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Cancer Research

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

doi: 10.3791/56767 Published: April 11, 2018

Summary

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Abstract

Sarcomi dei tessuti molli (STS) rappresentano uno spettro di neoplasie eterogenei con un difficile diagnosi, classificazione e gestione. Ad oggi, sono state identificate più di 50 sottotipi istologici di questi rari tumori solidi. Così, grazie alla loro straordinaria diversità e bassa incidenza, la nostra comprensione della biologia di questi tumori è ancora limitato. Paziente-derivato culture rappresentano la piattaforma ideale per studiare la farmacologia e la patofisiologia di STS. Così abbiamo sviluppato un modello preclinico umano di m. a partire da esemplari del tumore raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica. Paziente-derivato di colture cellulari STS sono sono ottenuti da esemplari chirurgici di digestione della collagenosi e isolati mediante filtrazione. Cellule sono stati contati, seminate e lasciate per 14 giorni in colture monostrato standard e poi elaborate da analisi a valle. Prima di eseguire l'analisi molecolare o farmaceutici, l'istituzione di colture primarie di STS è stata confermata attraverso la valutazione delle caratteristiche citomorfologiche e, quando disponibili, gli indicatori immunohistochemical. Questo metodo rappresenta un utile strumento 1) per studiare la storia naturale di queste neoplasie scarsamente esplorate e 2) per testare gli effetti di diversi farmaci nel tentativo di saperne di più su loro meccanismi di azione.

Introduction

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Sarcomi dei tessuti molli (STS) includono una gamma di lesioni eterogenee della contabilità di origine mesenchimale per 1% di tutti i tumori solidi1,2, e la nuova classificazione dell'organizzazione mondiale della sanità riconosce la presenza di più di 50 diversi sottotipi3. Tra questi, gli istotipi più comuni sono del adipocyte sarcoma o liposarcoma e leiomiosarcoma, pari al 15% e 11% di tutte le m adulte, rispettivamente4,5. Anche se STS può svilupparsi in diverse parti del corpo, le estremità e il retroperitoneum sono i siti più comuni, che si verificano nel 60% e il 20% dei casi, rispettivamente6.

La pietra angolare della terapia per la malattia localizzata è la resezione chirurgica larga, considerando che i benefici della chemioterapia adiuvante e neoadiuvante sono ancora poco chiari e vengono considerati solo in casi selezionati7. In metastatica, la chemioterapia è lo standard di cura ma Mostra risultati limitati8. Una migliore comprensione della biologia molecolare di STS contribuirebbe a migliorare la diagnosi differenziale corrente, ottimizzare i trattamenti disponibili e identificare nuovi bersagli per la terapia.

In questo contesto, la ricerca sul cancro è stata eseguita per molti anni di utilizzo di linee cellulari immortalizzate9. Questi modelli sperimentali sono normalmente coltivati in monostrato standard supporta o impiantati nei roditori immunodeficienti per stabilire modelli in vivo dello xenotrapianto10. Linee cellulari immortalizzate rappresentano un materiale maneggevole e facile-a-store, con la quale un ampio numero di esperimenti di ricerca può essere eseguito. Sono, infatti, il meno costoso e più ampiamente usato strumento in studi preclinici11.

Tuttavia, modelli di base di cellula del cancro hanno anche alcune limitazioni, ad es. prolungata cultura in un sistema monostrato insieme a un numero crescente di passaggi induce fenotipica e deriva genetica, facendo le cellule meno probabile di ricapitolare chiave tumore caratteristiche. Inoltre, colture cellulari linea non riescono a riprodurre l'interazione cellula--cellula e la segnalazione area interattiva di molecola che imitano il comportamento biologico dei tumori e caratterizzano il microambiente tumorale. Questi problemi costituiscono la base del divario esistente tra risultati preclinici e clinici12.

