Summary
以下协议的重点是建立一个初级文化的病人衍生软组织肉瘤 (STS)。该模型可以帮助我们更好地了解这些罕见的恶性肿瘤的分子背景和药理学特征, 并可作为进一步研究的出发点, 以改善 STS 管理。
Abstract
软组织肉瘤 (STS) 是一种非均质恶性肿瘤, 具有诊断、分类和管理的难度。迄今为止, 已经发现了这些罕见的实体肿瘤的50多种组织学亚型。因此, 由于其独特的多样性和低发病率, 我们对这些肿瘤生物学的理解仍然有限。患者源性培养是研究 STS 病理生理学和药理学的理想平台。因此, 我们开发了一个人类临床前模型的 STS 开始从肿瘤标本采集的病人进行手术切除。采用胶原酶消化和过滤分离的方法, 从手术标本中获得患者源性 STS 细胞培养。细胞计数, 种子, 并在标准单层培养14天左右, 然后由下游分析处理。在进行分子或药物分析之前, 通过对 cytomorphologic 特征的评估, 并在可用时免疫组化标记, 确定 STS 初级文化的建立。这个方法代表了一个有用的工具 1) 来研究这些探索性的恶性恶性肿瘤和2的自然历史, 以测试不同药物的影响, 以努力了解更多有关其行动机制。
Introduction
软组织肉瘤 (STS) 包括一组骨髓间质来源的异质性病变, 占所有实体肿瘤的 1%,1,2, 新的世界卫生组织分类确认存在超过50不同的子类型3。其中, 最常见的 histotypes 是脂肪肉瘤或肉瘤和平滑肌肉瘤, 占所有成人 STS 的15% 和 11%, 分别为4,5。虽然 STS 可以发展在身体的不同部分, 四肢和腹腔是最常见的网站, 发生在60% 和20% 的情况下, 分别为6。
治疗局部性疾病的基石是广泛的外科手术切除, 而佐剂和新辅助化疗的好处仍然不清楚, 仅在选定的病例中考虑7。在转移设置中, 化疗是治疗的标准, 但结果显示有限的效果8。更好地了解 STS 的分子生物学将有助于改善目前的鉴别诊断, 优化现有的治疗方法, 并确定新的治疗目标。
在这种背景下, 使用永生化细胞系9进行了多年的癌症研究。这些实验模型通常在标准单层支持或植入 immunodeficient 啮齿动物中培养, 以建立体内异种移植模型10。永生化细胞系代表一种易于管理和容易储存的材料, 可以进行大量的研究实验。事实上, 它们是临床前研究的最便宜和最广泛使用的工具11。
然而, 基于细胞线的癌症模型也有一些局限性,例如在单层系统中长时间的培养以及越来越多的通道诱导表型和遗传漂移, 使细胞不太可能重述关键肿瘤特征。此外, 细胞系的培养不能重现细胞间的相互作用和信号分子串扰, 模仿肿瘤的生物学行为和特征的肿瘤微环境。这些问题构成临床前和临床结果之间存在的差距的基础12。
鉴于上述情况, 对患者派生的初级文化的兴趣增加了13。事实上, 切除恶性和正常组织降低了失去癌细胞表型和异质性的风险, 从而提供了更具代表性的肿瘤微环境的起始材料。此外, 使用从手术切除病人身上采集的新鲜肿瘤标本, 我们可以调查单个肿瘤, 并比较患者身体同一部位的不同病变14。基于上述原因, 组织衍生细胞培养物为研究肿瘤病理生理学和药理学15,16,17, 特别是在 STS 中提供了一种有价值的材料, 可用于商业上可用的肉瘤细胞系。受限18。因此, 我们通过手术切除肿瘤组织13,19,20, 优化了建立病人派生的 STS 原细胞培养的方法。我们的方法包括将肿瘤标本分列到小组织片段, 然后用隔夜酶组织离解来获得单个细胞悬浮。第二天, 通过添加新鲜培养基停止酶消化, 并过滤得到的悬浮物以去除组织碎片、细胞团聚体和过量基质物质或碎片。最后, 将一小部分分离的肿瘤细胞 cytospinned 到玻璃滑梯上, 固定存放, 用于下游分析, 目的是通过项细胞形态、免疫组化和分子细胞遗传学评价确定 STS 原代培养的建立。(例如MDM2 放大的鱼分析代表区分良好的肉瘤和去分化肉瘤肉瘤的标准鉴别诊断)4. 其余的细胞被播种成一个标准的单层培养基因表达谱和药理学研究。所有的实验都是使用低通道初级培养, 以避免选择特定的癌症 subclones, 并分析了经验丰富的肉瘤病理学家。因此, 我们创建了一个完全人类 STS前体模型13,19,20。这种高通用性、易于处理的模型可以代表不同类型的临床前研究的有用工具,例如确定新的诊断和预后分子标记, 或加深对其活动和机制的了解。标准和新药在 STS 管理中的作用。
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Protocol
