ограниченные результаты8. Лучшего понимания молекулярной биологии STS поможет улучшить текущий дифференциальной диагностики, оптимизации имеющихся методов лечения и выявления новых мишеней для терапии.
В этом контексте исследования рака была выполнена в течение многих лет с помощью увековечен клеток линии9. Эти экспериментальные модели обычно культивировали в стандартных монослоя поддерживает или имплантируется в иммунодефицитных грызунов учредить в vivo ксенотрансплантата моделей10. Увековечен клеточных линий представляют управляемой и легкий к магазине материал, с которым могут выполняться достаточное количество научных экспериментов. Они являются, по сути, наименее дорогостоящим и наиболее широко используемым инструментом в доклинических исследованиях11.
Однако на основе линии клетки рака модели также имеют некоторые ограничения, например продлен культуры в системе монослоя вместе с все большее число проходов индуцирует фенотипических и генетического дрейфа, изготовление клеток менее вероятно резюмировать ключевые опухоли особенности. Кроме того культуры клеток линии не воспроизводить взаимодействие в ячейке и сигнальной молекулы перекрестных помех, которые имитируют биологического поведение опухоли и характеризуют микроокружения опухоли. Эти вопросы образуют основу разрыв, существующий между доклинические и клинические результаты12.
Учитывая вышесказанное,13возрос интерес к пациенту, полученных первичных культур. Действительно эксцизии злокачественных и нормальной ткани, снижает риск потерять фенотипа клетки рака и неоднородности, таким образом предлагая исходного материала, который является более представительным микроокружения опухоли. Кроме того использование свежих опухоли образцов заготавливаемым от пациентов, перенесших хирургическая резекция позволяет нам исследовать один опухоли и сравнить различные поражения от той же части тела пациента в14. По указанным выше причинам культуры клеток ткани производные обеспечивают ценный материал для изучения опухоли патофизиологии и фармакологии15,16,17, особенно в STS в котором коммерчески доступных саркома клеточных линий являются ограниченный18. Таким образом, мы оптимизировали метод, чтобы установить пациента производный STS первичной культуре клеток начиная с хирургическим подакцизным опухоль ткани13,19,20. Наш метод состоит из разбивки образца тумора в небольшие фрагменты тканей следуют ночи диссоциации ферментативные ткани для получения одной ячейки подвеска. На следующий день, ферментативного пищеварения остановлена, добавляя свежий культуры средств массовой информации и полученных подвеска фильтруется, чтобы удалить фрагменты тканей, клеток агрегаты и избыток матрица материала или мусора. Наконец часть изолированного опухолевых клеток является cytospinned на стеклянных вставках, фиксированной и хранится вниз по течению анализа, направленного на подтверждение создания STS основной культуры Цитоморфологическое, иммуногистохимических и молекулярных цитогенетических оценки (например рыбы анализ MDM2 амплификации представляет стандартный дифференциальной диагностики для хорошо дифференцированная липосаркома и Дедифференцированная липосаркома) 4. остальные ячейки будут посеяны в стандартной монослойном культивировании ген выражение профилирования и фармакологических исследований. Все эксперименты проводятся с использованием низких проход первичных культур, чтобы избежать выбора конкретных рака subclones и проанализированы саркома опытных патологоанатом. Таким образом, мы создали полностью человека STS экс vivo модель13,19,20. Это очень универсальный, легко ручка модель может стать полезным инструментом для различных типов доклинических исследований, например для выявления новых молекулярных маркеров для диагностики и прогноза или получить более глубокого понимания деятельности и механизмы действие, стандартных и новых препаратов, используемых в управлении STS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
STS клетки изолированы от опухоль массы хирургически иссечена от пациентов с STS. Протокол был одобрен местного комитета по этике и производится в соответствии с руководящими принципами надлежащей клинической практики и Хельсинкской декларации. Все пациенты дал письменного информированного согласия на участие в исследовании. Хирургическое образцы проанализированы саркома опытных патологоанатом и обрабатываются в течение 3 часов после операции.
1. опухоли образца сбор и обработка:
- Собирайте образцы опухоли с помощью патологоанатом саркомы в контейнере 100 мл стерильной мочи с 50 мл средний низкий глюкозы DMEM опечатаны с парафином фильм.
- Храните образцы на 4 ° C для максимум 3 ч после резекции опухоли.
- Выполните все следующие действия под капотом стерильных культуры ткани.
- Стерилизовать капот с 70% этанола и стерильных перчатках.
- Стерилизуйте пинцета сталь inox с 70% этанола (используйте стерильные марлевые).
- Снимите пленку парафин из контейнера мочи и отбросить.
- Промойте внешний моче контейнера с 70% этиловом спирте.
- Откройте квадратный Петри.
