Summary
果蝇卵巢是研究干细胞小生境发育的优良模型系统。虽然已经公布了解剖幼虫和成人卵巢的方法, 蛹卵巢解剖需要不同的技术, 没有详细发表。在这里, 我们概述了解剖, 染色和安装蛹卵巢的协议。
Abstract
与成年的果蝇卵巢不同, 蛹卵巢由于其体积小、半透明和在蛹的情况下被包裹而难以进入和检查。解剖蛹卵巢的挑战还在于它们在蛹中的物理位置: 卵巢被蛹腹部内的脂肪体细胞所包围, 必须除去这些脂肪细胞, 以允许适当的抗体染色。为了克服这些挑战, 本协议利用自定义的巴斯德滴管从蛹腹部提取脂肪体细胞。此外, 在染色过程中使用腔内 coverglass 代替离心管, 以提高蛹的可见度。然而, 尽管本议定书使用的工具有这些和其他优点, 但由于蛹卵巢体积小, 成功地执行这些技术可能还需要几天的实践。本议定书所概述的技术可应用于蛹发育不同阶段的卵巢分析的时间过程实验。
Introduction
干细胞研究使用果蝇卵巢已广泛扩展自第一个文件的干细胞利基1,2,3,4。随着沿袭追踪遗传工具的发展,果蝇卵巢解剖通常被用来研究干细胞的谱系和信号通路, 调节干细胞的维持、增殖和命运。有关这些信号通路的知识可能会对源于异常干细胞活动的癌症的潜在病因产生洞察力5,6,7。最近还显示, 在果蝇卵巢中, 称为卵泡干细胞 (开办) 的体细胞干细胞在其组织的许多方面都与哺乳动物的肠道干细胞有很大的相似性, 这些细胞有8。因此,果蝇卵巢是研究干细胞行为的一个非常有用的模型系统。
幼虫和成人卵巢为早期干细胞的发育和生态位的最终干细胞组织提供了线索, 蛹卵巢是生殖和体细胞重组和建立其身份的中间结构。9,10. 虽然有几项研究已经检查了蛹子房10、11、12、13的组织发展方面, 但关于分化和空间组织的问题依然存在。蛹发育期间的卵巢细胞类型。特别是, 开办的规格在这个期间发生。本协议概述了在所需的时间点解剖和染色蛹卵巢的方法, 这一技术可用于从幼虫到成年期详细分析蛹卵巢发育的时间过程实验。
为了解释蛹腹中蛹卵巢的体积小、半透明和难以接近的问题, 本协议利用诸如自定义的薄尖巴斯德吸管等工具去除腹部脂肪体组织阻碍抗体进入卵巢.在抗体染色过程中使用的一个清晰的腔内 coverglass, 可以使蛹的可见度更高, 并且可以在 "Nutator" 上摇动卵巢的温和平台。基于 Maimon 和基利波山14的幼虫卵巢解剖协议, 在染色过程的最初步骤中采用了相对较高浓度的海卫 X-100, 以最大限度地提高细胞膜通透和抗体进入卵巢细胞。
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Protocol
1. EggLaying
- 结合大约十个男性和十五个女性成年果蝇的期望基因型的苍蝇在一瓶正常丰富的苍蝇食品补充酵母。为了避免瓶子过度拥挤, 允许交配雌性产卵不长于 2–4 h14。
- 把这些成年人从瓶子里移到一个新瓶子里, 然后用小瓶子打开, 用苍蝇食物来对付不同的瓶子。允许卵在室温下发育成幼虫, 3–4天。
2. 选择雌幼虫
- 使用柔软的毛刷湿润的细刷子, 做一个滚动运动与刷子沿着瓶子的墙上转移流浪的第三龄幼虫从瓶子到一个玻璃井填补了1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。把食物碎片从幼虫身上洗掉, 然后把它们转移到一个充满 1x PBS 的井里。
- 用镊子将雄性和雌性幼虫分开。用一对大的, 圆形的, 和半透明的睾丸, 在身体的侧面, 大约2/3 从它的前端15下, 识别雄性幼虫。雌性幼虫平均比雄性大, 不透明, 而且有更小的性腺, 更难检测。
