Summary
全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。
Abstract
カルシウム (Ca2 +) 画像は、神経樹状突起における細胞内 Ca2 +シグナルの時空間ダイナミクスを調べるための強力なツールです。Ca2 +変動は様々 な膜と細胞内メカニズムを介して発生するでき、樹状の興奮性のシナプス可塑性の誘導と制御に重要な役割を果たします。したがって、樹状突起の分岐で Ca2 +シグナルの種類を記録する機能は樹状突起が情報を統合する方法を研究するグループの貴重です。2 光子顕微鏡の出現は、症状や光散乱などの生体の画像に固有の問題を解くことによって、このような研究を大幅に簡略化は。また、2 光子 Ca2 +イメージングと従来の電気生理学的手法の組み合わせによるローカル Ca2 +変動録音と並行して神経細胞の樹状突起でのシナプスを調査することが可能です。相馬。ここでは、gaba 作動性抑制性介在神経細胞の樹状突起にローカル Ca2 +トランジェント (猫) のダイナミクスを研究するこのメソッドを使用する方法について述べる。メソッドは、樹状 Ca2 +急性脳スライスに異なる神経型シグナルの勉強にも適用できます。
Introduction
ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース1で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca2 +イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。
複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡2から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも希薄(3) 生成や毒性また焦点平面に制限されます。したがって、従来の共焦点顕微鏡と比較すると 2 光子システムの高コストは、にもかかわらず、2PLSM 太い生体組織における神経細胞の構造と機能の高解像度の調査のための選択の方法のまま。
散乱体内の 2PLSM の最初のアプリケーションは、樹状突起スパイン3の機能と構造のイメージをだった。Ca2 +イメージングとの組み合わせで 2PLSM として分離された生化学的なコンパートメントで棘関数を明らかにしました。以来、さまざまな神経棘と個々 のシナプス4の間の一対一の対応がある、二光子励起 Ca2 +イメージングすぐになった便利なツールそのまま組織5、個々 のシナプスの活動報告 6,7,8。さらに、2PLSM ベースの Ca2 +イメージングがうまく使われた単一カルシウム チャネルおよび組み込みとシナプスのコンダクタンスの非線形相互作用の活動を監視するし、状態とアクティビティに依存を評価するにはCa2 +シグナル神経樹状突起5,6,7,8,9,10,11の規則。
ユビキタス細胞内二次メッセンジャーであり、その細胞内の時空間的構成イオンの調節するシナプス強度の変化からの生理学的反応の方向を決定するカルシウム チャネル、デンドライトと背骨の成長としてなく、細胞死、生存。複数経路の活性化を介して樹状 Ca2 +上昇が発生します。活動電位 (Ap)、樹状突起を逆伝搬は、電位依存性カルシウム チャネル12を開き、樹状突起と棘13で比較的大域的な Ca2 +トランジェント (猫) を生成します。シナプス伝達はシナプス後 Ca2 +活性化に関連付けられて-透水性受容体 (NMDA、Ca2 +-透水性 AMPA とカイニン酸)、6、14,15猫シナプスのトリガーします。最後に、特定の条件11,12,13,16の下で樹状突起で超直線性 Ca2 +イベントを生成できます。
パッチ ・ クランプ記録との組み合わせで二光子励起 Ca2 +イメージングを採用しています合成 Ca2 +-通常は全細胞記録中にパッチ電極経由で配信される機密の蛍光インジケーター.Ca2 +動態の定量化のための標準的な方法は、デュアル表示法17,18に基づいています。よく分離発光スペクトルと 2 つの同時を使用して (例えば、赤い Ca2 +の組み合わせ-緑の Ca2 +インジケーター オレゴン グリーンこれら 1、蛍光色 4 などと区別しない染料) に比べていくつかの利点があり、単一指示薬法。最初に、Ca2 +-に依存しない染料を使用、Ca2 +イメージングを実行する (樹枝状の枝、棘) 興味の小さい構造を検索します。第二に、緑と赤の蛍光 (ΔG/R) の変化比が大きく変動する [Ca2 +]017ベースライン蛍光の変化に敏感である [Ca2 +]、メジャーとして計算されます。,18します。 さらに、蛍光変化は絶対 Ca 2 +濃度19面でキャリブレーションできます。
