Summary
Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.
Abstract
Proyección de imagen de calcio (Ca2 +) es una herramienta poderosa para investigar la dinámica espacio-temporal de Ca2 + señales intracelulares en las dendritas neuronales. CA2 + las fluctuaciones pueden ocurrir a través de una variedad de membranas y mecanismos intracelulares y juega un papel crucial en la inducción de la plasticidad sináptica y la regulación de la excitabilidad dendrítica. Por lo tanto, la capacidad para registrar diferentes tipos de señales de Ca2 + en ramas dendríticas es valiosa para estudiar cómo las dendritas integran información de grupos. El advenimiento de la microscopía de dos fotones ha facilitado este tipo de estudios significativamente mediante la solución de los problemas inherentes a la proyección de imagen en tejido vivo, como la dispersión de la luz y fotodaño. Además, a través de la combinación de técnicas electrofisiológicas convencionales con dos fotones Ca2 + proyección de imagen, es posible investigar local Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas neuronales en forma paralela a las grabaciones de la actividad sináptica en Soma. Aquí, describimos cómo utilizar este método para estudiar la dinámica de local Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas de las interneuronas inhibitorias GABAérgicas. El método puede ser aplicado también al estudio de dendríticas Ca2 + en diferentes tipos neuronales en rebanadas de cerebro agudo.
Introduction
La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso1. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca2 + la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.
Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia2: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.
El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas3. 2PLSM en combinación con Ca2 + la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales4, dos fotones Ca2 + imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto5, 6,7,8. Además, basado en la 2PLSM Ca2 + proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca2 + en las dendritas neuronales5,6,7,8,9,10,11.
El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca2 + elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales12 y producir a relativamente global Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas y espinas13. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca2 +-permeables receptores (NMDA, Ca2 +-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca2 + eventos en dendritas bajo ciertas condiciones11,12,13,16.
Emplea dos fotones Ca2 + proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca2 +-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca2 + se basa en el método de doble indicador17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca2 +-insensible tinta verde Ca2 + indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca2 +-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca2 + . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca2 +], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca2 +]017 , 18. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca2 + concentraciones19.
Una preocupación general cuando dos fotones Ca2 + de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca2 + proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca2 + dinámica debido a que los indicadores de Ca2 + actúan como móvil altamente exógeno Ca2 + almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca2 + y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.
Adaptamos el método de dos fotones Ca2 + proyección de imagen para investigación de Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas9,10,11,20,21 , 22. mientras que la mayor parte de los primeros Ca2 + imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca2 + mecanismos que son distintas a las de las células piramidales20 , 23 , 24. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca2 + permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca2 + en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca2 + en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca2 + vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.
Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de bienestar animal de la Comisión de protección Animal de Université Laval y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.
1. preliminar preparación (opcional: preparar 1 día de anticipación)
- Preparar tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Normal, sacarosa y soluciones de recuperación, 1 L cada; ver tabla 1). Ajustar la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 10 mOsm25 y enfriar la ACSF sacarosa hasta un punto cerca del punto de congelación (0-4 ° C).
Nota: El uso de una solución de corte bajo en sodio (ACSF-sacarosa) ayuda a preservar la viabilidad de las neuronas en las capas superficiales de rebanadas agudo26. - Preparar 0,75 mL de solución de parche que contiene un fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594) y un indicador de calcio sintético verde (p. ej., Oregon Green BAPTA-1; ver tabla 1). Incluyen la biocitina (ver tabla 1) en la solución de parche si post hoc la identificación morfológica de las células registradas.
- Ajustar la osmolalidad de la solución de 280 ± 5 mOsm y pH 7.35 ± 0.5. Mantener la solución en el refrigerador o en hielo en todo momento.
Nota: Elección del indicador de calcio se debe basa su rango dinámico y la naturaleza de las Ca2 + eventos investigados. - Utilizando un extractor de micropipeta, preparar pipetas de parche de Capillares de vidrio de borosilicato (véase Tabla de materiales) con una punta de 2 μm ≈ (resistencia de la pipeta de MΩ 3-5) y pipetas de estimulación de Capillares de vidrio de theta de borosilicato (véase tabla de Materiales) con una punta de 2-5 μm.
Nota: La configuración del extractor para pipetas de un diámetro determinado y la forma se determinará por el tipo de filamento del extractor y resultados de la prueba de rampa para un determinado tipo de vidrio.