Dato quanto sopra, l'interesse in colture primarie di paziente-derivato è aumentato13. Infatti, l'asportazione del tessuto maligno e normale riduce il rischio di perdere il fenotipo delle cellule di cancro ed eterogeneità, offrendo così il materiale di partenza che è più rappresentativo del microambiente tumorale. Inoltre, l'uso di campioni tumorali freschi raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica permette di indagare i singoli tumori e per confrontare diverse lesioni dalla stessa parte del corpo di un paziente14. Per i motivi suesposti, colture di cellule tessuto-derivate forniscono un materiale prezioso per studiare il tumore fisiopatologia e farmacologia15,16,17, soprattutto nella m. a quali linee di cellule di sarcoma commercialmente disponibili sono limitato18. Abbiamo così ottimizzato un metodo per stabilire una cultura cellula primaria STS paziente-derivati a partire da tumore chirurgicamente asportato tessuto13,19,20. Il nostro metodo consiste di disgregare l'esemplare del tumore in piccoli frammenti di tessuto seguiti da una notte dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere una sospensione di singola cellula. Il giorno seguente, la digestione enzimatica viene arrestata con l'aggiunta di terreni di coltura fresco e la sospensione ottenuta viene filtrata per rimuovere frammenti di tessuto, aggregati cellulari e materiale in eccesso matrice o detriti. Infine, una frazione di cellule isolate del tumore è cytospinned su vetrini, fissato e memorizzati per analisi a valle puntato su confermando l'istituzione di colture primarie di STS da cytomorphological, immunohistochemical e valutazione citogenetica molecolare (ad es. analisi dei pesci di amplificazione MDM2 rappresenta la diagnosi differenziale standard per un liposarcoma bene-differenziato e il liposarcoma dedifferentiated) 4. le cellule restanti sono seminate in una cultura standard monostrato per studi farmacologici e profilatura di espressione genica. Tutti gli esperimenti sono effettuati utilizzando basso passaggio colture primarie per evitare la selezione di cancro specifico subcloni e analizzati da un patologo esperto sarcoma. Così abbiamo creato un pienamente umano m ex vivo modello13,19,20. Questo altamente versatile, facile da maniglia modello potrebbe rappresentare uno strumento utile per diversi tipi di ricerca preclinica, ad esempio per identificare nuovi marcatori molecolari per la diagnosi e la prognosi o per acquisire una più profonda comprensione dell'attività e meccanismi di azione di standard e nuovi farmaci utilizzati nella gestione delle m.

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Protocol

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Cellule di STS sono isolate da un tumore massa chirurgicamente asportato dai pazienti con STS. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico locale e viene eseguito secondo le linee guida di buona pratica clinica e la dichiarazione di Helsinki. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto a partecipare allo studio. Esemplari chirurgici sono analizzati da un patologo esperto sarcoma e trattati entro 3 ore dalla chirurgia.

1. tumore del prelievo e trattamento:

  1. Raccogliere campioni di tumore con l'aiuto di un patologo di sarcoma in un contenitore di urina sterile 100 mL con 50 mL di mezzo di glucosio basso DMEM sigillato con una pellicola di paraffina.
  2. Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di 3 h dopo resezione del tumore.
  3. Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa di sterili per coltura.
    1. Sterilizzare il cofano con etanolo al 70% e indossare guanti sterili.
    2. Sterilizzare pinzette in acciaio inox con etanolo al 70% (utilizzare una garza sterile).
    3. Rimuovere la pellicola di paraffina dal contenitore di urina e scartare.
    4. Lavaggio esterno del contenitore dell'urina con etanolo al 70%.
    5. Aprire una capsula di Petri quadrato.
    6. Aprire il contenitore di urina e trasferire i campioni di tumore nella Piazza di Petri con le pinzette sterili in acciaio inox.
  4. Lavare due volte i campioni di tumore con PBS.
  5. Aprire un bisturi chirurgico sterile.
    1. Tagliuzzare finemente i campioni di tumore in 1-2 mm3 pezzi.
    2. Raccogliere un quarto del totale campione in una provetta 2 mL.
    3. Aggiungere 1 mL di reagente trizol (acquistato) al tubo e immediatamente congelato a-80 ° C (il campione verrà utilizzato nell'analisi a valle per la valutazione dell'espressione di gene STS).
  6. Raccogliere il resto del materiale finemente triturati tumore in una provetta da 15 mL.
    1. Aggiungere 4 mL di collagenasi di tipo I (tipo collagenosi viene disciolto in PBS, ad una concentrazione di 4 µ g/mL) di soluzione.
    2. Diluire la collagenasi tipo I soluzione con 4 mL di DMEM alta cultura media (concentrazione finale di collagenasi tipo io è di 2 µ g/mL).
    3. Chiudere il tubo 15 mL e sigillare con la pellicola di paraffina.
    4. Inserire il tubo 15 mL in uno shaker rotolamento in un incubatore a 37 ° C in condizioni di agitazione per 15 min attivare la digestione.
    5. Dopo 15 min conservare la provetta nello shaker rotolamento sotto agitazione Condizioni a temperatura ambiente durante la notte.
  7. Il giorno seguente metta il tubo 15 mL sotto il cappuccio sterile.
  8. Delicatamente e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile 100 µm, fissato alla parte superiore di un tubo da 50 mL.
  9. Lavare il filtro con DMEM di alta coltura completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
  10. Gettare il filtro sterile di 100 µm, chiudere il tubo da 50 mL e centrifugare a 225 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  11. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta.
  12. Risospendere le cellule con 1-2 mL DMEM alta cultura media completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    Nota: Il volume dipende dalla quantità di campione del tumore trattato.
  13. Contare le celle con una camera di Neubauer.
    1. Diluire il campione 1:2 in blu di trypan e utilizzare 10 µ l della diluizione per contare le celle.
    2. Contare almeno due volte e calcolare la media dei replicati per conoscere il numero totale medio di cellule raccolte.
  14. Cellule di piastra in una cultura dello strato monomolecolare standard ad una densità di 80.000 cellule/cm2.
    Nota: Includere sempre controlli negli esperimenti. Eseguire almeno 3 replicati tecnici per ogni condizione. Eseguire almeno 2 repliche biologiche. Per farmacologia preclinica, espressione genica e analisi dell'espressione proteica, esperimenti dovrebbero essere effettuati con un basso numero di passaggi di cultura entro 30-45 giorni di cella semina per evitare di perdere cancro fenotipi cellulari.
  15. Preparazione del campione citologico.
    1. Raccogliere 100.000 cellule in 200 µ l di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    2. Pipetta la soluzione (pipetta 200 µ l) in un imbuto monouso dotato di filtro e montato con una lastra di vetro.
    3. Aprire la citocentrifuga e inserire i campioni.
    4. Eseguire la citocentrifuga a 18,6 x g per 20 min.
    5. Scartare l'imbuto equipaggiato con il filtro.
    6. Difficoltà le diapositive in acetone per 10 min seguita da cloroformio per 5 min.
    7. Archiviare le diapositive a-20 ° C.
      Nota: Scongelare e idratare i campioni prima della colorazione ed eseguire la colorazione seguendo le istruzioni del produttore. Preparare almeno 3 replicati tecnici.

2. colture di cellule di m.:

  1. Modifica supporto una volta a settimana (DMEM alta cultura media completato con 10% siero bovino fetale, glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina).
    1. Scartare il terreno di coltura utilizzando una pipetta di 200-1.000 µ l.
    2. Aggiungere nuovo mezzo fresco utilizzando una pipetta di 200-1.000 µ l.
    3. Passaggio delle cellule:
      1. Staccare le cellule quando la confluenza è circa 90%:
        Nota: STS cella cultura amplificazione dovrebbe essere effettuata una volta a settimana sulla base delle condizioni di coltura.
      2. Eliminare terreno, lavate con PBS e aggiungere 2-3 mL di tripsina 1 x in PBS
        Nota: Il volume della tripsina utilizzato dipende dalla quantità di cellule coltivate ottenute.
      3. Incubare le cellule per 3-5 min a 37 ° C.
      4. Raccogliere le cellule distaccate dalla piastra usando una pipetta di 200-1.000 µ l.
      5. Le cellule indipendente di pipettare in una provetta da 15 mL e aggiungere 4 mL di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina per fermare la reazione enzimatica.
      6. Centrifugare a 225 x g per 5 min a temperatura ambiente.
      7. Scartare il surnatante.
      8. Risospendere il pellet cellulare aggiungendo 1 mL di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
      9. Le celle in una nuova piastra di coltura o una boccetta con un volume finale secondo le istruzioni del produttore del seme.
        Nota: Non dividere celle più di 1:3.