- 选择抗雄性幼虫收集雌性幼虫。从井里收集至少十名女性。将雌幼虫放入一个单独的井中, 填充 1x PBS。
- 用镊子将雌幼虫轻轻地转移到新的新鲜食物瓶中, 补充酵母。
- 将小瓶与雌性幼虫放在一个黑暗的位置, 以方便 pupariation16。整个白天, 监测幼虫的 pupariation。当每个幼虫力场并且发展成一个预蛹, 圆预蛹反对小瓶并且记录近似时间, 当它第一次形成入预蛹。通过前气孔的突出和蛹壳形成的时机确定预蛹17。允许预蛹发展到所需的时间点 (以小时为单位, 蛹壳形成后, APF)。
注意: 任何在大约10小时间隔内蛹壳形成的动物都可以被认为是预蛹。蛹阶段开始约12小时后蛹壳形成后, 内部蜕皮已发生。
3. 制备抗体染色蛹
-
形成一个薄玻璃吸管, 用于清除蛹脂肪体的后期步骤。
- 将巴斯德吸管的玻璃尖端融化在本生燃烧器上。当玻璃融化时, 用镊子将尖端从吸管的其他部分水平拉出, 形成更薄的尖端。
- 冷却后, 折断吸管尖端的一小部分, 形成一个整洁的圆形开口。将灯泡连接到吸管的另一端。
- 用 1x PBS 加载吸管。
- 为了收割被粘在瓶子壁上的蛹, 在蛹和小瓶之间的接触区应用一滴水。在用湿润的细刷子将蛹从墙上轻轻地抬起之前, 先让蛋白胶溶解。将蛹转移到装有 1x PBS 的玻璃井中。为每个蛹奉献一个好的, 以避免过度拥挤的井。
- 在抓蛹的后端与一对钳, 小心地撕裂前部的蛹的案件与另一对, 直到蛹的头是可见的。
- 用镊子抓住蛹头最前端的尖端, 轻轻地将蛹从蛹的箱子中拉出。
注意: 脂肪体的一部分可能会在这个过程中溢出。 - 将蛹的前半部分从后半部分分离并丢弃, 直到只有腹腔袋残留。
-
从腹腔袋中提取脂肪体细胞。
- 一只手抓住腹部袋底部的井与镊子, 同时持有的薄玻璃吸管填充 1x PBS 在另一只手。
- 瞄准袋子的开口的薄吸管尖和慢慢地吸管 1x PBS 入腹部洗掉周围的蛹卵巢的脂肪体细胞。
注意: 卵巢是一对小, 半透明, 纹状, 和长方形的结构, 应该留在腹部袋。 - 洗去脂肪的身体细胞, 直到至少有2/3 的脂肪身体消失或直到卵巢可见附近的腹部袋开口。慢慢地执行这一步骤是非常重要的, 以免意外地将卵巢从腹部冲洗出来。
- 检查油井, 检查卵巢是否在脂肪体细胞洗涤过程中溢出。如果卵巢在井内不可见, 他们应该留在腹部。如果卵巢出来了, 在井里放一个新的蛹, 重复这一步。
- 将腹部转移到一个清晰的 coverglass 腔内, 内固定缓冲 (1x PBS, 4% 多聚甲醛), 并将盖子放在上面。为了确保足够数量的卵巢经得起染色和安装过程, 解剖更多的卵巢比需要。
注意: 固定缓冲液中含有毒性多聚甲醛。请佩戴适当的防护, 如手套, 安全眼镜,等。
4. 免疫组化
- 在整个染色过程中, 使用镊子轻轻地将任何浮动卵巢向下推到盖玻璃的底部, 确保卵巢完全沉浸在抗体溶液中。
- 将双面胶带放在 Nutator 的平坦表面上, 然后将腔 coverglass 放在粘合剂表面上。
- 在室温下从步骤3.7 到15分钟, 在固定缓冲中孵化卵巢。
- 冲洗卵巢三倍, 在 1x PBS 与1% 海卫 X-100 5, 10, 45 分钟 (总共1小时), 以允许彻底通透。
- 将10% 正常山羊血清中的卵巢阻断在 1x PBS 中, 0.5% X-100 为30分钟。
- 在600µL 的初级抗体选择稀释到适当的浓度在 1x PBS 与0.5% 海卫 X-100 4 摄氏度, 夜间孵化卵巢。