2. hipocampo sector preparación
- Anestesiar el ratón (P13-20; la tensión y el sexo del ratón viene determinado por la pregunta experimental se aborda) con 1 mL de isoflurano sobre una toalla de papel dentro de una cámara de narcosis por inhalación. Cuando el animal está anestesiado profundamente, según lo evidenciado por la falta de movimiento y la respiración lenta, retire de la cámara de narcosis y decapitar con una guillotina.
- Exponer el cráneo mediante la reducción de la piel con un pequeño par de tijeras de la parte posterior del cráneo a la nariz. Utilice un par de gubias hueso mini para hacer un agujero en el nivel de bregma. Luego utilice las tijeras para hacer un corte caudal a rostral a lo largo de la sutura sagital. Con las gubias Sujete la parte posterior de cada aleta de cráneo y levante hacia arriba y hacia afuera para extraer el cráneo cubriendo cada hemisferio.
- Después de que el cerebro está completamente expuesto, socavar los nervios ópticos con una pequeña espátula. El cerebro del cráneo y colocarlos en una placa Petri conteniendo continuamente oxigenada, frío ACSF-sacarosa (ver tabla 1 para la concentración de sacarosa).
- Si el tejido de los ratones más viejos se requiere, realizar una perfusión intracardiaca mediante una jeringa (25G) con 20 mL de helado ACSF-sacarosa antes de la extracción de cerebro para obtener rebanadas de buena calidad.
- Se preparan rebanadas de hipocampales del cerebro de animales extraídos.
- Deje que el frío cerebro de alrededor de 2 minutos Coloque un pedazo de papel de filtro en una placa de Petri llenas de hielo, transferir el cerebro en el papel de filtro. Diseccionar los dos hemisferios.
- Los hemisferios disecados (la orientación se determina por el objetivo experimental para obtener rebanadas de coronal, transversal u horizontal) del pegamento en una mesa de vibratome y sumergirlo en la bandeja de vibratome con helada ACSF oxigenada-sacarosa. Hacer 300-μm rodajas gruesas en una temperatura de aproximadamente 1 ° C utilizando un vibratome refrigerador o colocar el hielo alrededor de la bandeja de vibratome.
- Usando una brocha plana, se acumulan las rebanadas con el hipocampo (para 6 rebanadas por hemisferio) en un baño que contiene oxigenado ACSF-recuperación calentado a 37 ° C.
- Deja las rodajas en el baño de la ACSF-recuperación de al menos 45 minutos.
3. celulares Patch-clamp grabaciones
- Establecido una rebanada hipocampal en un baño colocado debajo del objetivo (aumento: 40 x, apertura numérica: 0.8) de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Continuamente inundar el baño con oxigenada ACSF Normal calentada a 30-32 ° C a una velocidad de 2,5-3 mL/min.
- Uso de contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) o microscopía Dodt-SGC para localizar una celda de interés mediante su tamaño, forma y posición.
Nota: Dependiendo de la población de neuronas específicas, un modelo de ratón transgénico puede utilizarse para localizar fácilmente las células de interés. En este caso, este paso puede reemplazarse con el uso de una fuente de luz fluorescente. - Llenar una pipeta de estimulación con una solución de la ACSF Normal que contiene el fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594).
- Establece la pipeta de estimulación (conectada a una unidad de estimulación eléctrica) encima de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.
- Después de llenar la pipeta del parche con solución de parche y conectarlo a una fase principal, ponerlo sobre la rebanada de modo que su punta esté directamente sobre la célula de interés.
- Encaja una llave de tres vías con una jeringa y conéctela a la pipeta de parche a través del tubo plástico. Inyectar una presión positiva constante en la pipeta de parche (≈ 0,1 mL) utilizando la jeringa. Mantenga la llave de paso en posición "close".
- Activar el módulo de software de control de amplificador e interruptor al modo de pinza de voltaje haciendo clic en el botón "VC". Abra el software de adquisición de datos de electrofisiología (p. ej., clampex) para adquisición de señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de "Prueba de membrana" que continuamente envía un pulso de voltaje cuadrado (5 mV, 10 ms), que es necesario controlar cambios en la resistencia de la pipeta.
- Baje la pipeta de parche hasta que está justo encima de la celda objetivo. Al hacer contacto con la membrana celular, retire la presión girando la llave hasta la posición "abierta".