3. a valle analisi:

Nota: Una varietà di esperimenti differenti può essere effettuata utilizzando questo modello (Vedi sotto). È, pertanto, fondamentale per decidere in fase di progettazione dello studio che analizza deve essere eseguita in modo che un numero sufficiente di campioni e replicati possa essere preparato.

  1. Analisi di proliferazione come il bromuro di 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium di MTT
  2. Analisi apoptotiche quali transferasi terminale di deoxynucleotidyl (TdT) nick end labeling analisi (TUNEL)
  3. Analisi di Immunohistochemical
  4. Analisi dell'espressione genica
  5. Analisi Western blot
  6. Analisi di ELISA
  7. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS)
  8. In vivo modello dello xenotrapianto

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Representative Results

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Abbiamo progettato un metodo semplice per ottenere l'istituzione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato e riferire qui un esempio di risultati ottenuti su uno specifico STS histotype13. Il protocollo è stato utilizzato per la creazione di colture primarie di diversi istotipi m compreso il liposarcoma ben differenziato, dedifferenziate liposarcoma, liposarcoma myxoid, liposarcoma pleomorphic, mixofibrosarcoma, indifferenziato fibromatosis desmoid, GIST e sarcoma pleomorfo.

Il tasso di successo per la creazione di colture primarie era 54% (13 colture primarie da 24 campioni chirurgici di STS) per esemplari chirurgici derivati da pazienti trattati con chemioterapia, radioterapia o non trattati. Al contrario, esso era del 72% (13 colture primarie da 18 campioni chirurgici di STS) per campioni chirurgici provenienti solo da pazienti non trattati.

Le cellule del tumore sono state isolate da un liposarcoma ben differenziato/sdifferenziato (ALT/DDLPS), rimosso chirurgicamente da un paziente di 54 anni. Analisi di amplificazione di MDM2, attualmente eseguito per la diagnosi differenziale standard di ALT/DDLPS e rivisto da un patologo esperto sarcoma, era positivo, confermando la presenza di una lesione ALT/DDLPS (Figura 1A). L'analisi citologica dell'amplificazione di MDM2 in cellule isolate del tumore ha confermato l'istituzione di una paziente-derivato ALT/DDLPS cultura primaria (94,6% delle cellule coltivate erano positive per l'amplificazione di MDM2) (Figura 1B). La coltura primaria continuò a proliferare dopo i passaggi in colture monostrato standard e la vitalità cellulare è stata monitorata da MTT e Tunel assay.

Questo modello ci ha permesso di testare la sensibilità della cultura primaria ALT/DDLPS a diversi farmaci attualmente utilizzati o in corso di valutazione clinica per il trattamento di ALT/DDLPS come ifosfamide (IFO), epirubicina (EPI), la combinazione IFO + EPI, trabectedina (TRABE), ed eribulina (ERI), effettuata usando l'analisi di MTT. I risultati hanno confermato la sensibilità delle colture alla chemioterapia (Figura 2A). Il trattamento più attivo era IFO + EPI, una terapia di prima linea utilizzata in avanzato o metastatico ALT/DDLPS. Inoltre, la morfologia delle cellule è stata esaminata dopo esposizione al farmaco, provoca i cambiamenti morfologici videnziazione modifiche nella coltura primaria rispetto al controllo e i risultati del test citotossico (Figura 2B). Come accennato nel protocollo, parecchie analisi a valle possono essere eseguite con questo modello. Figura 3 fornisce una rappresentazione schematica del metodo e include una sequenza temporale entro il quale gli esperimenti dovrebbero essere svolti per ottenere risultati traslazionale.