- 三次冲洗卵巢5分钟 1x PBS 与0.5% 海卫 X-100。
- 在600µL 的二次抗体中孵化卵巢2小时, 稀释到适当浓度的 1x PBS 中, 0.5% 的海卫 X-100 室温下。
- 在 1x pbs 中冲洗卵巢两次, 5 分钟, 0.5% 海卫 X-100, 5 分钟, 1x pbs。
5. 解剖和安装蛹卵巢
- 将一小滴 1x PBS 放到显微镜滑梯上。使用镊子将腹腔袋从腔 coverglass 转移到一个玻璃井填充 1x PBS。为每个蛹奉献一个好的, 以避免过度拥挤的井。
- 用镊子将腹腔袋和任何剩余脂肪体撕成一裂。
注意: 卵巢, 这是一对小, 半透明, 纹状, 和长方形的结构, 应该在井内可见。卵巢通常被脂肪的身体紧紧包围, 所以确保所有脂肪体完全撕裂是很重要的。 - 将卵巢从井中转移到显微镜滑梯上的 1x PBS 中, 方法是在钳的尖端之间抓住卵巢中心。这是非常重要的是使用一个牢固的抓地力, 而不挤压卵巢, 以免失去或摧毁他们在转移。当解决方案随着时间的推移而变干时, 添加几滴 1x PBS 到幻灯片中。
- 一旦所有卵巢被解剖和转移到显微镜幻灯片, 吸管40µL 的安装介质到22毫米 x 22 毫米盖玻片, 并将盖玻片轻轻地放在卵巢的顶端。让幻灯片在成像前一夜干。
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Representative Results
成功执行此过程应导致清晰的抗体染色, 揭示了一个果蝇蛹卵巢的结构和细胞组织。免疫组织化学在本议定书中概述可用于识别常见的细胞类型在幼虫和成人卵巢染色。从群单元派生的蛹茎细胞18 (由白色 Fasciclin III 所概述) 显示在图 3中。除了突出蛹卵巢的细胞组织外, 特定于细胞增殖的抗体染色 (如以绿色显示的图 3中的磷组蛋白 H3 染色) 可用于研究干细胞的细胞分裂模式和其他mitotically 活动单元格类型。如果荧光抗体信号在共聚焦显微镜下检查时很弱, 那么由于蛹腹部脂肪体提取不足, 卵巢可能无法充分暴露于抗体。另一种可能是蛹袋开口在染色过程中破裂。
图 1: 男性与雌性幼虫的并排比较.(A) PBS 溶液中的雄性幼虫, 由一对半透明的长圆形睾丸确定, 其前端约2/3。(B)在 PBS 溶液中, 由于没有大而半透明的睾丸而发现的雌性幼虫。刻度条 = 2mm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 免疫组化后蛹卵巢的解剖.(A)在免疫组化染色后从腹腔袋中取出的一对纹状、半透明蛹卵巢 (红色圆圈) 的图像。蛹卵巢被解剖约 48 h APF。未在步骤3.6 中提取的剩余脂肪体单元格 (黑色箭头) 分散在 PBS 解决方案中。(B) PBS 解决方案中单个蛹子房的图像解剖约 48 h APF。刻度条 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 染色野生型蛹卵巢解剖48小时 APF.图像是通过共聚焦显微镜获得的。Wnt 通路记者, Fz3 RFP8 (红色), 表达在前体细胞。抗体指向 Fasciclin III (白色) 概述蛹茎的细胞。细胞核与 DAPI (蓝色) 复染。磷-组蛋白 H3 染色 (绿色) 突出细胞正在有丝分裂。对角线白线指示原始图像的边缘。