急性スライスで二光子励起 Ca2 +イメージング実験を実行する場合の一般的な心配は細胞の健康と高レーザー出力の通常使用による画像取得の安定性。さらに、Ca2 +イメージング実験である摂動法と細胞内 Ca2 +動態の実質的な過大評価懸念 Ca2 +インジケーターとして高度なモバイル外因性 Ca2 +という事実のためにバッファー。したがって、Ca2 +インジケーターとその濃度の選択は、神経型、猫の予想される振幅と実験の質問によって異なります。
我々 は樹状突起における gaba 作動性介在ニューロン9,10、11,20,21 Ca2 +変動の調査の 2 光子励起 Ca2 +イメージング法を適応,22. 抑制介在ショーケース多種多様な錐体細胞20のそれらとは異なる機能性の Ca2 +メカニズムの初期 Ca2 +イメージング研究の大部分は、主ニューロンで行われた中、,23,24. これらの介在ニューロン固有のメカニズム (例えばCa2 +透過性 AMPA 受容体) は、細胞活性の調節に特定の役割を果たすことがあります。二光子励起 Ca2 +イメージングでこれらの細胞の樹状突起が薄く直径樹状突起と棘の欠如から、追加の課題を提示樹状 Ca2 +シグナル介在ニューロンは詳しい調査のための魅力的なターゲットが、特に内因性 Ca2 +結合能力が高い。私たち研究の海馬介在の研究の焦点、次のプロトコル間異なる神経細胞の集団に適用したこれらの課題に対処する適応
このプロトコルは、2 つの外部の非 descanned 探知機 (NDDs)、電気光学変調器 (EOM) とグラデーション コントラスト (SGC) をスキャン Dodt を装備され、光学テーブルにインストールされて商業共焦点 2 光子顕微鏡、実行されました。顕微鏡 800 モード同期チタンサファイアレーザー多光子と結合されていました (> 3 W、140 の fs パルス、80 Hz の繰り返し率) の nm。イメージング システムは、温度制御、2 つのマニピュレーターを持つ翻訳プラットフォーム、コンピューター制御電極アンプ、デジタイザー、刺激と灌流チェンバを含む標準的な電気生理学のリグが装備されていた単位、およびデータ集録ソフトウェア。
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Protocol
動物保護委員会のラヴァル大学とカナダ評議会は、動物愛護の家畜福祉ガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. 事前準備 (オプション: 1 日を前もって準備)
- 人工髄液 (アプライド) ソリューション (各ノーマル、ショ糖と復旧ソリューション、1 L;テーブル 1を参照) の 3 種類を準備します。300 ± 10 mOsm25に溶液の浸透圧を調整し、氷点下に近いポイントにアプライド ショ糖をクール (0-4 ° C)。
注: 低ナトリウム切削ソリューション (アプライド ショ糖) の使用は、急性スライス26の表面的な層のニューロンの生存を保持できます。 - 赤蛍光体 (例えば、Alexa 594) を含む修正プログラム ソリューションの 0.75 ml と緑の合成カルシウム インジケーター (例えば、オレゴン グリーンこれら 1;テーブル 1を参照)。Biocytin は、(表 1参照) 修正プログラム ソリューションの記録された細胞の形態学的同定をアドホックの記事が必要な場合に。
- 280 ± 5 mOsm の解決策と pH 7.35 ± 0.5 の浸透圧を調整します。すべての回で冷蔵庫や氷の上のソリューションを保持します。
注: ダイナミック レンジと調査 Ca2 +イベントの性質は、カルシウム インジケーターの選択を前提する必要があります。 - ≈ 2 μ m チップ (3-5 MΩ のピペット抵抗) と刺激ピペット ホウケイ酸シータ ガラス管 (のテーブルを参照からパッチ ピペット ホウケイ酸ガラス管 (材料の表を参照してください) からマイクロ ピペットの引き手を使用して、準備します。材料) 2-5 μ m の先端で。
注: 引き手フィラメント タイプとガラスの特定の種類のテスト結果がランプによって特定の直径と形状のピペットの引き手設定が異なります。
2. 海馬スライス標本
- マウスの麻酔 (P13 20; ひずみとマウスのセックスは対処されて実験的質問によって決まりますが) 1 ml のイソフルレン吸入麻酔室内紙タオルの上に置かれました。動物は麻酔深く動き、遅い呼吸の欠如によって証明されるよう、麻酔室からそれを削除し、ギロチンを使用しての首をはねます。