Figure 1
Figura 1 . Istituzione del paziente-derivato di colture primarie di ALT/DDLPS. A) ibridazione In situ (FISH) eseguita per rilevare amplificazione MDM2 in un campione di tessuto del paziente (immagine X 100). B) ibridazione In situ (FISH) eseguita per rilevare amplificazione MDM2 in una coltura primaria (ingrandimento 100 X). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Chemioterapia in una coltura primaria di ALT/DDLPS. A) le cellule sono state trattate con: ifosfamide (IFO), epirubicina (EPI), IFO + EPI, trabectedina (TRABE) ed eribulina (ERI). Tre repliche indipendenti sono state eseguite per ogni esperimento. I dati sono presentati come media ± errore standard (SE), come indicato, con n che indica il numero delle ripetizioni. Differenze fra i gruppi sono state valutate da di uno studente due code t-prova, * p < 0.05. B) cultura primaria immagini di ALT/DDLPS dopo esposizione al farmaco (ingrandimento 2x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Modello di colture primarie di STS. Rappresentazione schematica del modello preclinico di STS coltura primaria tra cui timeline e le eventuali analisi a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Ben definiti modelli preclinici sono necessari delucidare la priorità bassa molecolare dei tumori, predire la prognosi e sviluppare nuove strategie terapeutiche per i pazienti oncologici. Ciò è particolarmente importante per i tumori rari ad esempio STS cui alta eterogeneità in termini di morfologia, comportamento aggressivo di potenziale e clinico sfida la nostra comprensione della biologia di STS e gestione del paziente21. Inoltre, le poche righe di cellule di sarcoma commerciale disponibile limita le indagini precliniche in questo gruppo di tumori mesenchymal18. Ex vivo modelli rappresentano quindi una risorsa preziosa ricerca per STS. Abbiamo sviluppato un modello pienamente umana in vitro delle m a partire dal tessuto del tumore resecato chirurgicamente (Figura 3). Durante l'ottimizzazione del metodo, diverse criticità sono stato affrontato e risolto. Il primo problema riguarda l'intervallo di tempo tra il trattamento chirurgico e trattamento dei campioni. Inizialmente, quando gli esemplari del tumore è arrivato presso il nostro laboratorio di Bioscienze dopo un certo tempo, erano immagazzinati durante la notte a 4 ° C e processate il giorno successivo. Le cellule di STS isolate da questi campioni hanno esibito attività bassa proliferazione e scarsa vitalità nella cultura dello strato monomolecolare standard. Questo può, in parte, essere attribuita al fatto quel campione intero tumore è tenuto per un periodo prolungato di tempo nel contenitore dell'urina prima di essere elaborati. Così abbiamo modificato l'ora di inizio del campione l'elaborazione ad un massimo di 3 h dopo l'intervento chirurgico per assicurare che la coltura primaria ha continuato a proliferare in coltura standard dello strato monomolecolare e buona redditività per mostre. Abbiamo inoltre ottimizzato il processo di disgregazione cellulare: frammenti di tessuto omogeneo piccoli sono necessari per facilitare la digestione enzimatica, e questo è stato ottenuto usando un bisturi. Inoltre, anche se il protocollo lavorato con esemplari di diverse dimensioni, l'istituzione di una coltura primaria a partire da esemplari di limitate dimensioni (< 2 cm) è più difficile da raggiungere. La concentrazione di collagenasi era un'altra questione importante perché anenzyme troppo alta concentrazione può causare stress cellulare, dando luogo a modificazioni fenotipiche nella coltura primaria STS o una diminuzione nella sopravvivenza delle cellule del tumore. Buona digestione enzimatica è necessaria per separare le cellule da detriti e materiale della matrice. Infine abbiamo ottimizzato la concentrazione dell'enzima da utilizzare in fase di digestione. Inoltre, per limitare lo stress cellulare e fornire nutrienti per STS cellule durante la fase di isolamento abbiamo nuovamente sospeso l'enzima in terreni di coltura invece di altri reagenti come PBS. Infine, diversi esperimenti eseguiti su diverse colture primarie di STS come liposarcoma e myxofibrosarcoma ha rivelato i cambiamenti nell'espressione genica nel tempo e aumento della sensibilità alla chemioterapia13,20. Questi risultati sono attribuibili alla coltura prolungata di cellule STS derivanti dal paziente in un sistema monostrato insieme a un numero crescente di passaggi, entrambi che inducono fenotipica e deriva genetica. L'affidabilità diminuzione di questo sistema di coltura nel tempo di ricapitolare il tessuto del tumore, come precedentemente illustrato, rappresenta una delle più importanti limitazioni di ex vivo modelli22,23. Abbiamo così ottimizzato il protocollo, riducendo il tempo in cui eseguire esperimenti (entro 30-45 giorni dalla semina cellulare di tumore) e utilizzando culture del passaggio basso per ottenere risultati riproducibili e traslazionale. Inoltre, le colture primarie possono essere congelate, ma la loro sopravvivenza successiva è dipendente da diversi fattori tra cui la posizione del tumore, istotipo STS, quantità di esemplare chirurgico e il numero di passaggi di cultura eseguita.