sts 细胞与由 sts 患者手术切除的肿瘤肿块分离。该议定书已得到当地道德委员会的批准, 并根据良好的临床实践指导方针和赫尔辛基宣言进行。所有患者都给予书面知情同意, 参加该项研究。手术标本由经验丰富的肉瘤病理学家分析, 并在3小时内进行手术处理。
1. 肿瘤标本的采集与加工:
- 用100毫升无菌尿液容器中的肉瘤病理学家收集肿瘤标本, 用石蜡膜密封的50毫升 DMEM 低葡萄糖培养基。
- 在肿瘤切除术后, 将样品保存在4摄氏度, 最大值为3小时。
- 在无菌组织培养罩下执行以下步骤。
- 用70% 乙醇消毒罩, 戴上无菌手套。
- 用70% 乙醇消毒钢不锈钢镊子 (使用无菌纱布)。
- 从尿液容器中取出石蜡膜并丢弃。
- 用70% 乙醇清洗尿液容器的外部。
- 打开一个方形的培养皿。
- 用灭菌的钢不锈钢镊子打开尿液容器, 将肿瘤标本转移到方培养皿中。
- 用 PBS 冲洗肿瘤标本两次。
- 打开一把无菌手术手术刀。
- 将肿瘤标本细切成 1-2 毫米3片。
- 收集一个季度的总样本在2毫升管。
- 添加1毫升的 trizol 试剂 (购买) 到管, 并立即冻结在-80 °c (该样本将用于下游分析的 STS 基因表达评估)。
- 收集其余的细粉碎的肿瘤材料在一个15毫升管。
- 添加4毫升胶原酶 i 型溶液 (胶原酶 i 型溶于 PBS, 浓度为4µg/毫升)。
- 用4毫升的 DMEM 高培养基稀释胶原酶 i 型溶液 (胶原酶的最终浓度为2µg/毫升)。
- 关闭15毫升管, 用石蜡膜密封。
- 将15毫升管放入一个在37°c 的孵化器中, 在搅拌条件下, 以15分钟活化消化。
- 在室温搅拌条件下, 在15分钟内将管放入摇床内。
- 第二天把15毫升的管子放在消毒罩下。
- 轻轻地过滤细胞悬浮通过一个100µm 无菌过滤器附着在50毫升管顶部。
- 用 DMEM 高培养基冲洗过滤器, 辅以10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素。
- 丢弃100µm 无菌过滤器, 在室温下关闭50毫升管和离心机, 225 x 克5分钟。
- 通过倒置管来丢弃上清液。
- 重新悬浮细胞与 1-2 毫升 DMEM 高培养基补充10% 胎牛血清, 1% 谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素。
注意:体积取决于肿瘤样品的处理量。 - 用 Neubauer 室数细胞。
- 稀释样品1:2 在台盼蓝和使用10µL 稀释计数细胞。
- 计数至少两次, 并计算复制的平均值, 以了解所收集的单元格的总平均数。
- 标准单层培养中的平板细胞, 密度为8万细胞/厘米2。
注意:在实验中始终包含控件。为每个条件至少执行3个技术复制。至少执行2生物复制。为临床前药理学、基因表达和蛋白质表达分析, 应在细胞播种 30-45 天内进行少量的培养通道, 以避免癌细胞表型的丧失。 - 细胞学样品准备。
- 收集10万个细胞在200µL DMEM 高培养基补充10% 胎牛血清, 1% 谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素。
- 将溶液 (200 µL 吸管) 插入一个装有过滤器并安装在玻璃滑梯上的一次性漏斗中。
- 打开 cytocentrifuge 并插入示例。
- 以 18.6 x g 为20分钟运行 cytocentrifuge。
- 丢弃装有过滤器的漏斗。
- 固定在丙酮10分钟的幻灯片, 其次是氯仿5分钟。
- 将幻灯片存储在摄氏-20 摄氏度。
注意:在染色前解冻并水合样品, 并按照制造商的指示进行染色。至少准备3技术复制。
2. STS 细胞培养:
- 每周更换一次媒体 (DMEM 高培养基培养基补充10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺和1% 青霉素/链霉素)。
- 使用 200-1000 µL 吸管丢弃培养基。
- 使用 200-1000 µL 吸管添加新的新鲜培养基。
- 细胞通道:
- 当汇流约为90% 时, 分离细胞:
注意:STS 细胞培养的扩增应根据培养条件每周进行一次。 - 丢弃培养基, 用 pbs 洗涤, 在 pbs 中加入2-3 毫升的胰蛋白酶1x。
注意:使用的胰蛋白酶量取决于获得的培养细胞的数量。 - 孵育细胞为 3-5 分钟在37°c。
- 用 200-1000 µL 吸管从盘子里收集分离出来的细胞。
- 将分离的细胞注入15毫升管, 加入4毫升的 DMEM 培养基, 补充10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺和1% 青霉素/链霉素, 以停止酶反应。
