Neuroscience

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/56776

¹CHU de Québec-Université Laval Research Center, Université Laval, ²Department of Biochemistry, Microbiology and Bioinformatics, Université Laval

Summary

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca^{2 +} שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Abstract

הדמיית סידן (Ca^{2 +}) הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הדינמיקה ייתכן של אותות תאיים^{2 +} Ca בדנדריטים עצביים. Ca^{2 +}תנודות יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של הממברנה, מנגנונים תאיים, לשחק תפקיד מכריע של אינדוקציה של פלסטיות סינפטית, ויסות דעתנית דנדריטים. מכאן, היכולת להקליט סוגים שונים של Ca^{2 +}אותות בענפים דנדריטים הוא יקר עבור קבוצות לומדים איך דנדריטים לשלב מידע. כניסתו של מיקרוסקופ שני הפוטונים עשה מחקרים כאלה קל יותר באופן משמעותי על ידי פתרון הבעיות כדי הדמיה ברקמה חיה, כגון פיזור אור, נזקי. יתר על כן, באמצעות שילוב של שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונאלי עם שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה, זה אפשרי לחקור המקומי Ca^{2 +}תנודות דנדריטים עצביים במקביל עם הקלטות של פעילות סינפטית סומה. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הדינמיקה של רשות מקומית^{2 +} תופעות מעבר (חתולים) בדנדריטים של GABAergic interneurons מעכבות. השיטה ניתן להחיל גם ללמוד דנדריטים Ca^{2 +} איתות סוגים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Introduction

התרומה של נוירון לפעילות הרשת נקבעת במידה רבה על ידי באופי הדינמי של הקלט סינפטית שהיא מקבלת. באופן מסורתי, השיטה הדומיננטית של אפיון פעילות סינפטיים בנוירונים הסתמך על תיקון שלם-תא הסומטית-קלאמפ הקלטות של זרמי postsynaptic עורר על ידי גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. עם זאת, הפעילות היחידה של הסינפסות ממוקם הציר הקרוב הוא דיווח בכנות במקרה הזה¹. בנוסף, כדי להעריך את המנגנונים הספציפיים סינפסה, שימשו הקלטות זוגות נוירונים ומן דנדריטים במיקום ספציפי למטרה הסינפסות עניין ולפי המנגנון של אינטגרציה דנדריטים, בהתאמה. פריצת דרך בתחום הפיזיולוגיה סינפטית הושג באמצעות נישואים של טכניקות אופטי אלקטרופיזיולוגיות. סריקת מיקרוסקופ (2PLSM) בשילוב עם Ca^{2 +} הדמיה וכלים optogenetic לייזר שני הפוטונים עירור עלול לחשוף פרטים עצומה של הארגון הדינאמי של פעילות סינפטית ספציפי חיבורים עצביים במוח פרוסות חוץ גופית ו ויוו.

מספר יתרונות מרכזיים שנעשו 2PLSM להתבלט מיקרוסקופ עירור קונבנציונאלי, פוטון אחד²: (1) בשל אופי לא לינארית של שני הפוטונים עירור, נוצר על ידי קרינה פלואורסצנטית רק באמצעי אחסון מוקד ולאחר כל הפוטונים הנפלטים מייצגים שימושי אותות (אין צורך חריר); (2) אורכי הגל, בשימוש 2PLSM, לחדור את הרקמה פיזור ביעילות רבה יותר; בנוסף, פוטונים מפוזר הם גם לדלל לייצר שני הפוטונים עירור, רקע זריחה; (3) נזקי phototoxicity מוגבלים גם למישור מוקד. לכן, למרות העלות הגבוהה של פוטון 2 מערכות בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי, נשאר 2PLSM שיטת הבחירה לחקירה ברזולוציה גבוהה של מבנה העצבית ותפקוד ברקמת החיים עבה.

היישום הראשון של 2PLSM ברקמות פיזור היתה תמונת המבנה והתפקוד של הדנדריטים³. 2PLSM בשילוב עם Ca^{2 +} הדמיה חשפה שהפונקציה קוצים כמו תאים מבודדים הביוכימי. מאז בסוגי עצביים רבים יש התאמה של אחד לאחד בין קוצים בודדים הסינפסות⁴, שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה בקרוב הפך להיות כלי שימושי דיווח הפעילות של הפרט סינפסות רקמות ללא פגע⁵^, ⁶^,⁷^,⁸. יתר על כן, Ca^{2 +} דימות מבוסס 2PLSM שימש בהצלחה כדי לפקח על הפעילות של ערוצי סידן יחיד, יחסי גומלין לא לינארית conductances פנימי וסינפטית, כמו גם כדי להעריך את מצב פעילות ותלוי רגולציה של Ca^{2 +} איתות דנדריטים עצביים⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹.