- 鼻に頭蓋の後部からはさみの小さなペアで皮膚を切断することによって頭蓋骨を公開します。前レベルで穴を作るためのミニ骨 rongeurs の小さなペアを使用します。尾側吻側矢状縫合線に沿ってカットするはさみを使用しています。Rongeurs 各半球を覆う頭蓋骨を削除する各頭蓋骨フラップ、エレベーター方向および水平方向の背面を把握します。
- 脳が完全に公開されている後は、小さいヘラを使って視神経を弱めます。頭蓋骨から脳を外し、酸素、冷たいアプライド ショ糖を含む継続的にシャーレに入れて (ショ糖濃度は表 1を参照)。
- 古いマウスから組織が必要な場合は、脳抽出の前に冷えたアプライド ショ糖の 20 ml シリンジ (25 G) を使用して質の良いスライスを取得する心腔内灌流を実行します。
- 抽出した動物の脳から海馬スライスを準備します。
- 約 2 分氷でいっぱいのシャーレに濾紙片を配置、フィルター紙の上に脳を転送のための脳チルをしましょう。2 つの半球を解剖します。
- Vibratome テーブルの上に (方向、コロナ、横、または水平方向のスライスを取得する実験の目標によって決まります) 切り裂かれた半球を接着し、冷えた酸素アプライド ショ糖で満たされた vibratome トレイに没頭します。Vibratome クーラーを使用してまたは vibratome トレイの周りの氷を置くことによって 300 μ m 約 1 ° C の温度で厚さのスライスを作る。
- 37 ° C に加熱酸素アプライド回復を含むバースの海馬 (半球あたり最大 6 スライス) が含まれているスライスを蓄積フラット ペイント ブラシを使用して、
- 少なくとも 45 分アプライド回復風呂にスライスを残します。
3. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
- 目的の下に風呂の場所で海馬スライスの設定 (倍率: 40 倍、開口数: 0.8) 二光子励起レーザ走査顕微鏡の。継続的にお風呂を灌流、酸素アプライド通常 2.5 〜 3 mL/分の速度で 30-32 ° C で加熱します。
- 赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) または Dodt SGC 顕微鏡を使用して、そのサイズ、形状、および位置を使用して興味のセルを探します。
注: 対象となるニューロンの人口に応じてトランスジェニック マウス モデルは興味のセルを簡単に検索する使用できます。この場合、この手順は、蛍光光源の使用と代替可能します。 - (例えば、Alexa 594) 赤の蛍光体を含むアプライド標準溶液で刺激ピペットを入力します。
- 先端が興味のセルと同じ地域にあるので、スライスの上に (電気刺激装置に接続) 刺激ピペットを設定します。
- 修正プログラム ソリューションとパッチ ピペットを充填し、ヘッド ステージに貼り付けて後、興味のセルのすぐ上の先端は、スライスを設定します。
- 三方活栓のシリンジの収まるし、プラスチック製のチューブを介してパッチ ピペットに接続します。パッチ ピペットに一定の陽圧を注入 (≈ 0.1 mL) 注射器を使用しています。活栓を「閉じる」位置にしてください。
- 増幅器制御ソフトウェア モジュールをアクティブにし、「VC」ボタンをクリックしてして電圧クランプ モードに切り替えます。電気生理学的信号の取得の電気生理学データ集録ソフトウェア (例えばclampex) を開き、それを継続的に監視する必要のある正方形電圧パルス (5 mV、10 ms) を送信して「膜テスト」アイコンをクリックピペット抵抗の変化。
- 対象のセルの右上までパッチ ピペットを下げます。作る時に細胞膜との接触、活栓を「開く」の位置に回すことによって、圧力を削除します。
注: 細胞膜との接触が検出されるときピペット抵抗わずかな増加 (≒ 0.2 MΩ) が、セルに小さなくぼみが肯定的な圧力によって引き起こされます。 - ピペット抵抗のソフトウェアによって提供される 1 GΩ に達するまで、コックに装着空の注射器を使用してパッチ ピペットにわずかな否定的な圧力を適用されます。データ集録ソフトウェアの ' 膜テスト ウィンドウでクランプ-60 でセル mV。
- セルを開けて全体セル構成を達成するまで否定的な圧力を適用することを続行します。このセルの状態の検出は (介在ニューロンの種類に応じて 70 500 MΩ に 1 GΩ) からピペット抵抗と ' 膜テスト ウィンドウで大きな静電容量過渡の外観の急激な変化に基づいています。