Nota: El contacto con la membrana celular se detecta cuando un pequeño aumento en la resistencia de la pipeta (≈ 0.2 MΩ) se ve y una pequeña hendidura en la célula es causada por la presión positiva. - Aplicar una ligera presión negativa en la pipeta patch usando una jeringa de vacíela instalada en la llave de paso hasta que llegue a la resistencia de pipeta proporcionada por el software de 1 GΩ. En la ventana de 'Test de membrana' del software de adquisición de datos, fije la celda a -60 mV.
- Siga aplicando presión negativa hasta que la célula se abre y se logra la configuración de célula entera. Detección de este estado de la célula se basa en el cambio repentino en la resistencia de la pipeta (de 1 GΩ a MΩ 70-500 dependiendo del tipo de interneurona) y la aparición de grandes transitorios capacitivas en la ventana de 'Test de membrana'.
4. dos fotones Ca2 + imagen
- Si está interesado en las respuestas postsinápticas excitatorias, añadir el gabazine de bloqueador de receptor GABAA (10 μm) y el bloqueador de los receptores GABAB CGP55845 (2 μm) en el baño de la ACSF.
- En el módulo de software de control de amplificador, establecer la configuración de parche a pinza de corriente haciendo clic en el botón "CC" y registrar el patrón de la leña de la célula en respuesta a las inyecciones somáticas de la corriente de despolarización (0.8-1.0 nA, 1 s). Espere al menos 30 min para la célula que se llena de los indicadores presentes en la solución de parche.
Nota: La celda patrón de disparo y propiedades activas se pueden utilizar para identificar el subtipo de la célula; por ejemplo, las células rápido disparando. Es importante para la concentración de indicador estabilizar a través de la difusión antes de comenzar a grabar gatos (ver tabla 2 para la solución de problemas). - AP-evocado gatos
- Utilizando el software de adquisición de imagen, iniciar la adquisición de imágenes. Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Para asegurar una respuesta visible, primero, elegir una dendrita proximal (≤ 50 μm) como la eficiencia de AP backpropagation puede disminuir significativamente con la distancia de interneuronas GABAérgicas22.
- Utilizando la herramienta' rectangular' en el software de adquisición de imagen, zoom en la región de destinada y cambiar a la "xt" (linescan) modo. Posición la exploración a través de la rama dendrítica de interés. Con los controladores de intensidad del laser en el software de adquisición, establecer el régimen de dos fotones láser a un nivel de mínima energía donde la fluorescencia basal verde es poco visible, para evitar fototoxicidad.
- En el software electrofisiología de adquisición de datos software de adquisición de imagen y de ventana de 'Protocolo', crear un ensayo de grabación de la duración deseada que contenga una inyección actual somática de la amplitud deseada.
- Utilizando el software de adquisición de imagen, haga clic en el botón "Start record" y adquirir la fluorescencia continuamente durante 1-2 s. repetir la adquisición de la imagen 3 - 10 veces. Espere al menos 30 s entre exploraciones solo para evitar el fotoenvejecimiento. Si adquirir linescans en múltiples puntos a lo largo de una dendrita, llevarlos en orden aleatorio para evitar efectos de orden.
- CCIS-evocado gatos
- Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.
- Ponga la pipeta de estimulación sobre la superficie de la rebanada sobre la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación en su lugar, reduciendo al mínimo movimiento para evitar alterar la configuración de célula entera. Coloque la pipeta en 10-15 μm de la dendrita.
- Para visualizar la ubicación de microdominios sináptica en las dendritas aspiny, en el software de adquisición de la imagen pase a la 'xt' (linescan) modo y posición de la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.
- En la ventana de 'Protocolo' (de software de adquisición de datos de electrofisiología) y software de adquisición de imagen, crear un estudio de grabación que activa la unidad de estimulación después del comienzo de la prueba.
- Utilizando el software de adquisición, haga clic en el botón "Start record" para explorar a lo largo de la dendrita continuamente para adquisición de repetir s. 1-2 3 - 5 veces, esperar 30 s entre exploraciones para prevenir el fotoenvejecimiento.
Nota: La longitud de exploración puede ajustarse dependiendo de la cinética del evento evocado, pero debe reducirse para evitar el fotodaño (ver tabla 2 para la solución de problemas). - Repita el paso 4.5.5 en diferentes condiciones (por ejemplo, diferente intensidad, longitud de la estimulación, la introducción de un bloqueador de farmacológico, etc.) dependiendo de la pregunta concreta que se aborda.