סידן הוא שליח השני תאיים בכל מקום, ייתכן האירגון subcellular קובע את הכיוון של תגובות פיזיולוגיות, מפני שינויים סינפטיים כוח ברגולציה של יון ערוצי, צמיחה דנדריט ועמוד השדרה, כמו כמו מוות של תאים, הישרדות. Ca דנדריטים^{2 +} הגבהים להתרחש באמצעות הפעלה של נתיבים מרובים. פוטנציאל פעולה (APs), backpropagating אל דנדריטים, פתיחת ערוצי סידן ממותגת מתח¹² ומפיקים יחסית הכללית Ca^{2 +} תופעות מעבר (חתולים) דנדריטים, קוצים¹³. הסינאפסית מזוהה עם ההפעלה של Ca postsynaptic^{2 +}-קולטנים חדיר (NMDA, Ca^{2 +}-חדיר אמפא, kainate), מפעילה סינפטית חתולים¹⁴^,⁶^,¹⁵. לבסוף, ניתן להפיק supralinear Ca^{2 +} אירועים של דנדריטים תחת מסוים התנאים¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶.

שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה בשילוב עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-קלאמפ מעסיקה Ca סינתטי^{2 +}-אינדיקטורים פלורסנט רגיש, אשר מועברים בדרך כלל דרך האלקטרודה תיקון במהלך הקלטות שלם-תא . שיטה סטנדרטית על כימות של Ca^{2 +} דינמיקה מבוסס על כביש¹⁷^,שיטת מחוון כפול¹⁸. הוא משתמש fluorophores שני עם ספקטרום הפליטה מופרדים היטב (למשל, שילוב של אדום Ca^{2 +}-צבע אטום עם ירוק Ca^{2 +} אינדיקטורים, כגון אורגון הירוקה BAPTA-1 או Fluo-4) יש מספר יתרונות בהשוואה שיטת אינדיקציה יחידה. ראשית, Ca^{2 +}-צבע רגישות משמש כדי לאתר מבנים קטנים עניין (סניפים דנדריטי ואת עמוד השדרה) שבו יבוצעו Ca^{2 +} הדמיה. שנית, היחס בין שינוי ירוק ואדום קרינה פלואורסצנטית (ΔG/R) מחושבת כאמצעי של [Ca^{2 +}], המהווה במידה רבה רגישות לשינויים בסיסית פלורסצנטיות עקב תנודות [Ca^{2 +}]₀¹⁷ ^, ¹⁸. יתר על כן, התפקיד פלורסצנטיות השינויים מבחינת מוחלטת Ca^{2 +}ריכוזים¹⁹.

דאגה כללית בעת הפעלת שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה ניסויים בפרוסות חריפה היא בריאות ויציבות של רכישת התמונה עקב עוצמת הלייזר גבוהה משמש בדרך כלל. בנוסף, Ca^{2 +} ניסויים הדמיה, קיים חשש על ההפרעות, ניכר מופרזת של Ca subcellular^{2 +} דינמיקה בשל העובדה כי Ca^{2 +} מחוונים לשמש ניידים במיוחד אקסוגני Ca^{2 +} מאגרים. לכן, הבחירה של מחוון Ca^{2 +} והריכוז שלו תלוי על סוג עצביים, משרעת הצפויה של חתולים, השאלה ניסיוני.

שינינו את שיטת שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה עבור חקירת Ca^{2 +} תנודות דנדריטים של GABAergic interneurons⁹^,¹⁰^,¹¹^,²⁰^,²¹ ^, ²². בעוד עיקר מוקדם Ca^{2 +} הדמיה מחקרים נעשו בו נוירונים העיקרי, interneurons מעכבות להציג לראווה מגוון גדול של תפקודי Ca^{2 +} מנגנונים נבדלים אלה תאים כפירמידה²⁰ ^, ²³ ^, ²⁴. מנגנונים אלה interneuron ספציפיים (למשל, Ca^{2 +} חדיר אמפא רצפטורים) עשוי לשחק תפקידים ספציפיים בוויסות פעילות התאים. בעוד דנדריטים Ca^{2 +} איתות ב interneurons הוא מטרה מפתה לחקירה נוספת, שני הפוטונים Ca^{2 +} דימות in דנדריטים של תאים אלה מציגה אתגרים נוספים, מ בקוטר דק יותר של דנדריטים וחוסר קוצים כדי גבוהה במיוחד אנדוגני Ca^{2 +} מחייב קיבולת. כל תחומי המחקר שלנו המחקר של interneurons בהיפוקמפוס, פרוטוקול הבאות, בעוד החלים על אוכלוסיות עצביים שונים, הותאם להתמודד עם האתגרים הללו.