- Откройте контейнер мочи и передавать образцы опухоли в квадратных Петри с помощью пинцета стерилизованные сталь inox.
- Стирайте образцы опухоли с PBS дважды.
- Откройте стерильные хирургические скальпель.
- Мелко измельчать образцы опухоли в3 части 1-2 мм.
- Собирайте одна четверть общей выборки в 2-мл пробирку.
- Добавьте 1 mL реагента Тризол (приобретенные) на трубу и немедленно заморозить на-80 ° C (образец будет используется в течению анализа для оценки выражения гена STS).
- Соберите остальнои мелко измельченных опухоли материала в 15 мл.
- Добавить 4 мл коллагеназы типа решения (коллагеназа типа я растворен в PBS, при концентрации 4 мкг/мл).
- Разбавить коллагеназы типа решения с 4 мл DMEM, высокой культуры средств массовой информации (конечная концентрация коллагеназы тип I является 2 мкг/мл).
- Закройте 15 мл и печать с парафином фильм.
- Положите 15 мл в шейкере переходящего в инкубаторе при 37 ° C в перемешивания условий для 15 минут, чтобы активировать пищеварение.
- После 15 минут Храните трубки в прокатки шейкер под помешивая условий при комнатной температуре на ночь.
- Следующий день поставить 15 мл под капотом стерильные.
- Аккуратно фильтрации суспензии клеток через 100 мкм стерильным фильтр прилагается к верхней части 50 мл.
- Промойте фильтр с DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Отказаться от 100 мкм стерильным фильтром, закрыть тюбик 50 мл и центрифуги на 225 x g 5 минут при комнатной температуре.
- Отказаться от супернатанта, инвертирование трубки.
- Вновь приостановить клетки с 1-2 мл DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
Примечание: Объем зависит от размера опухоли образца обработки. - Подсчет количества ячеек с камерой Нойбауэр.
- Разбавить образец 1:2 в Трипановый синий и использовать 10 мкл разбавлением для подсчета клеток.
- Рассчитывать по крайней мере дважды и вычислить среднее реплицирует знать общее среднее количество собранных клеток.
- Плита клетки в стандартной монослойном культивировании на плотности 80 000 клеток/см2.
Примечание: Всегда включайте элементы управления в экспериментах. Выполните по крайней мере 3 технических репликация для каждого условия. Выполните по крайней мере 2 биологических реплицирует. Для доклинических фармакологии, экспрессии генов и анализ выражения протеина с небольшим числом культуры проходов должно осуществляться эксперименты в течение 30-45 дней клетки посева, чтобы избежать потери рака клеток фенотипов. - Цитологические пробоподготовки.
- Соберите 100000 клеток в 200 мкл DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Пипеткой раствор (200 мкл пипеткой) в одноразовых воронку с фильтром и смонтированы с на стеклянное скольжение.
- Откройте cytocentrifuge и вставьте образцов.
- Запустите cytocentrifuge на 18,6 x g 20 мин.
- Выбросите воронку с фильтром.
- Исправьте слайды в ацетоне за 10 мин, следуют метилхлороформа за 5 мин.
- Хранить слайды при температуре-20 ° C.
Примечание: Размораживание и гидрата образцов до окрашивания и выполняют окрашивание следуя инструкциям производителя. Подготовьте по крайней мере 3 технических реплицирует.
2. STS клеточных культур:
- Изменить СМИ раз в неделю (DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и пенициллин/стрептомицина 1%).
- Отказаться от питательной среды с помощью пипетки 200-1000 мкл.
- Добавьте новые свежие носитель с помощью пипетки 200-1000 мкл.
- Прохождение ячейки:
- Отсоедините клетки при впадении составляет около 90%:
Примечание: Усиление культуры клеток STS должны выполняться один раз в неделю на основе условий культуры. - Отказаться от среднего, мыть с PBS и добавить 2-3 мл трипсина 1 x в PBS
Примечание: Объем используемых трипсина зависит количество культивируемых клеток, полученных. - Инкубировать клетки для 3-5 минут при 37 ° C.
- Соберите отдельные клетки от пластины с помощью пипетки 200-1000 мкл.
- Пипетка отдельные клетки в 15 мл трубку и добавить 4 мл DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина остановить ферментативной реакции.
- Центрифуга на 225 g x 5 мин при комнатной температуре.
- Выбросите супернатант.
- Вновь приостановите Пелле ячейки, добавив 1 мл DMEM высокой культуры средств массовой информации дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Заполнение ячеек в новой культуры пластины или колбу с окончательный объем согласно инструкциям производителя.
Примечание: Не разделять клетки более 1:3.
- Отсоедините клетки при впадении составляет около 90%:
3. вниз по течению анализы:
Примечание: Целый ряд различных экспериментов может осуществляться с использованием этой модели (см. ниже). Таким образом, важно решить на этапе проектирования, исследования, какие анализы будет осуществляться таким образом, чтобы можно было подготовить достаточное количество образцов и реплицирует.