- Detener la adquisición cuando la célula muestra signos de deterioro de la salud: despolarización por debajo de -45 mV, aumento en la línea de base nivel de Ca2 + , deterioro morfológico de las dendritas (por ejemplo, el blebbing, fragmentación; ver tabla 2 para la solución de problemas).
- Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquirir una Z -pila de la célula en el canal rojo. Utilizando el software de adquisición de 'xyz' modo, establecer los límites superior e inferior de la pila a toda la célula de la imagen con todos los procesos incluidos. La magnitud en 1 μm e iniciar la adquisición de la pila utilizando el botón "Iniciar registro".
- Cuando la Z-pila adquisición es completa, utilice la opción de "Proyección de la máxima" en el software para superponer todos los planes focales de la pila y Compruebe la calidad de la adquisición. Entonces, retraiga lentamente la pipeta del parche de la rebanada.
- Para corregir el slice para identificación morfológica post hoc , rápidamente retirar el segmento del baño utilizando un pincel plano y colocar entre dos papeles de filtro, en un plato de Petri llenas de ACSF. Vuelva a colocar la ACSF con una solución al 4% paraformaldehido (PFA) y dejar el plato en una habitación de 4 ° C o el refrigerador durante la noche.
5. inmunohistoquímica para Post Hoc identificación morfológica de las células registradas
Nota: Después de 1 noche de fijación en la PFA, el segmento puede almacenarse en tampón de fosfato (PB) con azida de sodio (0,5%) durante 1 mes.
- Poner la rodaja en solución salina tamponada con Tris (TBS) con Triton X-100 (0.3%) y realizar 4 lavados (5-10 minutos cada uno).
- Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% con 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 hora.
- Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% 1% NGS y un fluoróforo conjugado estreptavidina (p. ej., Alexa Fluor 546 conjugado estreptavidina, 1: 200) para la noche incubación.
- Lavar 4 veces (5-10 min) en TBS.
- Monte rebanadas en imagen con un microscopio confocal y microscopio. Para que una reconstrucción completa de la célula, adquirir un Z-stack (tamaño de paso: 1 μm) usando un objetivo de 20 x. Para una etiqueta de Alexa-546-conjugado de la proyección de imagen, uso que un 543 nm láser y una detección de 515-560 nm filtro establecido.
6. Análisis de los gatos
- Extraer los valores de fluorescencia de las regiones de interés (ROIs) en las imágenes de linescan de los canales rojo y verdes y promedio de los valores de las múltiples repeticiones para cada condición reducir el ruido.
Nota: Cuando linescan adquisición se realiza a lo largo de la dendrita, es posible extraer datos de varios reyes, que pueden corresponder a microdominios dendríticas (2-5 μm), y permitiendo el estudio de la compartimentalización señal de Ca2 + . - Cada ROI, expresan los cambios en el Ca2 + amplitud como:
Nota: Aquí G es el valor de fluorescencia del canal verde; G0 es el valor de fluorescencia de línea de base del canal verde durante el período de estimulación previa; R es el valor de fluorescencia de la canal rojo18. Excitación de dos fotones es muy localizada y no genera un fondo importante, resta de la fluorescencia de fondo no es necesario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando el protocolo presentado aquí, obtuvimos gatos evocados por inyección actual somática y por estimulación eléctrica en las dendritas de las interneuronas oriens/alveus en el área CA1 del hipocampo. Después de remendar una neurona, identificada en su forma y posición base, hemos adquirido el linescans a través de una dendrita proximal en varios puntos en el dado Distancias desde el soma (figura 1A). Se observó una disminución en la amplitud de los gatos inducida por backpropagating APs como la distancia desde el soma aumentado (indicativo de reducida amplitud AP o una disminución dependiente de la distancia en la distribución de canales de calcio, figura 1B). Después de inmunohistoquímica (usando el conjugado estreptavidina-Alexa Fluor 546), hemos podido recuperar la biocitina de etiquetado de la célula e identificar la neurona registrada como célula bistratified con un axón ocupando oriens estrato y estrato radiatum (figura 1 C). en el segundo experimento, una pipeta de estimulación fue llevada a un sitio dendrítico distal. Exploración a lo largo de la dendrita, entonces fuimos capaces de evaluar la amplitud de las Ca2 + señales postsinápticas en una determinada rama dendrítica (figura 2A–C) en respuesta a la estimulación eléctrica de los axones de paso. Los gatos postsinápticos diferenciaron entre vecinos microdominios dendríticas (segmento 1 a 6; Figura 2D), que podría estar asociada con una extensión de Ca2 + señal de la zona de iniciación o diferentes mecanismos postsinápticos.