פרוטוקול זה הוצא להורג עם מיקרוסקופ שני הפוטונים מסחרי קונפוקלי, אשר מצויד עם גלאים חיצוניים, שאינם descanned שני (NDDs), אפנן אלקטרו-אופטיים (לבחירות) Dodt סריקת צבע ניגודיות (מפקדת הסטארגייט), מותקן על טבלת אופטי. המיקרוסקופ היה בשילוב עם Ti:Sapphire לייזר multiphoton במצב נעול ב 800 nm (> 3 W, 140 פעימות fs, 80 הרץ חזרה שער). מערכת ההדמייה היה מצויד מעטה אלקטרופיזיולוגיה רגיל, כולל תא זלוף עם בקרת טמפרטורה, פלטפורמה תרגום עם שני micromanipulators, מגבר microelectrode מבוקרת מחשב, של התקן דיגיטציה, גירוי היחידה, הנתונים רכישת התוכנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות רווחת החיה הגנה הוועדה של אוניברסיטת לאוול והמועצה קנדי על טיפול בעלי חיים.

1. הכנה ראשונית (אופציונלי: להכין יום מראש)

הכינו שלושה סוגים של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) פתרון (רגילה, סוכרוז, התאוששות פתרונות, 1 ליטר לכל; ראה טבלה 1). התאם את osmolality של הפתרונות ± 10 300 mOsm²⁵ . ומגניב כלנית חדד-סוכרוז עד נקודה ליד קירור (0-4 ° C).
הערה: השימוש של פתרון חיתוך דל-נתרן (כלנית חדד-סוכרוז) מסייעת לשמר את הכדאיות של נוירונים בשכבות השטחיות של פרוסות חריפה²⁶.
להכין 0.75 מ של תיקון-פתרון הכולל של fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594), מחוון ירוק סינתטי סידן (למשל, אורגון הירוקה BAPTA-1; ראה טבלה 1). כוללים biocytin (ראה טבלה 1) בפתרון התיקון-אם פוסט הוק זיהוי מורפולוגי של תאים מוקלטות נדרשת.
התאם את osmolality של הפתרון 280 mOsm ± 5 ו- pH 7.35 ± 0.5. שמור את הפתרון במקרר או על קרח בכל עת.
הערה: בחירה של מחוון סידן צריך להיות המבוססים על טווח דינמי שלה ועל אופיה של האירועים^{2 +} Ca ובדוקים.
שימוש של פולר micropipette, להכין טלאי פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2 מיקרומטר ≈ (פיפטה ההתנגדות של MΩ 3-5), גירוי פיפטות של נימים תטא-זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2-5 מיקרומטר.
הערה: ההגדרות פולר כדי להפוך פיפטות של קוטר נתון ו צורה ייקבעו לפי סוג נימה של פולר את תוצאות הבדיקה כבש עבור סוג מסוים של זכוכית.

2. בהיפוקמפוס פרוסה הכנה

עזים ומתנגד העכבר (P13-20; את הלחץ ואת המין של העכבר נקבעת לפי השאלה ניסיוני שפנתה) עם 1 מ"ל של איזופלוריין להציב על גבי מגבת נייר בתוך תא הרדמה אינהלציה. כאשר החיה הוא מורדם עמוקות, כפי שמעידים חוסר תנועה, נשימה איטית, להסיר אותו מהתא הרדמה, לערוף באמצעות גיליוטינה.
לחשוף את הגולגולת על ידי חיתוך העור עם זוג מספריים מהחלק האחורי של הגולגולת באף קטן. השתמש זוג קטן של העצם מיני rongeurs כדי לעשות חור ברמת bregma. ואז להשתמש המספריים לעשות חתך סימטרית-על-rostral לאורך התפר המשונן. עם rongeurs לאחוז האחורי של כל הגולגולת הכריכה, מעלית כלפי מעלה והחוצה כדי להסיר את הגולגולת כיסוי האונה כל.
אחרי המוח נחשף במלואו, לערער העצבים האופטים עם מרית קטנה. מסירים את המוח מהגולגולת והכניס אותו לתוך צלחת פטרי המכילות ברציפות מחומצן, קר כלנית חדד-סוכרוז (ראה טבלה 1 ריכוז סוכרוז).
1. אם הרקמה של עכברים בוגרים נדרש, לבצע זלוף intracardiac באמצעות מזרק (25 גרם) מלא 20 מ של חנה המבר כקרח-סוכרוז לפני החילוץ במוח כדי לקבל פרוסות באיכות טובה.
להכין פרוסות בהיפוקמפוס מהמוח בעלי חיים שחולצו.
1. תן הצינה המוח עבור בסביבות 2 דק מניחים חתיכת נייר סינון על צלחת פטרי וגדוש קרח, להעביר את המוח על גבי נייר הסינון. לנתח את שתי ההמיספרות.
2. הדבק את ההמיספרות גזור (הכיוון נקבעת על-ידי המטרה ניסיוני כדי לקבל פרוסות הפרונטליים, חציה או אופקי) על גבי שולחן vibratome, לטבול אותו במגש vibratome מלא עם חנה המבר מחומצן כקרח-סוכרוז. להפוך 300-מיקרומטר פרוסות עבות בטמפרטורה של 1 ° C באמצעות vibratome קריר או הצבת הקרח סביב המגש vibratome.
3. בעזרת מכחול שטוח, לצבור את פרוסות המכילות בהיפוקמפוס (עד 6 פרוסות לכל חצי הכדור) באמבט המכיל חמצן חנה המבר-שחזור מחומם ל- 37 מעלות צלזיוס.
4. להשאיר את הפרוסות באמבטיה כלנית חדד-התאוששות למשך לפחות 45 דקות.

3. תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות

להציב פרוסה בהיפוקמפוס באמבט מתחת המטרה (הגדלה: 40 x, מפתח נומרי: 0.8) של מיקרוסקופ שני הפוטונים סריקה בלייזר. ללא הרף perfuse האמבטיה עם חמצן חנה המבר-נורמלית מחומם ב 30-32 מעלות צלזיוס בשיעור של 2.5-3 מ לדקה.
השתמש ניגודיות התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום (IR-DIC) או Dodt-מפקדת הסטארגייט מיקרוסקופ כדי לאתר תא עניין באמצעות שלה גודל, צורה, מיקום.
הערה: בהתאם האוכלוסייה נוירון יישוב, מודל הטרנסגניים העכבר ניתן לאתר בקלות תאים עניין. במקרה זה, שלב זה הרבה עם שימוש של מקור אור פלורסנט.
למלא פיפטה גירוי של פתרון כלנית חדד-נורמלית המכיל את fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594).
להגדיר את פיפטה גירוי (מחוברים יחידת גירוי חשמלי) על הפרוסה כך הקצה הוא באותו אזור של התא עניין.
לאחר מילוי של פיפטה תיקון עם פתרון תיקון וצירופם לשלב ראש, להגדיר אותו על הפרוסה כך את קצהו הוא ישירות מעל התא של ריבית.
להשתלב מזרק צימוד-כיוונית וחבר אותו התיקון-פיפטה דרך הצינורית פלסטיק. להזריק לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטה תיקון (≈ 0.1 מ"ל) באמצעות המזרק. שמור את צימוד במצב "סגור".
להפעיל את המודול תוכנות שליטה מגבר, לעבור למצב המתח להדק בלחיצה על כפתור "VC". פתח אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה (למשל, clampex) עבור רכישת של אותות אלקטרופיזיולוגיות ולחץ על הסמל "קרום מבחן" לעשות זה לשלוח ללא הרף את מתח מרובע דופק (5 mV, 10 ms), אשר יש צורך לנטר שינויים בהתנגדות פיפטה.
. תוריד את פיפטה תיקון עד שזה ישר לראש התא יישוב. בעת יצירת קשר עם קרום התא, להסיר את הלחץ על-ידי הפעלת את צימוד למצב 'פתח'.
הערה: קשר עם קרום התא מזוהה בעת עלייה קטנה במחתרת פיפטה (≈ 0.2 MΩ) נתפסת והיא כניסה קטן על התא נגרמת על ידי לחץ אוויר חיובי.
לחץ שלילי קלה חלות על פיפטה תיקון באמצעות על מזרק ריק מצויד לתוך צימוד עד ההתנגדות פיפטה שמספקת התוכנה מגיע 1 GΩ. בחלון "הבדיקה" קרום"של התוכנה רכישת נתונים, מהדק את התא ב-60 mV.
המשך הפעלת לחץ שלילי עד התא נפתח תצורת כל-תא מושגת. זיהוי של מדינה תא מתבסס על השינוי הפתאומי ההתנגדות פיפטה (מתוך GΩ 1 ל 70-500 MΩ בהתאם לסוג interneuron) ואת המראה של תופעות מעבר קיבולי גדול בחלון "הבדיקה" קרום".

4. שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה

אם מעוניינת התגובות postsynaptic סינאפסות, להוסיף את gabazine חוסם קולטן GABA_A (10 מיקרומטר) ו את חוסמי קולטן GABA_B CGP55845 (2 מיקרומטר) באמבטיה כלנית חדד.
במודול תוכנת שליטה מגבר, הגדר את תצורת תיקון הנוכחי-קלאמפ על-ידי לחיצה על כפתור "CC" ולהקליט דפוס הירי של התא בתגובה סומאטית זריקות של depolarizing הנוכחי (0.8-1.0 nA, 1 s). המתן לפחות 30 דקות של התא תהיה מלאה האינדיקטורים נוכח הפתרון תיקון.
הערה: ירי דפוס ומאפיינים פעיל של התא יכול לשמש כדי לזהות את סוג המשנה של התא; למשל, תאים עולה מהר. חשוב על ריכוז מחוון לייצב באמצעות דיפוזיה לפני שמתחילים להקליט חתולים (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).
AP-עורר חתולים
1. באמצעות התוכנה רכישת התמונה, להתחיל רכישת תמונות. אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום. כדי להבטיח תגובה גלויה, ראשית, לבחור דנדריט צינתור (≤ 50 מיקרומטר) כמו היעילות של AP backpropagation עלולה לרדת באופן משמעותי עם מרחק GABAergic interneurons²².
2. באמצעות הכלי' מלבני' בתוכנה רכישת התמונה, להגדיל האזור ולעבור "xt" מצב (linescan). מקם את הסריקה ברחבי הסניף דנדריטים של ריבית. עם עוצמת לייזר בקרי בתוכנת רכישה, להגדיר את הלייזר שני הפוטונים ברמה כוח מינימלי איפה בסיסית ירוק הוא גלוי רק מעט, כדי להימנע phototoxicity.
3. באלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה 'פרוטוקול' חלון ותמונה רכישת תוכנה, ליצור גירסת ניסיון הקלטה של משך הנסיעה המכיל זריקה הנוכחי סומאטית של משרעת הרצוי.
  1. באמצעות התוכנה רכישת התמונה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" ולרכוש פלורסצנטיות ברציפות עבור חזור ס' 1-2 הרכישה תמונה 3 - 10 פעמים. חכה לפחות 30 s בין הסריקות יחיד כדי למנוע נזקי. אם רכישת linescans בנקודות מרובים לאורך דנדריט, לקחת אותם בסדר אקראי כדי למנוע תופעות סדר.
חתולים עורר synaptically
1. אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום.
2. הגדר את פיפטה גירוי על פני השטח של הפרוסה מעל דנדריט עניין. הורידו לאט את פיפטה גירוי למקומו, צמצום התנועה כדי שלא להפריע למטופלים את תצורת כל תא. מקם פיפטה של 10-15 מיקרומטר של פיתוח.
3. כדי להמחיש את המיקום של microdomains סינפטית ב aspiny דנדריטים, בתוכנה רכישת התמונה לעבור 'xt' (linescan) מצב ומקם את הקו לאורך הענף דנדריטים עניין.
4. "פרוטוקול" חלון (אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת תוכנה), תמונה רכישת תוכנה, ליצור משפט הקלטה שמפעיל את יחידת גירוי לאחר תחילת המשפט.
5. באמצעות רכישת התוכנה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" כדי לסרוק לאורך פיתוח ברציפות עבור רכישת חוזר ס' 1-2 3 - 5 פעמים, מחכה 30 s בין הסריקות כדי למנוע נזקי.
  הערה: האורך של הסריקה ניתן להתאים בהתאם קינטיקה של האירוע עורר, אך צריך להיות ממוזער כדי למנוע נזקי (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).
6. חזור על שלב 4.5.5 בתנאים שונים (למשל, העוצמה/אורך שונים של גירוי, הקדמה של חוסם הפריטים המוקפצים תרופתי, וכדומה) בהתאם לשאלה ספציפית נותרים ללא מענה.
7. לעצור את הרכישה כאשר התא מראה סימנים של הידרדרות בריאות: דפולריזציה מתחת-45 mV, עלייה הבסיס Ca^{2 +} רמה, הידרדרות מורפולוגי של דנדריטים (למשל, blebbing, פיצול; ראה בטבלה 2 פתרון בעיות).
8. כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא לשמור רשומה של המיקום של פיפטה גירוי, רוכשים את Z -ערימה של התא ערוץ הצבע האדום. שימוש בתוכנת רכישה ב 'xyz' מצב, מציבה את הגבולות העליונים והתחתונים מחסנית לשיקוף את התא כולו עם כל התהליכים כללו. להגדיר את 'גודל צעד' ב 1 מיקרומטר וליזום הרכישה מחסנית באמצעות לחצן "התחל רשומה".
9. כאשר Z-מחסנית הרכישה הושלמה, השתמש באפשרות "הקרנה מרבי" בתוכנה כדי להרכיב כל התכניות מוקד המחסנית של ולוודא את האיכות של רכישה. ואז, לאט לאט נסגרים על פיפטה תיקון מחוץ הפרוסה
10. כדי לתקן את הפרוסה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק , להסיר את הפרוסה של האמבטיה באמצעות מכחול שטוח, ובמהירות במקום זה בין בשני העיתונים מסנן, צלחת פטרי מלא כלנית חדד. להחליף את חנה המבר פתרון paraformaldehyde (PFA) 4% ולהשאיר את המנה 4 ° C החדר או במקרר למשך הלילה.

5. אימונוהיסטוכימיה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק של תאים מוקלט

הערה: לאחר לילה 1 של קיבוע מחברים, הפרוסה ניתן לאחסן במאגר פוספט (PB) עם אזיד הנתרן (0.5%) עד כחודש.