- 离心机在室温下为 225 x 克, 5 分钟。
- 放弃上清。
- 添加1毫升的 DMEM 培养基, 补充10% 胎牛血清, 1% 谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 重新悬浮细胞颗粒。
- 根据制造商的说明, 在新的培养板或烧瓶中种子细胞。
注意:不要将单元格拆分1:3 以上。
- 当汇流约为90% 时, 分离细胞:
3. 下游分析:
注意:可以使用这个模型进行各种不同的实验 (见下文)。因此, 必须在研究的设计阶段决定进行分析, 以便准备足够数量的样品和复制。
- 增殖测定, 如 MTT 3-(45-dimethylthiazol-2-基)-25-diphenyltetrazolium 溴化物
- 凋亡检测, 如终端 deoxynucleotidyl 转移酶 (TdT) 尼克末端标记 (隧洞) 测定
- 免疫组化分析
- 基因表达分析
- 西方污点分析
- ELISA 检测
- 荧光活化细胞分选 (资产管制) 分析
- 体内异种移植模型
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Representative Results
我们设计了一种简单的方法, 以获得建立一个病人衍生软组织肉瘤的原代培养, 并在此报告一个例子, 取得的结果在一个特定的 STS histotype13。该议定书用于建立不同 STS histotypes 的初级文化, 包括分化良好的肉瘤、去分化肉瘤肉瘤、粘液肉瘤、多形肉瘤、myxofibrosarcoma、未分化多形肉瘤, 要点和硬纤维纤维瘤病。
建立初级文化的成功率是 54% (13 个主要的文化从第二十四个手术样本) 的手术标本的病人治疗化疗, 放疗或不治疗。相反, 它是 72% (13 种主要的文化从第十八手术样本) 的手术样本仅获得的未经治疗的病人。
肿瘤细胞是从一个54岁的病人手术切除的一个分化良好的/去分化肉瘤肉瘤 (ALT/DDLPS) 分离出来的。MDM2 放大分析, 目前执行的标准鉴别诊断 alt/DDLPS 和审查由经验丰富的肉瘤病理学家, 是积极的, 确认存在 ALT/DDLPS 病变 (图 1A)。MDM2 扩增在孤立肿瘤细胞中的细胞学分析证实建立了患者衍生的 ALT/DDLPS 原代培养 (94.6% 的培养细胞是阳性的 MDM2 放大) (图 1B)。在标准单层培养的通道后, 原代培养继续增殖, 并通过 MTT 和隧洞试验监测细胞活力。
该模型使我们能够测试 alt/DDLPS 初级文化对目前使用的不同药物的敏感性, 或在临床评价中对 alt/DDLPS 的治疗, 如 ifosfamide (IFO), 表阿霉素 (epi), 结合的 ifo + EPI, trabectedin (TRABE),和 eribulin (ERI), 使用 MTT 法进行。结果证实了区域性对化疗的敏感性 (图 2A)。最积极的治疗方法是在晚期或转移性 ALT/DDLPS 中采用一线治疗。此外, 在药物暴露后, 细胞形态学被检查, 结果 ighlighting 的原始文化中的形态学改变与控制和细胞毒性检测的结果 (图 2B) 有关。如协议所述, 可以使用此模型对下游进行一些分析。图 3提供了方法的示意图表示形式, 并包括一个时间线, 在其中进行实验以获得平移结果。
图 1.建立以患者为基础的 ALT/DDLPS 的原代培养。A) 原位杂交 (鱼), 用于检测患者组织标本 (100X 图像) 中的 MDM2 放大。B) 原位杂交 (鱼), 用于检测主区域性中的 MDM2 放大 (100X 放大倍数)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.化疗在 ALT/DDLPS 的初级文化。A)细胞的治疗: ifosfamide (IFO)、表阿霉素 (epi)、IFO + 肾上腺素、trabectedin (TRABE) 和 eribulin (ERI)。对每个实验进行了三独立复制。如所述, 数据被显示为 "平均" 标准错误 (SE), n 表示复制的数量。各组之间的差异由两尾学生的t测试 (p < 0.05) 进行评估。B)在药物暴露后的 ALT/DDLPS 初级文化图像 (2X 倍放大)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: STS 主要区域性模型.STS 初级文化前期模型的示意图表示, 包括时间线和可能的下游分析。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