Figura 1: Ejemplo de transitorios de AP-evocado Ca2 + . (A) máxima proyección de un régimen de dos fotones Z-stack (13 μm) de una interneurona parcheado lleno de Alexa-594 (20 μm). Líneas blancas indican la ubicación y longitud de linescans. (B) rastros que muestran los gatos sacados en los lugares indicados en el rastro de la parte superior de la A. muestra el tren corto de AP generado a través de inyección somática actual durante la grabación de la prueba. Escala de tiempo es el mismo en todos los rastros que se muestra. (C) máxima proyección de un confocal Z-stack mostrando la biocitina de etiquetado de la célula. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Pyramidale del estrato; RAD: Estrato Radiatum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Postsinápticos Ca2 + transitorios evocadas por una ráfaga de la estimulación eléctrica (3 estímulos a 100 Hz). (A) máxima proyección de un régimen de dos fotones Z-stack (148 μm) mostrando una interneurona parcheado con Alexa-594. Puntas de flecha blancas señalan la ubicación de terminales axonales en la capa piramidal, lo que sugiere que la interneurona es una célula de la cesta. (B) plano focal solo ilustrando la rama dendrítica donde se coloca el electrodo de estimulación. Línea discontinua que muestra la ubicación de la linescan que se muestra en (C1 y C2). (C) imágenes que ilustran el resultado de un linescan en rojo (1; Alexa-594; 20 μm) y verde (2; Oregon verde Bapta-5N; Canales de 300 μm). Las imágenes fueron agrupadas en segmentos más pequeños para analizar la propagación de la respuesta de más de 30 μm. (D) rastros mostrando al Ca2 + transitorios (gatos) produce en los segmentos mostrados en C2. Seguimiento superior muestra la respuesta de la tensión a estimulación eléctrica registrada a nivel somático durante la proyección de imagen prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Componente | Concentración (mM) |
| ACSF Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucosa | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| Recuperación de la ACSF | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucosa | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-sacarosa | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucosa | 10 | |
| Sacarosa | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-solución de parche | K+- gluconato de | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Sal de phosphocreatin di (tris) | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0.2 | |
| Biocitina | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0.2 |
Tabla 1: recetas de solución. Compuestos y concentraciones de soluciones utilizadas en el protocolo.
| Problema | Solución |
| No se puede parchear neurona sana | Busque signos que las rebanadas son malsanas: encogido o inflamación de las células, núcleos visibles, etcetera. Si es así, desechar las rebanadas. También verificar la resistencia del parche-pipeta y osmolalidad de la solución de parche; Reemplácelas si los valores no están en el rango adecuado. |
| Señal de fluorescencia de las dendritas es baja | Esperar más de la celda rellenar. Si un obstáculo impide la solución de parche que difunde en la célula, intente aplicar una pequeña cantidad de presión negativa en la pipeta de parche. |
| Estimulación eléctrica no es evocar una respuesta de Ca2 + | Comprobar la presencia de un artefacto en la grabación electrofisiológica. If ausente, busque un corto-circuito/estimulando mal funcionamiento de la unidad. Si está presente, elevar la intensidad de la estimulación o la pipeta de estimulación más cerca hacia la dendrita. Debe tenerse en cuenta que la distancia entre el electrodo de estimulación y la dendrita no debe exceder 8 um para evitar la despolarización directa de las dendritas al estudiar las respuestas sinápticas. |
| Evocados señal de Ca2 + es también indicador de alto/satura el Ca2 + | Reducir la potencia del láser. Si el problema persiste en varias celdas, utilizar un indicador diferente de Ca2 +, con una afinidad más baja del Ca2 +. |
| Ca2 + señal de línea de base está aumentando gradualmente durante el experimento | Esperar un período más largo entre las exploraciones individuales. Si sigue aumentando la línea de base, deje de adquisición; indica que la salud de la célula probablemente está disminuyendo. |
| Amplitud de la señal de Ca2 + disminuye durante los análisis | Reducir la potencia del láser o zumbido hacia fuera (si corresponde). |
| Dendrita es fragmentar ("blebbing") después de la exploración | Reducir la potencia del láser o alejar la imagen. Si blebbing se limita a la dendrita dirigida, elegir otra dendrita y reducir la energía del laser / zoom hacia fuera. Si múltiples dendritas son blebbing, deje de adquisición. |