הכניסו את הפרוסה באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) עם טריטון X-100 (0.3%) ולבצע שוטף 4 (5-10 דקות כל אחד).
הכניסו את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% עם 10% נסיוב עז רגילה (הגדרות) 1 h.
לשים את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% 1% המיתרים, של Streptavidin מצומדת fluorophore (למשל, אלקסה עבור חיל הים 546-מצומדת Streptavidin, 1:200) עבור לילה הדגירה.
לשטוף 4 פעמים (5-10 דקות) ב- TBS.
הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ, התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי שיחזור תא מלאה, לרכוש Z-מחסנית (שלב גודל: 1 מיקרומטר) באמצעות מטרה 20 x. עבור הדמיה תווית של אלקסה-546-מצומדת, להגדיר שימוש בלייזר nm 543 וזיהוי nm 515-560 לסנן.

6. ניתוח של חתולים

לחלץ את הערכים פלורסצנטיות מהאזורים של הריבית (ROIs) של תמונות linescan מן הערוצים אדום וירוק, ממוצע של הערכים של חוזר מרובים עבור כל תנאי להפחית את הרעש.
הערה: כאשר linescan הרכישה מתבצעת לאורך פיתוח, זה אפשרי לחלץ נתונים מתוך ROIs מרובים, אשר יתאימו ל- microdomains דנדריטים (2-5 מיקרומטר), ובכך מאפשרים לימוד Ca^{2 +} אות מידור.
עבור כל רועי, לבטא את השינויים ב- Ca^{2 +} משרעת כמו:

הערה: כאן G הוא הערך פלורסצנטיות מערוץ ירוק; G₀הוא הערך פלורסצנטיות בסיסית בלבד לערוץ הצבע הירוק במהלך תקופת טרום גירוי; R הוא הערך זריחה של הערוץ האדום¹⁸. שני הפוטונים עירור הוא מקומי מאוד, אינו יוצר רקע משמעותי, חיסור של רקע זריחה אינה נדרשת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, השגנו חתולים עורר סומאטית נוכחי הזרקת ועל ידי גירוי חשמלי של דנדריטים של oriens/alveus interneurons באזור CA1 של ההיפוקמפוס. לאחר תיקון נוירון, מזוהה המבוסס על הצורה והמיקום שלה, השגנו linescans על פני דנדריט הפרוקסימלית נקודות מרובות-נתן מרחקים סומא (איור 1 א'). . הבחנו בירידה משרעת של חתולים שנגזרות backpropagating APs כמו המרחק בין סומא מוגברת (מצביע על כך משרעת AP מופחתת או ירידה מרחק תלויי סידן ערוץ הפצה, איור 1B). לאחר אימונוהיסטוכימיה (באמצעות Streptavidin מצומדת אלקסה עבור חיל הים 546), היינו מסוגלים לאחזר תיוג biocytin של התא ולזהות מוקלטת הנוירון כמו תא bistratified עם האקסון הכובש שכבה oriens ו- radiatum שכבה (איור 1 C). בניסוי השני, פיפטה גירוי הובא לאתר דנדריטים דיסטלי. סריקה לאורך פיתוח, הצלחנו ואז להעריך את משרעת של Ca postsynaptic^{2 +} האותות בענף דנדריטים נתון (איור 2A–C) בתגובה גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. החתולים postsynaptic שונה בין microdomains השכנות דנדריטים (קטע 1 עד 6; איור דו-ממדי), אשר יכולה להיות קשורה כפולה של Ca^{2 +} אות מאזור ייזום ו/או מנגנונים שונים postsynaptic מעורב.