- Анализы распространения таких МТТ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромид
- Apoptotic анализов например трансферазы deoxynucleotidyl терминала (TdT) Ник конце маркировки assay (TUNEL)
- Иммуногистохимический анализ
- Анализ выражения гена
- Западный анализ помаркой
- ELISA пробирного
- Активирован флуоресценции клеток, сортировка (FACS) анализ
- В естественных условиях ксенотрансплантата модель
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы разработали простой метод для получения создание основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные и сообщить здесь пример результатов, полученных на одной конкретной STS histotype13. Протокол был использован для создания первичных культур различных histotypes STS, включая хорошо дифференцированная липосаркома, Дедифференцированная липосаркома, миксоидная липосаркома, плеоморфные липосаркома, myxofibrosarcoma, недифференцированный плеоморфные саркома, ГИСТ и десмоид фиброматоз.
Коэффициент успеха для создания первичных культур составила 54% (13 первичных культур от 24 STS хирургические образцов) для хирургического образцов, полученных от пациентов лечили химиотерапии, лучевой терапии или не лечить. И наоборот было 72% (13 первичных культур от 18 STS хирургические образцов) для хирургического образцов, полученных только от без лечения пациентов.
Опухолевые клетки были изолированы от хорошо differentiated/Дедифференцированная липосаркома (ALT/DDLPS), хирургически удалены от 54-летнего пациента. MDM2 амплификации анализа, в настоящее время выполняется для стандартной дифференциальной диагностики ALT/DDLPS и рассмотрены опытных саркома патологоанатом, был положительным, подтверждающий присутствие ALT/DDLPS поражения (рис. 1A). Цитологическое исследование MDM2 амплификации в изолированных опухолевых клеток подтвердил создание пациента производные ALT/DDLPS основной культуры (94,6% культивируемых клеток были положительными для амплификации MDM2) (рис. 1Б). Основная культура продолжала распространяться после проходы в стандартных монослоя культур и жизнеспособность клеток контролируется МТТ и Tunel assay.
Эта модель позволяет нам проверить чувствительность ALT/DDLPS основной культуры различных препаратов, которые в настоящее время используется или под клинической оценки для лечения ALT/DDLPS Ифосфамид (IFO), Эпирубицин (РПИ), сочетание IFO + Эпи, trabectedin (TRABE), и eribulin (ERI), выполняются с помощью анализа МТТ. Результаты подтвердили чувствительность культур к химиотерапии (рисA). Наиболее активные лечения был IFO + EPI, первой линии терапии, используемых в расширенной или метастатической ALT/DDLPS. Кроме того был рассмотрен морфологии клеток после воздействия наркотиков, результаты ыть морфологические изменения в основной культуры в отношении управления и выводы цитотоксические пробы (рис. 2B). Как указано в протоколе, несколько ниже по течению анализ может выполняться с этой моделью. Рисунок 3 содержит схематическое представление метода и сроки, в течение которого эксперименты для получения трансляционная результаты.
Рисунок 1 . Создание производных пациента основной культуры ALT/DDLPS. A) In situ гибридизация (рыба) выполняется для выявления MDM2 амплификации в образец ткани пациента (100 X изображение). B) In situ гибридизация (рыба) выполняется для обнаружения MDM2 амплификации в первичной культуре (100 крат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Химиотерапия в первичной культуре ALT/DDLPS. A) клетки обрабатывали: Ифосфамид (IFO), Эпирубицин (РПИ), IFO + Эпи, trabectedin (TRABE) и eribulin (ERI). Три независимых реплицирует проводились для каждого эксперимента. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка (SE), как говорится, с указанием количества реплицирует n. Различия между группами были оценены студентом двустороннее t-теста, * p < 0,05. B) изображения ALT/DDLPS основной культуры после воздействия наркотиков (увеличение 2 X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Модель первичной культуре STS. Схематическое представление доклинические модели STS основной культуры, включая сроки и возможные анализы, вниз по течению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Четко определены доклинических модели необходимы для прояснения молекулярных фон опухоли, предсказать плохой прогноз и развивать новые терапевтические стратегии для больных раком. Это особенно важно для редких опухолей, таких как STS, чья высокая неоднородность морфологии, агрессивное поведение потенциал и клинических задач наше понимание биологии STS и пациента управления21. Кроме того несколько коммерческих саркома клеточных линий доступны ограничивает доклинические исследования в этой группе мезенхимальные опухоли18. Ex vivo модели таким образом представляют собой ценный исследовательский ресурс для STS. Мы разработали модель полностью человека в vitro STS, начиная от хирургической резекции опухолевой ткани (рис. 3). Во время оптимизации метода несколько важнейших вопросов были рассмотрены и решены. Первая проблема касается временной интервал между хирургического лечения и обработки образцов. Первоначально когда опухоль образцов прибыл в нашей лаборатории бионаукам после определенного времени, они хранятся на