缩放条 = 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本议定书最关键和最困难的步骤是在固定前准备蛹卵巢。为了确保卵巢, 小和埋在蛹腹部的脂肪体细胞, 有足够的抗体, 这是重要的, 不仅撕裂一个大的开放, 在腹腔麻袋与钳, 但也提取脂肪体细胞, 阻碍卵巢的抗体。成功执行此步骤需要在巴斯德吸管灯泡上应用微妙的压力, 同时将脂肪体细胞从腹袋中清洗出来 (例如, 在这一步中, 在每秒的时间内都应留出腹部)。如果不使用温和的力量, 可能会导致卵巢从腹部溢出, 进入玻璃井。由于卵巢本身是小的, 半透明的, 难以掌握与镊子, 他们必须留在腹部麻袋整个染色程序。因此, 如果在固定前的准备步骤中, 卵巢从腹部出来, 那么在议定书中以孤立的形式检索、染色和装入它们是极其困难的。
脂肪体细胞主要由脂质滴组成, 是在昆虫中常见的甘油三酯储存器, 包括果蝇19,20。由于一些脂肪体细胞留在蛹腹部固定, 该协议利用相对较高的海卫 X-100 浓度在前三 PBS 冲洗, 以提取尽可能多的脂质尽可能从卵巢细胞膜和任何剩余的脂肪卵巢周围的组织。如明亮的 Fasciclin III 细胞膜蛋白抗体染色显示在图 3中, 使用 1x PBS 与1% 海卫 X-100 在前三冲洗工作, 以最大程度地提取脂质, 同时仍然保持细胞的完整性膜.
一旦脂肪体被提取, 第二个最关键的步骤是确保在整个固定和抗体染色的腹腔内的卵巢保持。把它们放在一个清晰的, 腔内的 coverglass, 而不是离心管, 以更清楚地看到蛹腹部在染色。使用镊子轻轻地把腹肌推到房间的底部, 使麻袋中的腹部组织完全吞噬抗体溶液。
最后, 在安装过程中, 应该非常小心地将卵巢从腹腔袋转移到显微镜下的滑梯上。虽然卵巢是小的, 难以掌握与钳, 而不捏他们, 最好的方式来转移他们的幻灯片是通过牢牢抓住卵巢中心。一旦放置在幻灯片上, 它们将保持结构完好。这是可能的解剖卵巢从腹部直接在显微镜下滑动, 以避免失去卵巢, 但这可能导致过多的安装介质在幻灯片上, 并可能使安装过程复杂化。
本议定书的局限性涉及整个解剖过程可能采取的时间、染色卵巢的潜在低产量以及成功完成每一步所需的灵巧度。由于蛹卵巢需要广泛的脂肪体提取, 准备一个单一的蛹为固定可能会采取任何地方从10到20分钟。此外, 为了确保足够多的卵巢耐受整个染色过程, 最好解剖更多的蛹比实验需要的。这意味着, 即使在固定步骤之前, 大量的时间也可以花在准备蛹上。
蛹卵巢夹层解剖不同于幼虫14和成人21卵巢夹层的协议。在蛹案例中, 卵巢的装箱提供了在本协议中使用的工具所遇到的独特挑战。这些方法可用于沿袭追踪实验, 以确定何时开办和护送细胞在蛹卵巢中指定的时间。本协议的修改版本涉及昆虫细胞培养培养基也可能用于解剖蛹卵巢进行活体实时影像分析。
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Disclosures
作者没有要申报的利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生研究院 (RO1 GM079351 到交流) 的支持。我们感谢 Godt 为她提供了有益的建议, 蛹卵巢解剖根据她的原始协议。我们还感谢艾米 Reilein 对手稿的帮助和评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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