Summary
ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル システムです。幼虫及び成虫の卵巣を解剖するための方法を公開されている、蛹卵巣解剖詳しく公開されていない別のテクニックが必要です。ここでは、解離性、染色、および蛹卵巣をマウントするためのプロトコルを概説します。
Abstract
大人のショウジョウバエ卵巣とは異なり蛹卵巣は比較的アクセスし、彼らの小型のため確認することは困難、サイズ、半透明、蛹のケース内で被覆。蛹卵巣の解剖の課題はまた蛹内の物理的な場所にある: 卵巣蛹腹部内脂肪体細胞に囲まれているし、これらの脂肪細胞は適切な抗体の汚損のため許可を削除必要があります。これらの課題を克服するためには、このプロトコルは、蛹の腹部からの脂肪体細胞を抽出するためのカスタマイズされたパスツール pipets を利用しています。また、蛹の可視性を改善するために染色のプロセス中に、カバーグラスチェンバーを遠心管の代わりに使用します。ただし、これらとこのプロトコルで使用するツールの他の利点にもかかわらず、これらの技術の実行が成功は、まだ蛹卵巣のサイズが小さいため練習のいくつかの日を伴うことがあります。このプロトコルに記載されているテクニックは、蛹の開発のさまざまな段階で卵巣を解析時間コース実験に適用でした。
Introduction
ショウジョウバエの卵巣を用いた幹細胞研究は、幹細胞ニッチ1,2,3,4の最初のドキュメンテーションから広く展開しています。リネージュ トレース遺伝的ツール、解剖がよく幹細胞を研究に使用されているショウジョウバエ卵巣の開発と幹細胞維持、増殖、および幹細胞ニッチの運命を制御するシグナルします。これらのシグナル伝達経路の知識は、異常な幹細胞活動5,6,7から由来する癌の潜在的な原因への洞察力をもたらす可能性があります。また、最近、卵胞幹細胞 (Fsc)、として知られているショウジョウバエ卵巣の体性幹細胞、彼らの組織の8の多くの側面で哺乳類の腸管幹細胞のように強く示されています。このため、ショウジョウバエ卵巣が幹細胞の挙動を研究するための非常に有用なモデル システムです。
幼虫及び成虫の卵巣はそれぞれ初期の幹細胞の開発とニッチで最終的な幹細胞組織への手がかりを提供、蛹卵巣は生殖細胞と体細胞で再編成、彼らのアイデンティティを確立中間構造9,10. 分化と空間構成に関する質問のままいくつかの研究は、蛹卵巣10、11,12,13組織開発の側面を検討しているが蛹の発育中の卵巣細胞型。特に、Fsc の仕様は、この期間中に発生します。このプロトコルの概要を解剖の目的の時点で蛹卵巣染色法-蛹卵巣における大人の段階に幼虫から詳細を分析時間コース実験で使用できるテクニック。
小型、半透明、蛹卵巣蛹腹部内の到達不能にする、このプロトコルは抗体アクセスを妨げる腹部脂肪体組織を除去するカスタムメイドの薄い先端パスツール ピペットなどのツールを利用して、卵巣。蛹の"Nutator"の卵巣を揺動の穏やかなプラットフォームを提供しています高い視認性を汚す抗体中に使用される明確なチェンバード coverglassMaimon、ギルボア14による幼虫卵巣の解剖のプロトコルに基づいて、トリトン X-100 の比較的高い濃度で採用されている染色の手順の最初の手順に細胞膜透過と抗体アクセスを最大化する、卵巣細胞。
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Protocol
1. 仔
- 10 の男性と 15 女性ショウジョウバエ成虫酵母を添加した通常豊かなフライ食品の瓶で目的遺伝子の約を組み合わせます。バイアルを過密を避けるため、もはや 2-4 h14以上の卵を産む雌成虫の交尾を許可します。
- はえの食糧と異なるバイアルに対して開くバイアルをタップして、大人をバイアルから新しい瓶に転送します。3-4 日間室温で幼虫に成長する卵を許可します。
2. 女性の幼虫を選択します。
- しっとり細かいブラシを使用すると、柔らかい毛、放浪の 3 齢幼虫をバイアルからもリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 であふれんばかりに満たされたガラスに転送するバイアルの壁に沿ってブラシで回転運動を作る。1x PBS で満たされた一つの井戸にそれらを転送することによって幼虫を食べ物のかすを洗浄します。