4. 二光子励起 Ca2 +イメージング
- 興奮性のシナプス応答に興味がある場合、GABAAの受容体ブロッカー gabazine (10 μ M) と GABAB受容体拮抗薬 CGP55845 追加 (2 μ M) アプライドお風呂に。
- 増幅器制御ソフトウェア モジュールの「CC」ボタンをクリックしてして現在のクランプにパッチを設定および脱分極電流体注射に応答細胞の発火パターンを記録 (0.8 〜 1.0 nA, 1 s)。修正プログラム ソリューションのインジケーターを格納するセルの少なくとも 30 分を待ちます。
注: セルの発火パターンとアクティブなプロパティ使用できます。 セルのサブタイプを識別するために例えば細胞の高速スパイクします。レコード猫 (トラブルシューティングの表 2を参照) を始める前に拡散を安定させるために指標濃度が重要です。 - AP 誘発猫
- 画像集録ソフトウェアを使用して画像を取得を開始します。赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。表示される応答を確保するため、AP 誤差逆伝搬効率が大幅低下する gaba 作動性介在ニューロン22で距離をまず、近位樹状突起 (≤ 50 μ m) を選択します。
- 画像集録ソフトウェアの「長方形ツール」を使用して、対象となる領域拡大し、を切り替える、「xt" (ライン スキャン) モード。目的の樹状突起の分岐間でスキャンの位置。集録ソフトウェアのレーザー強度コント ローラー、2 光子レーザー ベースライン緑蛍光は光毒性を避けるために、少しだけ目に見える最小の電力レベルで設定します。
- 電気生理学データ集録ソフトウェア プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェアで必要な振幅の体細胞電流注入を含む希望の期間の記録試みを作成します。
- 画像集録ソフトウェアを使用すると、「記録開始」ボタンをクリックし、、3-10 回 1-2 s. 繰り返し継続的に蛍光画像の取得を取得。光損傷を避けるために単一スキャンの間待機、少なくとも 30 秒。デンドライトの複数のポイントでエネルギーを集録する場合は、順序効果を避けるためにランダムな順序でそれらを取る。
- シナプス誘発猫
- 赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。
- 興味の樹状突起上のスライスの表面に刺激ピペットを設定します。刺激ピペットは全体構成を脅かさないよう動きを最小限に抑え、所定の位置にゆっくりと下ろします。位置、樹状突起から 10-15 μ m でピペット。
- 画像集録ソフトウェアの aspiny の樹状突起でシナプス ミクロ相分離構造の場所を視覚化するに切り替えて、'xt' (ライン スキャン) モードに沿って目的の樹状突起分岐線の位置。
- (電気生理学データ集録ソフトウェア) の [プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェア試用開始後刺激ユニットをトリガー記録試用版を作成します。
- 30 を待っている 3-5 回、1-2 s. リピート獲得のために継続的に樹状突起に沿ってスキャンする「記録開始」ボタンをクリックして取得ソフトウェアを使用して光損傷を防ぐためにスキャンの間 s。
注: スキャンの長さは、誘発イベントの速度によって調整することができますが、光損傷を防ぐために最小限に抑える必要があります (トラブルシューティングの表 2を参照)。 - さまざまな条件 (例えば刺激の強度/長さが異なる、薬理学的ブロッカー等の導入) で取り上げられている特定の質問に応じて、4.5.5 手順を繰り返します。
- 集録を停止するとき、セルは、健康悪化の兆候を示しています:-45 下脱分極 mV、ベースライン (例えばブレブ、断片化; 参照表 2は樹状突起の形態学的劣化の Ca2 +レベルの増加トラブルシューティング)。
- 細胞の形態に関する予備的な情報を入手して刺激ピペットの場所の記録を保持するには、赤のチャンネルにセルのz-スタックを取得します。取得ソフトウェアを使用して 'xyz'モードが含まれているすべてのプロセスとセル全体を画像に上下スタック制限を設定します。1 μ m で 'のステップのサイズを設定し、「記録開始」ボタンを使用してスタック取得を開始します。
- ときZ-スタックの取得が完了したら、ソフトウェアの「最大投射」オプションを使用して、スタックのすべての焦点の計画を重ね合わせるし、、買収の品質を確認します。その後、スライスからパッチ ピペットをゆっくりと上げます。