איור 1: נציג דוגמה עורר AP Ca^{2 +} תופעות מעבר. (א) מקסימום הקרנת שני הפוטונים Z-ערימת interneuron מתוקנת (13 מיקרומטר) מלא עם אלקסה-594 (20 מיקרומטר). קווים לבנים מציינות את מיקום ואורך linescans. עקבות (B) מציג את החתולים elicited במיקומים שמוצג מעקב א העליון מראה הרכבת AP קצר שצומח סומאטית נוכחי הזרקת במהלך ההקלטה למשפט. סרגל הזמן הוא זהה על כל העקבות המוצג. (ג) מקסימום הקרנת קונאפוקלית Z-מחסנית מציג תיוג biocytin של התא. O/A: Oriens/Alveus; PYR: הרובד Pyramidale; ראד: שכבה Radiatum. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: Postsynaptic Ca^{2 +} תופעות מעבר עורר על ידי פרץ של גירוי חשמלי (3 גירויים-100 הרץ). (א) מקסימום הקרנת שני הפוטונים Z-מחסנית (148 מיקרומטר) מציג interneuron תוקנו מלא עם אלקסה-594. ראשי חץ לבן הצבע על המיקום של מסופי עצב בתוך שכבת כפירמידה, מציע ש-interneuron הוא תא סל. (B) מטוס מוקד יחיד הממחישות הענף הדנדריטי בו הוצב האלקטרודה גירוי. הקו המקווקו מראה את המיקום של linescan המוצגים (C1 ו- C2). (ג) תמונות הממחישות את התוצאה של linescan באדום (1; אלקסה-594; 20 מיקרומטר) וירוק (2; אורגון הירוקה Bapta-5N; ערוצי מיקרומטר 300). התמונות נזרקו למקטעים קטנים יותר כדי לנתח את התפשטות התגובה מעל 30 מיקרומטר. (D) עקבות מציג את^{2 +} Ca שנחשולי (חתולים) elicited בקטעים המוצג בתא C2. המעקב העליונה מציגה את התגובה מתח גירוי חשמלי שנרשם באותה רמת סומאטית במהלך המשפט הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פתרון	רכיב	ריכוז (מ מ)
כלנית חדד-נורמלית	NaCl	124
	אשלגן כלורי	2.5
	₂PO NaH₄	1.25
	MgSO₄	2
	NaHCO₃	26
	גלוקוז	10
	CaCl₂	2
כלנית חדד-שחזור	NaCl	124
	אשלגן כלורי	2.5
	₂PO NaH₄	1.25
	MgSO₄	3
	NaHCO₃	26
	גלוקוז	10
	CaCl₂	1
כלנית חדד-סוכרוז	אשלגן כלורי	2
	₂PO NaH₄	1.25
	MgSO₄	7
	NaHCO₃	26
	גלוקוז	10
	סוכרוז	219
	CaCl₂	1
K⁺-המבוסס על פתרון תיקון	K⁺- gluconate	130
	HEPES	10
	MgCl2	2
	Phosphocreatin di (טריס) מלח	10
	ATP-טריס	2
	GTP-טריס	0.2
	Biocytin	72
	אלקסה-594	0.02
	אורגון ירוק-BAPTA-1	0.2

טבלה 1: מתכונים פתרון. תרכובות וריכוזי לפתרונות ששימש את הפרוטוקול.

הבעיה	פתרון
אין אפשרות לתקן נוירון בריא	לבדוק סימנים כי הפרוסות הם לא בריאים: שחניכיה או נפוחה תאים, גרעינים גלוי, וכו '. אם כן, מחק את הפרוסות. גם לבדוק את ההתנגדות תיקון-פיפטה ו osmolality של הפתרון התיקון; להחליף אותם אם הערכים אינם בטווח המתאים.
קרינה פלואורסצנטית האיתות דנדריטים הוא נמוך	חכי עוד עבור התא למלא. אם מכשול מעכב את הפתרון-התיקון מ לשדר לתוך התא, לנסות למרוח כמות קטנה של לחץ שלילי בהתיקון-פיפטה.
גירוי חשמלי הוא לא לעורר תגובה Ca2 +	לבדוק נוכחות של חפץ בהקלטה אלקטרופיזיולוגיות. אם נעדר, בדוק אם יש קצר-circuit/ממריץ תקלה יחידה. אם היא קיימת, להעלות את עוצמת גירוי או להעביר את גירוי פיפטה קרוב יותר דנדריט. זה כדי לציין כי המרחק בין האלקטרודה גירוי פיתוח לא יעלה על 8 אום למניעת ישיר דפולריזציה של דנדריטים כשלמדתי תגובות סינפטית.
עורר Ca2 + האות הוא גם גבוה/הרוויות Ca2 + מחוון	להפחית את עוצמת הלייזר. אם הבעיה נמשכת בתאים מרובים, השתמש שונים Ca2 + מחוון. עם התחתון Ca2 + משיכה.
בסיסית Ca2 + האות הולך וגדל בהדרגה במהלך הניסוי	להמתין פרק זמן ארוך יותר בין הסריקות בודדים. אם הבסיס עדיין עולה, לעצור רכישה; הוא מציין כי הבריאות של התא פוחת ככל הנראה.
משרעת של Ca2 + אות פוחתת במהלך סריקות	להפחית את עוצמת הלייזר או התרחקות (אם ישים).
דנדריט הוא מזימות ("blebbing") לאחר סריקה	להפחית את עוצמת הלייזר או התרחקות. אם blebbing הוא מוגבל ל פיתוח יישוב, לבחור אחרת דנדריט ו להפחית את עוצמת הלייזר / התרחקות. אם מספר דנדריטים הם blebbing, לעצור את הרכישה.
קרינה פלואורסצנטית אותות "נסחפים" מחוץ לקו הסריקה לאחר מטאטא	להפחית את תנועת הפרוסה על-ידי הפחתת המהירות של חנה המבר זלוף. לפני תיקון, להפוך . אני בטוח כי הפרוסה בחום קבוע במקום על ידי רשת