ночь при 4 ° C и обработаны на следующий день. STS клетки изолированы от этих образцов выставлены низкие распространения деятельности и бедных жизнеспособности в стандартных монослойном культивировании. Это может частично объяснить тот факт, что всей опухоли образца хранится в течение длительного периода времени в моче контейнера перед обработкой. Мы таким образом изменено время запуска образца обработки максимум 3 ч после операции для обеспечения продолжения основной культуры размножаются в стандартных монослойном культивировании и хорошая жизнеспособность. Мы также оптимизировали процесс дезагрегирования клеток: для облегчения ферментативного пищеварения необходимы небольшие однородные фрагменты тканей, и это было достигнуто с помощью скальпеля. Кроме того, хотя протокол работал с образцами различных размеров, создание основной культуры, начиная от образцов ограниченный размер (< 2 см) более трудно достичь. Коллагеназы концентрация была еще один важный вопрос, потому что anenzyme слишком высокой концентрации могут вызвать клеточного стресса, приводит к фенотипические изменения в культуре первичных STS или уменьшение выживаемость клеток опухоли. Для разделения клетки от материала матрицы и мусора требуется хорошая ферментативного пищеварения. Наконец, мы оптимизировали концентрации фермента для использования в процессе пищеварения. Кроме того ограничить клеточного стресса и обеспечивают питательные вещества для STS клеток во время этапа изоляции мы вновь приостановил фермента в культуре средств массовой информации вместо других реагентов, таких как PBS. Наконец некоторые эксперименты, проведенные на различные STS основных культур, таких как липосаркома и myxofibrosarcoma показали изменения в экспрессии генов со временем и повышенная чувствительность к химиотерапии13,20. Эти результаты объясняются длительного культуры клеток пациента производные STS в монослое системы вместе с все большее число проходов, оба из которых побудить фенотипических и генетического дрейфа. Снижение надежности системы этой культуры со временем резюмировать опухолевой ткани, как уже было показано, представляет собой один из наиболее важных ограничений ex vivo модели22,23. Мы таким образом оптимизирован Протокол путем уменьшения времени, в котором для выполнения экспериментов (в течение 30-45 дней посев опухолевых клеток) и с помощью низкий проход культур для получения воспроизводимых и трансляционная результатов. Кроме того основной культуры могут быть заморожены, но их последующее жизнеспособность зависит от нескольких факторов, включая расположение опухоли, STS histotype, количество хирургического образца и количество культуры проходов выполнена.
Наша система имеет ряд преимуществ, т.е. это полностью человека доклинических модель, в отличие от других на основе мышиных саркома клеток линии модели24,25,26,27. Кроме того в то время как подтверждение создания STS первичных культур, достигнутые Цитоморфологическое, иммуногистохимических и молекулярных цитогенетических оценки, при поддержке опытных саркома патологоанатом, является обязательным в наш протокол , это не всегда так для других моделей STS основной культуры. В некоторых документах течению анализ клеток, оправился от хирургического образцов была выполнена без подтверждения процент клеток диагноз STS в основной культуры28. Наша система также является универсальным, воспроизводимые и может использоваться для выполнения различных экспериментов. Кроме того заполнение ячеек и внешние раздражители могут быть изменены для изучения особенностей и ответы. Разработка этой модели позволило нам изучить чувствительность пациента производные STS клеток различных препаратов, которые в настоящее время используется или под клинической оценки для лечения STS. Эта модель, таким образом, является важным доклиническое инструментом для прогнозирования ответа на терапию и, если дополнительно оптимизирован, потенциально могут использоваться для улучшения персонализированной терапии. Он также может использоваться для идентификации диагностических и прогностических молекулярных маркеров, особенно важно в STS, где имеются несколько конкретных биомаркеров. Один из недостатков протокола является относительно короткий период времени для выполнения течению анализа после создания основной культуры. Протокол может быть улучшена путем выполнения профилирования выражение гена и кластеризации анализ для опухоли и основных культур, полученных от той же пациентки со временем для оценки способности основной культуры для имитации неоднородность опухолевой ткани, особенно для тех STS histotypes, для которых диагностические маркер не доступен. Такой анализ поможет также далее характеризуют как клетки в культуре полученные отличаются от производные непосредственно от опухоли образцов.
В заключение создание надежной доклинических моделей имеет важное значение для продвижения нашего понимания патологии опухоли. Мы считаем, что наша модель поможет выявить молекулярные механизмы, которые отвечают за плохой прогноз STS и будет способствовать выявлению новых терапевтических стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Грайне Тирни для редакционной помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