- アドホックの記事の形態学的同定のためのスライスを修正するには、すぐにフラット ペイント ブラシを使用して風呂からスライスを削除し、アプライドで満たされたシャーレ内の 2 つのフィルター ペーパー間に配置。4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、アプライドに置き換える、4 ° C の部屋や冷蔵庫では、料理を一晩置いておきます。
5.ポストアド ホック記録された細胞の形態学的同定のための免疫組織化学
注: PFA の固定 1 泊後スライスに格納できるリン酸バッファー (PB) アジ化ナトリウム (0.5%) と 1 ヶ月。
- トリス緩衝生理食塩水液 (TBS) トリトン X-100 (0.3%) とのスライスを入れて、4 洗浄 (5-10 分ごと) を実行します。
- TBS トリトンのスライスを入れて 1 時間 10% ヤギ血清 (NGS) の 0.3%。
- 0.3 %tbs トリトンのスライスを入れて 1% により、NGS とストレプトアビジン共役のため蛍光 (例えば、Alexa Fluor 546 共役ストレプトアビジン、1: 200) 一晩培養します。
- 4 を洗う時間 TBS で (5-10 分)
- 顕微鏡のスライドと共焦点顕微鏡を用いたイメージ スライスをマウントします。完全な細胞再構成をしてZを取得-スタック (ステップ サイズ: 1 μ m) 20 × 対物を使用します。Alexa-546 共役ラベルをイメージング、543 nm レーザーと 515 560 nm 検出フィルターの使用を設定します。
6. 猫の解析
- 赤と緑のチャンネルからライン スキャン画像に関心 (ROIs) の地域から蛍光値を抽出し、ノイズを低減する条件ごとに複数の繰り返しの値の平均します。
注: 樹状突起上ライン スキャン取得が実行されると、それは樹枝状ミクロ相分離構造 (2-5 μ m) に対応して可能性があります、複数 Roi からデータを抽出することが可能と Ca2 +シグナル区画の研究。 - 各 roi として Ca2 +振幅の変化を表します。
注: ここで G はグリーン チャンネルから蛍光値G0はグリーン チャンネルからベースライン蛍光値で前刺激期間中R は赤のチャンネル18から蛍光値です。2 光子励起は非常にローカライズされた重要な背景を生成しません、背景の蛍光性の加減は必要ありません。
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Representative Results
ここで提示されたプロトコルを使用して、体の電流注入によると海馬の CA1 野オリエンス/alveus 介在ニューロンの樹状突起に電気刺激による誘発猫を得られます。複数のポイントで近位樹状突起全体エネルギーを培ってニューロンは、特定のパッチの形状と位置に基づく後で相馬 (図 1 a) から距離が与えられます。相馬の増加 (減少の AP 振幅またはカルシウム チャネル流通、図 1 bの距離依存性低下を示す) からの距離の逆伝搬 Ap による猫の振幅の減少を見ました。免疫組織化学 (Alexa Fluor 546 のストレプトアビジン共役を使用) 後、セルの biocytin ラベルを取得し、占領オリエンス地層と地層結腸寄生虫 (図軸索と解像セルとして記録されたニューロンを識別することができました1 C). 2 番目の実験では、刺激のピペットは遠位樹状サイトにもたらされました。樹状突起上をスキャンすることができましたし、一節の軸索の電気刺激への応答で指定した樹状突起分岐 (図 2 a-C) シナプスの Ca2 +信号の振幅を評価するために。シナプス後の猫は異なって近隣樹枝状ミクロ相分離構造 (セグメント 1 に 6;図 2 D) 開始および/または別のシナプス機構のゾーンから Ca2 +シグナルの普及に関連付けられているかもしれない。
図 1: AP 誘発 Ca2 +トランジェントの代表例.(A) 最大 2 光子Zの投影-Alexa 594 満ちている修繕された介在のスタック (13 μ m) (20 μ M)。白い線は、位置とエネルギーの長さを示します。A. Top トレースの場所に誘発される猫を表示 (B) のトレースは、裁判の記録中に体の電流注入を介して生成された AP の電車を示しています。タイム スケールが表示すべてのトレースに関する同じです。(C) 最大共Zの投影-セルの biocytin ラベル表示をスタックします。O/A: オリエンス/Alveus;PYR: 地層属三角骨;RAD: 地層結腸寄生虫。