- 鉗子を使用して男性と女性の幼虫を区切ります。その前方15から下脂肪体に体の約 3 分の 2 の側面に埋め込まれた大きくて丸いと半透明の精巣のペア、オス幼虫を識別します。メス幼虫は平均より大きく、男性よりも少ない半透明より困難に検出は、はるかに小さい生殖腺を持っています。
- オス幼虫に対する女性の幼虫を収集するを選択します。井戸から少なくとも 10 女性を収集します。1x PBS でいっぱいも別に女性の幼虫を配置します。
- 新鮮なはえの食糧の新しいガラスびんに優しく女性の幼虫を転送する使用鉗子は、酵母を添加しました。
- Pupariation16を容易にするために暗い場所に女性の幼虫をバイアルを配置します。一日中、pupariation の幼虫を監視します。各幼虫は固定化し、イラガ前蛹に発展、バイアルに対してイラガ前蛹をサークル、最初、イラガ前蛹になるとおおよその時間を記録します。前気門の前突および蛹殻形成17のタイミングで前蛹を識別します。(蛹殻形成過程、APF の後の時間で測定) 希望の時間ポイントを開発する前蛹を許可します。
注: 約 10 h 間隔内で蛹殻形成過程を受ける動物、イラガ前蛹考えられます。内部の脱皮が行われた後、蛹期は蛹殻形成後約 12 時間を開始します。
3. 抗体の汚損のため蛹の準備
-
蛹の脂肪体をクリアするため、後の手順で使用する細いガラス ピペットを形成します。
- ブンゼン バーナーでガラス パスツール ピペット先端を溶かします。ガラスが溶け、薄く先端を形成するのにピペットの残りの部分から水平方向に先端をプルするのに鉗子を使用します。
- 冷却した後、きちんとした円形の開口部を形成するピペット先端部の小さな部分を破る。電球をピペットのもう一方の端に取り付けます。
- 1x PBS でピペットをロードします。
- バイアルの壁に接着しているの蛹を収穫するには、蛹とバイアル間接触の地帯に沿って水の小滴を適用します。タンパク質に 1-2 分を待って接着剤を優しくしっとり細かいブラシで壁に蛹を持ち上げる前に解散。1x PBS でいっぱいよくガラスに蛹を転送します。単一の井戸井戸の混雑を避けるため蛹あたりを捧げます。
- 1 組の鉗子で蛹の後端をつかんで、蛹の頭が見える位置まで慎重に別のペアに蛹のケースの前方の部分を引き裂きます。
- 鉗子で蛹の頭の前方の先端をグリップ、ケース蛹から蛹を軽く引いてください。
注: 脂肪体の部分はこのプロセス中にこぼれることがあります。 - 分離し、腹部の袋だけが残るまで後部半分から蛹の前半分を破棄します。
-
腹部の袋から脂肪細胞を抽出します。
- 別の手の 1x PBS でいっぱい細いガラス ピペットを押しながら片方の手でピンセットで井戸の底に対して腹部の袋を把握します。
- 蛹卵巣を取り巻く脂肪体細胞を洗い流すため腹部に袋とゆっくりピペット 1 × PBS の開幕に向けて細いピペット先端部を目指してください。
注: 卵巣は、腹部の袋の中に残るべきである小さい、半透明、紋、長方形の構造体のペアです。 - 体の脂肪細胞の脂肪体の少なくとも 3 分の 2 がなくなるまで、または卵巣が腹部の袋の口の近くに表示されるまでを洗い流します。非常にゆっくりと、この手順を実行することが重要だ偶然腹部の卵巣を洗うようにします。
- 脂肪体細胞洗浄中にうち卵巣が残っているかどうかをチェックする井戸を調べます。卵巣が井戸の中に表示されていない場合は、腹部に残っている必要があります。卵巣が出てきた、よく新しい蛹を配置し、この手順を繰り返します。
- 固定バッファー (1 x PBS, 4% パラホルムアルデヒド) でいっぱいクリア coverglass 室に腹部を転送し、上に蓋を置き。染色と実装プロセスに耐えられる卵巣に十分な数を確保するため必要以上より卵巣を解剖。
注意: 固定バッファーには、有毒であるパラホルムアルデヒドが含まれています。適切な保護手袋、保護メガネなどを着用してください。
4. 免疫組織化学
- 染色のプロセスを通して卵巣が抗体溶解液に完全に没頭していることを確保するためカバー ガラス井戸の底に任意浮動卵巣優しくプッシュする鉗子を使用します。
- 場所は、Nutator の平らな表面に両面テープのストリップをテープの粘着面で、カバーグラスチェンバーを置きます。
- 室温で 15 分間ステップ 3.7 から固定バッファーで卵巣を孵化させなさい。
- 卵巣をすすぎ三回 1 %1 × PBS でトリトン X-100 5、10、および 45 分 (合計で 1 h)、それぞれ、徹底的な透過を許可します。
- 0.5 %1 × PBS で 10% ヤギ血清で卵巣をブロック 30 分トリトン X-100。
- 600 で卵巣を一晩インキュベート 4 ° C でトリトン X-100 0.5 %1 × PBS で適切な濃度に希釈して好みの一次抗体の μ L
- 0.5 %1 × PBS で 5 分間 3 回卵巣をすすぎトリトン X-100。
- 室温でトリトン X-100 0.5 %1 × PBS で適切な濃度に希釈して好みの二次抗体の 600 μ L で 2 h は、卵巣を孵化させなさい。
- 1 × PBS 0.5% トリトン X-100 と 1x PBS で 5 分に 1 回で 5 分間 2 回卵巣をすすいでください。
5. 解剖と蛹卵巣をマウント
- 顕微鏡のスライドに 1 × PBS の小滴を配置します。腹部の袋に、ガラスも、カバーグラスチェンバーから転送する使用鉗子は 1x PBS でいっぱい。単一の井戸井戸の混雑を避けるため蛹あたりを捧げます。
- 鉗子で腹部の袋と、残りの脂肪体を引き裂きます。
注: 小さな、半透明、紋、長方形の構造体のペアは、卵巣は井戸の中見えるはずです。すべての脂肪体は徹底的に引き裂かれたことを確認することが重要だ、卵巣が脂肪体囲まれてしばしば密接離れて。 - 1x PBS 顕微鏡のスライド把持鉗子の先端間の卵巣のセンターでのドロップに井戸から卵巣を転送します。非常に失うまたは転送中にそれらを破壊するそうなので卵巣を圧迫することがなくしっかりしたグリップを使用することが重要です。解決策が時間をかけて乾くときのスライドに 1 × PBS を数滴を追加します。
- 一度、すべての卵巣は解剖され顕微鏡スライド、22 mm × 22 mm coverslip と卵巣の上にそっと coverslip の場所に取り付け中のピペット 40 μ に転送します。スライド画像の前に一晩を乾燥しなさい
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Representative Results
この手順が正常に実行明確な抗体の汚損構造とショウジョウバエ蛹卵巣の細胞組織を明らかにする必要があります。このプロトコルで説明されている免疫組織化学は、幼生及び成体卵巣における一般染色の種類の細胞を識別するために使用できます。派生した蛹の茎の細胞群細胞18 (白ファシクリン III で説明します)、図 3に示します。蛹卵巣の細胞の組織を強調表示、に加えて (リン酸化ヒストン H3 染色図 3緑色で表示) などの細胞増殖に固有を汚す抗体を幹細胞と他の細胞分裂パターンの研究に使用できます。有糸分裂アクティブ セルの種類。共焦点顕微鏡の下で検査するとき蛍光抗体信号が弱ければ、にくい卵巣が蛹腹部の体脂肪が不足している抽出のための抗体を十分に公開されていなかったこと。別の可能性は、染色中に折りたたまれている蛹袋開くことかもしれません。
図 1: 男性女性の幼虫とのサイド ・ バイ ・ サイド比較します。(A)半透明で、長方形の精巣のペアによって識別される PBS 溶液中のオス幼虫の前方端からダウン約 3 分の 2 をあります。大規模な半透明の精巣の有無によって識別される PBS 溶液(B)女性の幼虫。スケール バー = 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 免疫後蛹卵巣の解剖します。(A)蛹する横紋筋性、半透明の卵巣 (赤丸) 免疫組織化学染色時に腹部の袋から削除されたのペアのイメージ。蛹卵巣が切除した APF 約 48 時間。手順 3.6 では抽出されなかった残りの脂肪体細胞 (黒矢印) は、PBS 溶液中に分散しています。(B) PBS 溶液中の単一蛹卵巣の画像は、約 48 時間 APF を解剖しました。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ステンド グラスの野生型蛹卵巣解剖 48 時間 APF 。共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得しました。Wnt 経路記者、Fz3 RFP8 (赤) は、前葉体細胞で表されます。抗体は、蛹の茎のファシクリン III (白) の輪郭の細胞に送られます。核は、DAPI (青) と counterstained いた。リン酸化ヒストン H3 の染色 (緑) と、有糸分裂を経るセルが強調表示されます。斜めの白い線は、元の画像のエッジを示します。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの最も重要かつ困難なステップには、固定する前に蛹卵巣の準備が含まれます。抗体と、卵巣、小さくて蛹腹部内脂肪体細胞によって埋められること十分に汚れることを確認、鉗子、腹部の袋に大きな開口部を引き裂くだけでなくが、また妨げる脂肪体細胞を抽出することが重要です、抗体からの卵巣。この手順が正常に実行が必要です腹部の袋から脂肪体細胞を洗いながらパスツール ピペットで移しなさい電球の微妙な圧力のアプリケーション (例えば1-2 脂肪体細胞はこの手順中の 1 秒あたりの腹部におきます)。穏やかな力を使用する失敗可能性が卵巣では流出の腹部からとグラスにも。自分で卵巣は、半透明、小さくて鉗子で把握することは困難であるために、汚損プロシージャ全体で腹部の袋内にある必要があります。したがって、卵巣は、固定する前に準備段階腹部から出てくる場合、取得、汚れ、およびプロトコル間の分離の形式でそれらをマウントすることは非常に困難でしょう。
脂質小滴の主に、脂肪細胞がトリグリセリド貯蔵細胞小器官キイロショウジョウバエ19,20を含む昆虫で一般的に見られます。このプロトコルが卵巣で両方のきちんと残った脂肪からできるだけ多くの脂質を抽出する最初の 3 つの PBS の洗口液で比較的高いトリトン X-100 濃度を利用していくつかの脂肪体細胞は、固定で蛹の腹部に残るので卵巣を取り巻く組織。最初の 3 つの洗口液の細胞の整合性を維持しながら脂質を最大限に抽出によく作品染色では図 31% で 1 x PBS を使用中にトリトン X-100 明るいファシクリン III 細胞膜蛋白抗体によって示されるように膜。
脂肪体を展開すると、2 番目の最も重要なステップ固定と抗体の汚損を通して腹部の袋内に卵巣が残っているかどうかを確認することです。染色中に蛹腹部の明確視認性微量遠心チューブではなく、明確なチェンバード coverglass 内にそれらを配置することをお勧めします。袋に腹部の組織が完全に抗体溶液で包まれているので、チャンバーの底に腹部の袋を優しくプッシュするのに鉗子を使用します。
最後に、細心の注意実装プロセス中に腹部の袋から顕微鏡スライドに卵巣を転送する必要があります。卵巣は、小さな鉗子でつまんでなく把握することは困難、スライドにそれらを転送する最良の方法は卵巣の中心をしっかりとつかんでです。彼らは、スライド上に配置構造的にそのまま残ります。卵巣を失うことを避けるために顕微鏡のスライドの上に直接腹部から卵巣を解剖することができますがこれはスライドに取り付け中の過剰な量につながる可能性があります、実装プロセスが複雑になる可能性があります。
このプロトコルの制限は、全体の切離プロセスがかかることがあります、各ステップを正常に完了するために必要な器用さをよく染色卵巣と潜在的に低収量の時間の量を含みます。蛹卵巣は、広範な脂肪体抽出を必要とするため固定のため 1 つの蛹を準備するかかることがありますどこでも 10 から 20 分。さらに、ように卵巣の十分な数に耐える全体汚損プロシージャ、実験に必要なよりもより多くの蛹を解剖するが最善です。これは、多量の時間可能性があります固定ステップの前にも蛹の準備に単に使われることを意味します。
蛹卵巣の解剖は、主に幼虫14とアダルト21卵巣の解剖のプロトコルから異なります。蛹ケース内卵巣の箱詰め特有の課題がこのプロトコルで使用するツールによって満たされています。これらのメソッドがあります Fsc と護衛、タイミングを決定するリネージュ トレース実験に適用セルは時間をかけて蛹卵巣で指定されます。昆虫の細胞培養媒体を含むこのプロトコルの修正版は、ライブ イメージング解析前のヴィヴォ蛹卵巣を解剖する可能性も使用できます。
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Disclosures
著者の利害の衝突を宣言するあります。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所によって支えられた (d. k. に GM079351 RO1)。ドロテア Godt に彼女の元のプロトコルに基づいて蛹卵巣の解剖に彼女の有用なアドバイスありがちましょう。我々 はまた、彼女の援助と原稿のコメントをエイミー Reilein を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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