为了阐明肿瘤的分子背景, 预测预后不佳, 为癌症患者制定新的治疗策略, 需要明确的临床前模型。这对于像 sts 这样的罕见肿瘤尤其重要, 因为它的形态学、侵袭性潜能和临床行为等方面的高异质性挑战了我们对 sts 生物学和患者管理的理解21。此外, 少数商业肉瘤细胞系可限制对这组间质肿瘤的临床前调查18。因此,前体模型代表了 STS 的宝贵研究资源。我们开发了一个完整的人类体外模型的 STS 从手术切除肿瘤组织 (图 3)。在该方法的优化过程中, 解决了几个关键问题。第一个问题涉及手术治疗与样品处理之间的时间间隔。最初, 当肿瘤标本到达我们的生物科学实验室在一段时间后, 他们被储存在一夜间4摄氏度和处理第二天。从这些样品中分离出来的 STS 细胞在标准单层培养中表现出低增殖活性和较差的生存能力。部分原因是, 在处理前, 整个肿瘤标本在尿液容器中保存了很长一段时间。因此, 我们在手术后将样品加工的开始时间调整到最大3小时, 以确保原生培养在标准单层培养中继续增殖, 并表现出良好的生存能力。我们还优化了细胞分解过程: 需要小的均匀组织片段, 以促进酶消化, 这是用手术刀来实现的。此外, 虽然该议定书与不同大小的标本合作, 但从有限大小的标本 (< 2 厘米) 开始建立初级文化更难实现。胶原酶浓度是另一个重要的问题, 因为太高的 anenzyme 浓度可能导致细胞紧张, 导致表型变化的 STS 原代培养或减少肿瘤细胞存活。良好的酶消化是需要从基质材料和碎片分离细胞。我们最终优化了酶浓度的消化阶段使用。此外, 为了限制细胞的压力, 并为 STS 细胞提供养分, 在隔离阶段, 我们重新悬浮在培养基培养基中的酶, 而不是其他的试剂, 如 PBS。最后, 在不同 STS 初级文化 (如肉瘤和 myxofibrosarcoma) 上进行的几项实验揭示了随着时间推移基因表达的变化以及对化疗的敏感性增加13,20。这些发现是由于在单层系统中的患者派生的 STS 细胞的长时间培养以及越来越多的通道引起的, 这两者都导致表型和遗传漂移。随着时间的推移, 这种文化系统的可靠性降低, 如前所示, 是前体模型2223的最重要限制之一。因此, 我们通过减少进行实验的时间 (在肿瘤细胞播种 30-45 天内) 和使用低通道文化获得可重现性和平移结果来优化该协议。此外, 主要的文化可以冻结, 但其随后的生存能力取决于几个因素, 包括肿瘤的位置, STS histotype, 手术标本数量和文化通道的数量进行。
我们的系统有许多优点,即它是一个完全人类的临床前模型, 与其他基于小鼠的肉瘤细胞系模型24,25,26,27。此外, 虽然在有经验的肉瘤病理学家的支持下, 通过项细胞形态、免疫组化和分子细胞遗传学评价建立 STS 初级文化的确认是必须的, 但在我们的议定书中是强制性的。, 对于其他 STS 主要区域性模型来说, 这并不总是如此。在一些论文中, 对从手术标本中恢复的细胞进行下游分析, 而不确认在主要区域性28中对 STS 细胞百分比的诊断。我们的系统也多才多艺, 重现性好, 可以用来进行各种各样的实验。此外, 细胞播种和外部刺激可以修改, 以研究特定的特点和反应。该模型的发展使我们能够研究患者源性 sts 细胞对目前使用的不同药物的敏感性, 以及在临床评价中对 sts 的治疗。因此, 这个模型代表了一个重要的临床前工具预测治疗的反应, 如果进一步优化, 可能会被用来改善个性化治疗。它也可以用来识别诊断或预后的分子标记, 特别是在 STS 很少有特定的生物标志物的重要。该议定书的一项限制是, 在建立初级文化之后, 可进行下游分析的时间相对较短。通过对同一病人的肿瘤和原代培养进行基因表达分析和聚类分析, 以评估原代培养物模拟肿瘤组织异质性的能力, 可以改善该协议,特别是对于那些不具备诊断标记的 STS histotypes。这种分析还将有助于进一步描述所获得的文化中的细胞与直接从肿瘤样本中提取的不同。
最后, 建立强健的临床前模型对提高我们对肿瘤病理学的认识至关重要。我们相信, 我们的模型将有助于揭示的分子机制, 负责的不良预后的 STS, 并将有助于确定新的治疗策略。
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Disclosures
作者没有披露的利益冲突。
Acknowledgments
作者想感谢 Gráinne 的编辑协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