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: シナプス Ca2 +過渡電気刺激 (100 Hz で 3 刺激) のバーストで誘発します。(A) 最大 2 光子Zの投影-Alexa 594 でいっぱいパッチの介在を示すスタック (148 μ m)。白い矢印は、バスケット細胞介在神経を示唆、錐体層内の軸索端末の場所をポイントします。(B) 単一焦点面刺激電極が配置された樹状突起の分岐を示します。破線 (C1 と C2) に示すようにライン スキャンの場所を示しています。(C) 画像 (1; 赤でライン スキャンの結果を示すAlexa-594。20 μ M) と緑 (2;オレゴン グリーンこれら-5N;300 μ M) チャネル。画像は、C2 に表示されるセグメントで誘発される以上 30 μ m. (D) トレース Ca2 +トランジェント (猫) を示す応答の普及を分析する小さなセグメントにビンだった。トップのトレースは、イメージングの試用期間中に体細胞レベルで記録された電気刺激電圧応答を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ソリューション | コンポーネント | 濃度 (mM) |
| アプライド ノーマル | 塩化ナトリウム | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| アプライド回復 | 塩化ナトリウム | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| アプライド ショ糖 | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| グルコース | 10 | |
| ショ糖 | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-ベースの修正プログラム ソリューション | K+グルコン酸 | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin ・ ディ ・ (トリス) 塩 | 10 | |
| ATP トリス | 2 | |
| GTP トリス | 0.2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| オレゴン グリーン-これら-1 | 0.2 |
表 1: ソリューションのレシピ。化合物およびプロトコル間で使用するソリューションのための集中。
| 問題 | ソリューション |
| 健康的なニューロンのパッチを適用することができません。 | スライスが正常であるの兆候チェック: 縮んだやセル、表示核などの腫れ。もしそうなら、スライスを破棄します。また確認パッチ ピペット抵抗と修正プログラム ソリューションの浸透圧;値が適切な範囲にない場合は、それらを置き換えます。 |
| 樹状突起から蛍光信号が低い | 記入するセルを長く待ちます。閉塞は、セルに拡散から修正プログラム ソリューションを維持は場合、パッチ ピペットで負圧の少量を適用しようとします。 |
| 電気刺激はない ca 2 + 応答を想起させる | 電気生理学的記録におけるアーチファクトの存在を確認します。休むなら、短-回路/刺激のチェック ユニット異常。場合は、刺激強度を上げるか近い刺激ピペットを樹状に移動します。刺激電極と、樹状突起との間の距離が um シナプス応答の勉強時に樹状突起の直接脱分極を防ぐために 8 を超えない注意が必要です。 |
| 誘発 ca 2 + シグナルはあまりにも高/飽和 ca 2 + インジケーター | レーザー出力を下げます。複数のセルで問題が解決しない場合を使用して、異なる ca 2 + インジケーター、 低 ca 2 + 親和性。 |
| ベースライン ca 2 + シグナルが実験中に徐々 に増加しています。 | 個々 のスキャン間の長い期間を待ちます。ベースラインはまだ増加している場合は、停止します。 買収;それは細胞の健康は減少している可能性が高いことを示します。 |
| スキャン中に ca 2 + 信号の振幅を減少させる | レーザー パワーを削減またはズーム アウト (該当する場合)。 |
| 樹状突起はスキャンした後 (「ブレブ」) を寸断されて | レーザー パワーを削減またはズームアウトします。ブレブは、ターゲットを絞った樹状突起に制限がある場合別の樹状突起を選択しレーザー パワー/ズームアウトします。複数の樹状突起はブレブ、集録を停止します。 |
| 蛍光信号"漂流している「スキャン ラインから掃引後 | アプライド灌流の速度を減らすことによってスライスの動きを低減します。、修正プログラムを適用する前に、します。 スライスがネットで強く場所に固定されことを確認。 |