Il nostro sistema ha una serie di vantaggi, cioè è un modello preclinico pienamente umano, in contrasto con altri sarcoma murino-base cella linea modelli24,25,26,27. Inoltre, mentre la conferma dell'istituzione di colture primarie di STS, raggiunto da cytomorphological, immunohistochemical e valutazione citogenetica molecolare, con il supporto di un sarcoma esperto patologo, è obbligatorio nel nostro protocollo , questo non è sempre il caso per altri modelli di colture primarie di STS. In alcune carte, analisi a valle delle cellule recuperate dai campioni chirurgici è stato effettuato senza confermare la percentuale di diagnosi le m delle cellule in colture primarie28. Il nostro sistema è anche versatile, riproducibile e può essere utilizzato per eseguire un'ampia varietà di esperimenti. Inoltre, semina cellulare e stimoli esterni possono essere modificati per studiare le risposte e le caratteristiche specifiche. Lo sviluppo di questo modello permette di indagare la sensibilità delle cellule di STS paziente-derivato ai diversi farmaci attualmente utilizzati o in valutazione clinica per il trattamento delle m. Questo modello, pertanto, rappresenta un importante strumento preclinico per predire la risposta alla terapia e, se ulteriormente ottimizzato, poteva essere utilizzato per migliorare la terapia personalizzata. Potrebbe anche essere utilizzato per identificare marcatori molecolari diagnostici o prognostici, particolarmente importanti in STS dove alcuni biomarcatori specifici sono disponibili. Una delle limitazioni del protocollo è il poco tempo disponibile per eseguire analisi a valle dopo l'istituzione della cultura primaria. Il protocollo potrebbe essere migliorato mediante l'esecuzione di profili di espressione genica e analisi per tumore sia colture primarie derivate dallo stesso paziente nel corso del tempo per valutare la capacità delle colture primarie di imitare l'eterogeneità del tessuto del tumore, il clustering soprattutto per quei istotipi di STS per il quale marcatore diagnostico non è disponibile. Tali analisi contribuirebbe anche a più ulteriormente caratterizzare come le cellule nella coltura ottenuta differiscono da quelli derivati direttamente da campioni tumorali.

In conclusione, la creazione di solidi modelli preclinici è essenziale per far avanzare la nostra comprensione della patologia tumorale. Noi crediamo che il nostro modello vi aiuterà a scoprire i meccanismi molecolari che sono responsabili per la prognosi delle m e contribuiranno all'identificazione di nuove strategie terapeutiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato
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De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).More

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