| Señales de fluorescencia se "deriva" de la línea de exploración después de barridos | Reducir el movimiento en el sector mediante la reducción de la velocidad de perfusión de la ACSF. Antes de parchear, Estoy seguro que la rodaja se fija fuertemente en su lugar por una red. |
Tabla 2: tabla de solución de problemas. Soluciones a problemas comunes que pueden surgir durante una Ca2 + experimento de la proyección de imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método que se muestra a continuación muestra cómo la combinación de dos fotones Ca2 + proyección de imagen y electrofisiología patch-clamp se puede utilizar para estudiar dendríticas Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo. Este método permite el control de ambos el local Ca2 + elevaciones evocadas por AP eléctrico de estimulación o backpropagating en segmentos dendríticos y la respuesta somática de la célula. Esta es una excelente herramienta para el estudio de cómo diferentes partes del árbol dendrítico de integran entradas y comunican con el soma. Pero teniendo en cuenta la duración del experimento, especial atención debe prestarse a la salud de la célula limitando el uso de energía del laser para la proyección de imagen para evitar el fotoenvejecimiento de las dendritas. Esto puede lograrse también por disminuir el nivel de zoom, disminuyendo la duración de la exploración y aumentar la velocidad de exploración durante la adquisición de la imagen. Proyección de imagen las dendritas interneurona presenta retos adicionales. Como las dendritas de estas células sin espinas, barrido a lo largo de la dendrita se recomienda para facilitar la localización de Ca2 + microdominios postsinápticos. Además, dada una alta Ca2 + vinculante capacidad endógena, Ca2 + elevaciones en las dendritas de la interneurona son más pequeños y más lentos que los generados en las dendritas de las células piramidales. Esto requiere adquirir varias imágenes de linescan para calcular el promedio así como una duración suficientemente larga de linescans individuales para describir la cinética de Ca2 + señal adecuadamente.
La estimulación eléctrica local mediante electrodo bipolar theta-vidrio representa una herramienta útil para la caracterización de dendríticas postsinápticas Ca2 + microdominios. Sin embargo, puede todavía activar diferentes "en passant" axones situados en una región determinada. El número de entradas activadas en este caso es desconocido y puede estimarse sólo mediante herramientas computacionales adicionales. Dos fotones glutamato uncaging27, que permite la estimulación simultánea de varias sinapsis individuales, representa una buena alternativa para la obtención de locales dendríticas Ca2 + respuestas. Este método es ampliamente utilizado para el estudio de las células principales, que han definido claramente las estructuras postsinápticas excitatorias (espinas), pero no es adecuado para el estudio de interneuronas, que en general tienen una densidad baja de la espina dorsal. Glutamato uncaging a lo largo de la dendrita de interneurona que se aplica a las células principales inevitablemente activaría múltiples mecanismos extrasinápticos de Ca2 + señalización9,10, lo que es difícil de interpretar la observaciones.
En la última década, los avances en tecnologías ópticas ofrecen mejor resolución temporal para dos fotones Ca2 + proyección de imagen. Una de las más prometedoras es la microscopia de acceso (rampa) a través de deflectores de acusto-óptica (AODs)28,29. A diferencia de la trama convencional exploración, rampa analiza los puntos de interés en alta frecuencia, que es activar la velocidad rápida de AODs libre de inercia. Es ideal para el estudio simultáneo de múltiples ramas dendríticas, ya no se limita a puntos enunciados un patrón lineal. Sin embargo, la resolución temporal más alta ofrecida por los AODs puede ser innecesario cuando Ca2 + eventos que durará cientos de milisegundos dentro del mismo plan focal de la imagen. Además, la ubicación de puntos dentro de la misma estructura de interés la exploración puede ser difícil de controlar debido a micro-derivas en preparaciones de corte asociadas con una tasa de alta perfusión, que es necesaria para la buen calidad. Por lo tanto, el método de adquisición basada en linescan de alta resolución temporal (500-700 Hz) presentado en este artículo es preferible al Ca2 + señales de ramas dendríticas individuales de la proyección de imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de institutos canadienses de investigación en salud, las ciencias naturales y la investigación en Ingeniería (NSERC Discovery Grant) y la Fundación de Saboya. OC fue apoyado por una beca de doctorado de NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