表 2: トラブルシューティング テーブル。Ca2 +イメージング実験中に発生する可能性がありますある一般的な問題の解決策。
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Discussion
ここに示すメソッドでは、勉強して樹状 Ca2 +急性脳スライスにおける神経樹状突起におけるシグナル伝達のための 2 光子励起 Ca2 +イメージングとパッチ ・ クランプ電気生理学の組み合わせの使用方法を示します。このメソッドは両方ローカル Ca2 +標高樹枝状のセグメントと細胞の体細胞応答に電気刺激や逆伝搬 AP により誘発されるを監視することができます。樹状ツリーのさまざまな部分の入力を統合し、相馬と通信を勉強する優れたツールとなります。実験の長さを考えると、特に注意は細胞の健康に樹状突起の光損傷を避けるためにイメージングのためのレーザー パワーの使用を制限することによって支払われる必要しますが、あります。これは、ズーム レベルを減少させる、スキャンの期間を短縮、画像集録時にスキャンの速度を増加しても達成できます。介在ニューロンの樹状突起を画像追加の問題が生じます。これらの細胞の樹状突起に棘があるないように、樹状突起に沿ってスキャン シナプス Ca2 +ミクロ相分離構造のローカリゼーションを促進する推奨します。さらに、高い内因性 Ca2 +結合容量を考えると、Ca2 +標高介在ニューロンの樹状突起では、小さいと錐体細胞の樹状突起で生成されたより遅いです。これは Ca2 +シグナル動態を適切に記述するために個々 のエネルギーの十分に長い期間だけでなく、平均化するためのいくつかのライン スキャン画像を取得必要があります。
バイポーラ シータ ガラス電極を用いた局所電気刺激樹状シナプス Ca2 +ミクロ相分離構造のキャラクタリゼーションのための便利なツールを表します。しかし、それがまだアクティブに異なる"en passant"軸索が特定の地域にあります。活性化入力の数はこの場合は知られていると追加の計算ツールを使用してのみ推定することができます。二光子励起グルタミン酸 uncaging 神経は27、複数の個々 のシナプスの同時刺激できますが、ローカル樹状 Ca2 +応答を引き出すための良い代替を表します。このメソッドは、興奮性シナプス構造 (棘) 明確に定義、主細胞の研究で広く使用されてが、全体が低い背骨密度を持っている介在ニューロンの研究に適していません。Uncaging 神経のグルタミン酸介在ニューロン樹状突起に沿ってそれがプリンシパルのセルに適用されるやむを得ずをアクティブにする複数の櫛谷メカニズムの Ca2 +シグナル9,10, 解釈が困難、観測。
過去 10 年間では、光技術の進歩は 2 光子励起 Ca2 +イメージングの時間分解能向上を提供しました。最も有望な 1 つは音響光学偏向器 (AODs)28,29を介してランダム アクセス顕微鏡 (ランプ) です。異なり、従来のラスター スキャン、ランプは高周波慣性無料 AODs のスピードによって有効になっているで興味の選択したポイントをスキャンします。線形パターンで広げて置かれるポイントに限定されるわけで、同時に複数の樹状突起分岐学にとって理想的です。ただし、高い時間分解能の AODs によって提供される必要がありますいない Ca2 +イベント同じ焦点プラン内でミリ秒単位の何百もの持続をイメージングするとき。さらに、興味の同じ構造内のポイントをスキャンの場所は良いスライス品質に必要な高灌流率に関連付けられているスライス標本マイクロ ドリフトのため制御が困難な可能性があります。したがって、プロジェクトのこの記事で紹介した高時間分解能 (500-700 Hz) ライン スキャン ベースの取得メソッドは、個々 の樹枝状の枝で Ca2 +イメージング方が望ましい。
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Disclosures
著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。
Acknowledgments
この作品は、健康の研究のカナダの協会、自然科学工学研究協議会 (レベル検出グラント)、サヴォイ財団によって支えられました。OC は、レベルから博士フェローシップによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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