בטבלה 2: פתרון בעיות שולחן. פתרונות לבעיות נפוצות שעשויות להתעורר במהלך Ca^{2 +} הדמיה הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מדגים כיצד ניתן להשתמש השילוב של שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה electrophysiology תיקון-קלאמפ ללמוד דנדריטים Ca^{2 +} איתות של דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות. שיטה זו מאפשרת ניטור של שניהם מקומי Ca^{2 +} הגבהים עורר על ידי חשמל AP גירוי או backpropagating מקטעים דנדריטים, ואת התגובה סומאטית של התא. זה עושה את זה כלי מצוין ללמוד חלקים שונים איך בעץ הדנדריטי לשלב תשומות ולתקשר עם סומא. אבל בהינתן אורך הניסוי, תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם הבריאות תא על-ידי הגבלת השימוש של עוצמת הלייזר הדמיה כדי למנוע את נזקי של דנדריטים. אפשר גם להשיג על ידי להקטין את רמת גודל התצוגה, הפחתת משך הסריקה להגדיל את מהירות הסריקה במהלך ייבוא תמונות. הדמיה interneuron דנדריטים מציג אתגרים נוספים. כמו דנדריטים של תאים אלה יש אין קוצים, סריקה לאורך פיתוח מומלץ כדי להקל על הלוקליזציה של Ca postsynaptic^{2 +} microdomains. בנוסף, לאור אנדוגני Ca^{2 +} איגוד קיבולת גבוהה, Ca^{2 +} הגבהים של דנדריטים interneuron הם קטנים יותר איטי יותר מאשר אלה המופקים של דנדריטים של תאים כפירמידה. זה דורש רכישת מספר תמונות linescan עבור חישוב ממוצע כמו גם משך ארוכה דיה של linescans בודדים כדי לתאר את Ca^{2 +} אות קינטיקה כראוי.

גירוי חשמלי מקומי באמצעות אלקטרודת זכוכית-תטה דו-קוטבי מייצג כלי שימושי עבור אפיון של דנדריטים postsynaptic Ca^{2 +} microdomains. עם זאת, זה יכול עדיין להפעיל שונה "דרך הילוכו" אקסונים ממוקם באזור נתון. מספר כניסות מופעל במקרה זה לא ידוע, יכול להיות רק מוערך באמצעות כלים חישוביים נוספים. שני הפוטונים גלוטמט uncaging²⁷, המאפשר לגירוי סימולטני של הסינפסות נפרדים מרובים, מייצג חלופה טובה עבור העלאת המקומי דנדריטים Ca^{2 +}תגובות. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב למחקר של תאים עיקריים, אשר יש מוגדרים בבירור סינאפסות postsynaptic מבנים (קוצים), אך אינו מתאים היטב במחקר של interneurons, הכולל שבו יש צפיפות נמוכה עמוד השדרה. Uncaging גלוטמט לאורך פיתוח interneuron כאשר היא חלה על התאים העיקריים גיטימציה להפעיל מנגנונים extrasynaptic מרובים של Ca^{2 +}איתות⁹^,¹⁰, ולכן קשה לפרש תצפיות.

בעשור האחרון, התקדמות טכנולוגיות אופטיות הציע משופרות ברזולוציה הטמפורלית עבור שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה. אחד המבטיח היא גישה אקראית מיקרוסקופ (רמפה) דרך deflectors אקוסטו אופטי (AODs)²⁸^,²⁹. בניגוד רסטר קונבנציונאלי סריקה, סורק הרמפה שנבחר נקודות עניין בתדר גבוה, אשר מופעל על ידי מהיר ממהירות AODs נטולת אינרציה. זה אידיאלי עבור חקר רב ענפים דנדריטים, בו זמנית גם ככה לא מוגבל לנקודות נפרס בתבנית לינארית. עם זאת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר המוצעים על ידי AODs יכול להיות מיותר כאשר הדמיה Ca^{2 +} אירועים שנמשך מאות אלפיות השניה בתוך באותה תוכנית נקודתית. בנוסף, המיקום של סריקת נקודות בתוך המבנה באותו עניין ייתכן קשה לשלוט עקב מיקרו-נשתל בהכנות פרוסה קשורה עם שיעור גבוה זלוף, אשר הכרחי לאיכות פיצה טובה. ומכאן, שיטת רכישת מבוססי linescan ברזולוציה גבוהה טמפורלית (500-700 Hz) שהוצגו במאמר זה הוא עדיין עדיפה כאשר הדמיה Ca^{2 +}אותות בענפים בודדים דנדריטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הקנדית מכוני הבריאות מחקר מדעי הטבע, מחקר הנדסי (NSERC גילוי גרנט) וקרן סבוי. OC נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מ NSERC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na⁺	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems