Summary
O ovário de Drosophila é um sistema excelente modelo para estudar o desenvolvimento de nicho de células-tronco. Embora métodos para dissecando larvas e adultos ovários foram publicados, dissecções de ovário pupal requerem diferentes técnicas que não tenham sido publicadas em detalhe. Aqui nós esboçamos um protocolo para dissecar, coloração e montagem ovários pupal.
Abstract
Ao contrário de ovários de Drosophila adultos, pupal ovários são relativamente difíceis de acessar e examinar devido a suas pequenas tamanho, translucidez e encerra dentro de um caso de pupa. O desafio de dissecação pupal ovários também reside na sua localização física dentro a pupa: os ovários estão rodeados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, e essas células de gordura deve ser removidas para permitir a adequada anticorpos. Para superar estes desafios, este protocolo utiliza personalizadas pipetas Pasteur para extrair células de gordura corporal do abdome pupal. Além disso, uma lamela septada é usada no lugar de um tubo de microcentrifugadora durante o processo de coloração para melhorar a visibilidade das pupas. No entanto, apesar de estas e outras vantagens das ferramentas utilizadas no presente protocolo, execução bem sucedida destas técnicas ainda pode envolver vários dias de prática devido ao pequeno tamanho dos ovários pupal. As técnicas descritas neste protocolo poderiam ser aplicadas para experimentos de curso do tempo em que os ovários são analisados em vários estágios de desenvolvimento pupal.
Introduction
Investigação em células estaminais usando Drosophila ovários expandiu-se, amplamente, desde a primeira documentação de uma célula-tronco nicho1,2,3,4. Acompanhar o desenvolvimento de ferramentas de genética linhagem rastreamento, ovário de Drosophila dissecções foram comumente usadas para estudar as linhagens de células-tronco e sinalização de vias que regulam a manutenção de células-tronco, proliferação e destino no nicho de células-tronco. Conhecimento destas vias de sinalização pode produzir insights sobre causas potenciais de cânceres que se originam de células-tronco aberrante atividade5,6,7. Recentemente também mostrou que as células-tronco somáticas no ovário drosófila , conhecidas como células-tronco do folículo (FSCs), fortemente se assemelham a mamíferos células-tronco intestinais em muitos aspectos de sua organização8. Por esta razão, Drosophila ovários são um sistema de modelo altamente útil para estudar o comportamento de células-tronco.
Enquanto os ovários de larvas e adultos oferecem pistas para o desenvolvimento precoce de células-tronco e células-tronco final organização no nicho, respectivamente, o ovário pupal é uma estrutura intermediária em que a linha germinativa e células somáticas reorganizar e estabelecer suas identidades 9 , 10. embora vários estudos examinaram os aspectos do desenvolvimento de tecido no ovário pupal11,10,12,13, perguntas permanecem sobre a diferenciação e organização espacial tipos de células dos ovários durante o desenvolvimento pupal. Em particular, a especificação de FSCs ocorre durante este período. Este protocolo descreve um método para dissecar e coloração pupal ovários em pontos de tempo desejado — uma técnica que pode ser usada em experimentos de curso do tempo que analisam o desenvolvimento do ovário pupal em detalhe de larval para a fase adulta.
Para explicar o tamanho pequeno, translucidez e inacessibilidade do ovário dentro do abdômen pupa pupa, este protocolo utiliza ferramentas como uma feito por pipeta Pasteur com ponta fina para remover o corpo de gordura abdominal tecido obstruindo o acesso de anticorpo para o ovários. Uma lamela clara, septada, usada durante o anticorpo que mancha oferece maior visibilidade das pupas e uma plataforma mais suave para balançar os ovários em um "Nutator". Baseado em um protocolo para dissecções de ovário larval de Maimon e Gilboa14, uma concentração relativamente alta de Triton X-100 foi empregada nas etapas iniciais do processo de coloração para maximizar o acesso de permeabilização e anticorpo de membrana celular para a células dos ovários.
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Protocol
1. ovíparos
- Combine-se aproximadamente dez do sexo masculino e 15 feminino adulto drosófila moscas do genótipo desejado em um frasco normal alimentos ricos em voar suplementados com levedura. Para evitar a superlotação do frasco, permitem que as fêmeas acasaladas para pôr ovos para não mais de 2 – 4 h14.
- Transferi os adultos do frasco para um frasco novo tocando o frasco abertura contra um frasco diferente com comida de mosca. Permitir que os ovos desenvolver-se em larvas em temperatura ambiente por 3 – 4 dias.
2. seleccionar as larvas femininas
- Usando um pincel fino úmido com cerdas macias, faça um movimento de rolamento com o pincel ao longo da parede do frasco para transferir as larvas de terceiro instar errantes do frasco para um copo bem cheio até a borda com 1x tampão fosfato salino (PBS). Lave os restos de comida fora as larvas por transferi-los para outra bem preenchido com PBS 1x.
- Separe as larvas masculinas e femininas, usando fórceps. Identifica as larvas masculinas por um par de testículos grandes, redondos e translúcidos embutido na gordura corporal no lado lateral do corpo aproximadamente dois-terços para baixo de sua extremidade anterior15. Femininas larvas são em média maior, menos translúcida que os machos e têm gônadas muito menores que são mais difíceis de detectar.
- Selecione contra larvas masculinas para coletar larvas femininas. Colete no mínimo dez fêmeas do poço. Coloque as larvas femininas em um separado bem preenchido com PBS 1x.
- Uso de fórceps para transferir as larvas femininas suavemente em um frasco novo de alimentos frescos voar suplementado com fermento.
- Coloque o frasco com as larvas femininos em um local escuro para facilitar pupariation16. Durante todo o dia, monitore as larvas para pupariation. Como cada larva imobiliza e se desenvolve em um prepupa, círculo o prepupa contra o frasco e gravar o tempo aproximado quando ele primeiro forma em um prepupa. Identifica a pré-pupa, a protrusão de espiráculos anteriores e sincronismo de casulo formação17. Permita a pré-pupa desenvolver a ponto de tempo desejado (medido em horas depois da formação do casulo, APF).
Nota: Qualquer animal que se submetem a formação do casulo dentro de um intervalo de aproximadamente 10 h pode ser considerado um prepupa. O estágio de pupa começa aproximadamente 12 h após a formação do casulo depois que um interno sofrem metamorfose teve lugar.
3. preparar pupas para anticorpos
-
Forma uma pipeta de vidro fino para ser usado em etapas posteriores para limpar a gordura corporal pupal.
- Derreta a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro sobre um bico de Bunsen. O vidro derrete, use fórceps para puxar a ponta horizontalmente longe do resto da pipeta para formar uma ponta mais fina.
- Após arrefecimento, quebre uma pequena porção da ponta da pipeta para formar uma abertura circular pura. Anexe um balão para o outro lado da pipeta.
- Carrega a pipeta com PBS 1x.
- Para colher as pupas, que são coladas na parede do frasco, aplica uma pequena gota de água ao longo da zona de contato entre a pupa e o frasco. Esperar 1 a 2 min para deixar a proteína cola dissolver antes de levantar suavemente a pupa da parede com um pincel fino úmido. Transferi a pupa para um copo bem cheia de 1X PBS. Escreve um único poço por pupa para evitar superlotação do poço.
- Enquanto segurando a extremidade posterior da pupa com um par de pinças, cuidadosamente rasgar a porção anterior do caso com outro par pupa até a cabeça da pupa é visível.
- Segure a ponta mais anterior da cabeça pupal com pinça e puxe delicadamente a pupa fora de seu caso de pupa.
Nota: Uma porção do corpo a gordura pode derramar para fora durante este processo. - Separar e descartar a metade anterior da pupa da metade posterior até que reste apenas o saco abdominal.
-
Extrai as células de gordura corporal da bolsa abdominal.
- Segure o saco abdominal contra o fundo do poço com pinça em uma mão segurando a pipeta de vidro fino repleta de 1X PBS na outra mão.
- Aponte a ponta da pipeta fina em direção a abertura do saco e lentamente Introduza com pipeta 1X PBS no abdómen para lavar as células de gordura corporal em torno dos ovários pupal.
Nota: Os ovários são um par de estruturas pequenas, translúcidas, estriados e oblongas que deve permanecer dentro do saco abdominal. - Lave que o corpo gordura células até pelo menos dois terços do corpo gordura desaparecer ou até que os ovários são visíveis perto da abertura do saco abdominal. É muito importante executar este passo devagar para não lavar os ovários fora do abdômen por acidente.
- Examine o poço para verificar se os ovários têm derramado durante a lavagem da célula de gordura corporal. Se os ovários não são visíveis no interior do poço, eles devem ter permanecido no abdômen. Se os ovários tem saído, coloque uma nova pupa no poço e repita este passo.
- Transferir o abdômen em uma câmara de lamela clara cheia de buffer de fixação (1X PBS, paraformaldeído 4%) e coloque a tampa na parte superior. Para garantir um número suficiente de ovários suportar a coloração e o processo de montagem, dissecar os ovários mais do que o necessário.
Atenção: A reserva de fixação contém paraformaldeído, que é tóxico. Por favor use proteções adequadas, tais como luvas, óculos de segurança, etc.
4. imuno-histoquímica
- Durante todo o processo de coloração, use fórceps para empurre suavemente para baixo qualquer flutuantes ovários para o fundo do poço tampa vidro para garantir que os ovários estão completamente imersos em solução de anticorpo.
- Tiras de fita adesiva sobre a superfície plana de um Nutator e em seguida colocar a lamela septadas na superfície adesiva.
- Incube os ovários em tampão de fixação da etapa 3.7 para 15 min à temperatura ambiente.
- Lave os ovários três vezes em PBS 1x com 1% Triton X-100 para 5, 10 e 45 min (1h no total), respectivamente, para permitir a completa permeabilização.
- Bloquear os ovários no soro de cabra normal de 10% em PBS 1x com 0,5% Triton X-100 por 30 min.
- Incubar os ovários durante a noite em 600 µ l de anticorpo primário de escolha diluído na concentração apropriada em 1X PBS com 0,5% Triton X-100 a 4 ° C.
- Lave os ovários três vezes por 5 min em 1X PBS com 0,5% Triton X-100.
- Incube os ovários para 2h em 600 µ l de anticorpo secundário de escolha diluído na concentração apropriada em 1X PBS com 0,5% Triton X-100 à temperatura ambiente.
- Lave os ovários duas vezes por 5 min em 1X PBS com 0,5% Triton X-100 e uma vez por 5 min em 1X PBS.
5. dissecando e ovários Pupal de montagem
- Coloque uma pequena gota de 1X PBS numa lâmina de microscópio. Uso de fórceps para transferir o saco abdominal da lamela septadas para um copo bem cheio de 1X PBS. Escreve um único poço por pupa para evitar superlotação do poço.
- Separar o saco abdominal e qualquer restante gordura corporal com fórceps.
Nota: Os ovários, que são um par de estruturas pequenas, translúcidas, estriados e oblongos, devem ser visíveis no interior do poço. Os ovários são muitas vezes fortemente cercados pela gordura corporal, por isso é importante se certificar toda gordura corporal é completamente rasgada distante. - Transferi os ovários do poço à gota de 1X PBS no microscópio deslizar segurando o centro dos ovários entre as pontas da pinça. É muito importante usar um aperto firme sem apertar os ovários para não perder ou destruí-los durante a transferência. Adicione algumas gotas de 1X PBS para o slide quando a solução seca ao longo do tempo.
- Uma vez que todos os ovários foram dissecados e transferidos para a lâmina de microscópio, pipetar 40 µ l de meio de montagem sobre uma lamela de 22 x 22 mm e o lugar da lamela suavemente sobre os ovários. Deixe a slide secar durante a noite antes da imagem latente.
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Representative Results
Execução bem sucedida deste procedimento deve resultar na mancha do anticorpo claro que revela a estrutura e organização celular de um ovário pupal da drosófila . Imuno-histoquímica descrita no presente protocolo pode ser usado para identificar tipos de células, comumente manchados em ovários de larvas e adultos. As células do caule pupal derivado enxame células18 (esboçado por Fasciclin III em branco) são mostrados na Figura 3. Além de destacar a organização celular dos ovários pupal, anticorpo que mancha específica de proliferação celular (como phospho-histona H3 coloração na Figura 3, mostrada em verde) pode ser usado para estudar os padrões de divisão celular de células-tronco e outros tipos de células mitotically ativo. Se os sinais de anticorpos fluorescentes são fracos quando examinados sob um microscópio confocal, é provável que os ovários não foram suficientemente expostos aos anticorpos devido à insuficiente gordura corporal extração no abdômen pupal. Outra possibilidade pode ser que a abertura do saco pupal recolhido durante a coloração.
Figura 1: comparação lado-a-lado de macho vs fêmeas larvas. (A) larva masculino em solução de PBS, identificada por um par de testículos translúcidos, oblongos localizado aproximadamente dois terços de sua extremidade anterior. (B) larva fêmea em solução de PBS identificada pela ausência de testículos grandes e translúcidas. Escala de barras = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dissecação de ovários pupa depois immunohistochemistry. Imagem do (A) de um par de estriado, translúcidos pupal ovários (círculos vermelhos) que foram removidos da bolsa abdominal após coloração imuno-histoquímica. Pupal ovários foram dissecados aproximadamente 48 h APF. As restantes células de gordura corporal (seta preta) que não foram extraídas na etapa 3.6 estão dispersos em solução de PBS. (B) a imagem de um único ovário pupal em solução de PBS dissecado cerca de 48 h, APF. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: manchado selvagem-tipo pupal ovário dissecado 48 horas APF. Imagem foi adquirida usando um microscópio confocal. O repórter de via Wnt, RFP Fz38 (vermelho), é expressa em anterior de células somáticas. Anticorpos direcionados para células de contornos (brancos) Fasciclin III do caule pupal. Núcleos eram counterstained com DAPI (azul). Fosfo-histona H3 coloração (verde) destaca células passando por mitose. Linhas diagonais brancas indicam as bordas da imagem original. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A etapa mais crítica e difícil do presente protocolo envolve a preparação de pupa ovários antes da fixação. Para garantir que os ovários, pequenos e enterrados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, estão manchados suficientemente com anticorpos, é importante não só rasgar uma abertura grande no saco abdominal com fórceps, mas também extrair as células de gordura corporal que obstruem o ovários de anticorpos. Execução bem sucedida dessa etapa requer a aplicação de pressão sutil sobre o bulbo de pipeta Pasteur enquanto lavava as células de gordura corporal da saca abdominal (por exemplo, 1 – 2 células de gordura corporal devem deixar o abdômen por segundo durante esta etapa). A incapacidade de usar a força suave provavelmente fará com que os ovários derramar o abdômen e o vidro bem. Porque os ovários por si são pequenas, translúcidas e difícil de entender com fórceps, devem permanecer dentro do saco abdominal ao longo de todo o processo de coloração. Assim, se os ovários que saem do abdômen durante a etapa de preparação antes da fixação, seria extremamente difícil de recuperar, mancha e montá-los em sua forma isolada durante o protocolo.
As células de gordura corporal, compostas principalmente por gotículas lipídicas, são organelas de armazenamento de triglicérides comumente encontradas em insetos, incluindo Drosophila melanogaster19,20. Visto que algumas células de gordura corporal permanecem no abdômen pupal na fixação, este protocolo utiliza concentrações relativamente altas de Triton X-100 nas primeiro três lavagens de PBS para extrair lipídios tantos quanto possível de ambos os cell membranes no ovário e qualquer resquício de gordos tecido circundante dos ovários. Como demonstrado pelo anticorpo proteína de membrana celular Fasciclin III brilhante coloração na Figura 3, usando 1X PBS com 1% Triton X-100 durante as três primeiras lavagens funciona bem para extrair màxima lipídios, mantendo a integridade da célula membrana.
Uma vez que a gordura corporal foi extraído, o segundo mais importante passo é ter certeza que os ovários permanecem dentro do saco abdominal durante a fixação e coloração de anticorpo. É útil para colocá-los dentro de uma lamela clara, septada, ao invés de um tubo de microcentrifugadora para visibilidade mais clara de abdomes a pupa durante a coloração. Use a pinça para empurre suavemente os sacos abdominais para o fundo da câmara para que os tecidos abdominais na cama são totalmente envolto em solução de anticorpo.
Finalmente, grande deve ter cuidado para transferir os ovários da bolsa abdominal para o slide de microscópio durante o processo de montagem. Embora os ovários são pequenos e difícil de entender com a pinça sem prendê-los, a melhor maneira de transferi-los para o slide é segurando firmemente o centro dos ovários. Eles permanecerão estruturalmente intactos depois de colocado no slide. É possível dissecar os ovários do abdome diretamente sobre a lâmina de microscópio para evitar perder o ovário, mas isso pode levar a uma excessiva quantidade de meio de montagem no slide e pode complicar o processo de montagem.
As limitações do presente protocolo envolvem a quantidade de tempo que o processo de dissecção inteira pode demorar, o potencialmente baixo rendimento dos ovários bem manchados e a destreza necessária para concluir com êxito a cada passo. Porque os ovários pupal requerem extração extensiva de gordura corporal, preparando uma única pupa para fixação pode levar de 10 a 20 min. Além disso, para garantir um número suficiente de ovários suportar todo o processo de coloração, é o melhor dissecar pupas mais do que o necessário para o experimento. Isto significa que uma grande quantidade de tempo pode ser gasto simplesmente sobre como preparar as pupas mesmo antes da etapa de fixação.
Dissecações de ovário pupal diferem largamente de protocolos para larval14 e dissecções de ovário adulto21 . O invólucro do ovário dentro de um caso de pupa apresenta desafios únicos que são atendidos pelas ferramentas utilizadas no presente protocolo. Esses métodos podem ser aplicados para experimentos de rastreamento de linhagem para determinar quando FSCs e escolta células são especificadas no ovário pupa ao longo do tempo. Uma versão modificada do presente protocolo envolvendo meios de cultura de células de inseto também potencialmente poderia ser usada para dissecar pupal ovários para análise ex vivo ao vivo de imagens.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (RO1 GM079351 de D.K.). Agradecemos Dorothea Godt dela conselhos úteis sobre dissecações de ovário pupal, baseado no seu protocolo original. Agradecemos também a Amy Reilein por sua assistência e comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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