Summary
השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.
Abstract
בניגוד למבוגרים דרוזופילה שחלות, השחלות הגולמי קשים יחסית לגשת ולבדוק עקב שלהם קטן בגודל, טבלתי ו בפסליו בתוך תיק הגולמי. האתגר של לנתח השחלות הגולמי טמון גם המיקום הפיזי שלהם בתוך הגולם: השחלות מוקפים תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, ויש להסירו תאי שומן אלה כדי לאפשר נוגדן המתאים מכתים. כדי להתגבר על האתגרים הללו, פרוטוקול זה מנצל pipets פסטר מותאם אישית כדי לחלץ את תאי הגוף שומן מהבטן הגולמי. יתר על כן, coverglass chambered משמש במקום צינור microcentrifuge במהלך תהליך צביעת כדי לשפר את הראות של הגלמים. עם זאת, למרות אלה, יתרונות נוספים של הכלים המשמשים פרוטוקול זה, ביצוע מוצלח של טכניקות אלה עשוי עדיין לכלול מספר ימי תרגול בשל גודלו הקטן של השחלות הגולמי. השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה יכול לחול על זמן הקורס ניסויים שבהם מנותחים השחלות בשלבים שונים של פיתוח הגולמי.
Introduction
מחקר תאי הגזע באמצעות דרוזופילה השחלות התרחב נרחב מאז התיעוד הראשון של תאי גזע נישה1,2,3,4. בעקבות הפיתוח של שושלת היוחסין מעקב גנטי כלים, השחלה דרוזופילה והניתוחים שימשו נפוץ לחקר תאי הגזע שושלות, איתות המסלולים המסדירים תאי גזע תחזוקה, התפשטות, גורל גומחת תאי גזע. הידע של איתות המסלולים האלה עשוי להניב תובנות סיבות פוטנציאליות של סרטן שמקורן בתאי גזע aberrant פעילות5,6,7. גם לאחרונה הוכח כי תאי גזע סומאטית בשחלה דרוזופילה , המכונה בתאי גזע זקיק (FSCs), חריפה דומים בתרבית של תאי גזע מעיים בהיבטים רבים של הארגון שלהם8. מסיבה זו, דרוזופילה שהשחלות מערכת מודל שימושי מאוד ללמוד התנהגות תאי גזע.
בעוד השחלות זחל, למבוגרים מציעים רמזים כדי התפתחות תאי גזע מוקדמת וארגון תאי גזע הסופי של הגומחה, בהתאמה, השחלה הגולמי הוא מבנה ביניים שבו germline ותאים סומטיים לארגן מחדש ולהקים את זהותם 9 , 10. על פי מספר מחקרים בחנו היבטים של התפתחות רקמת השחלה הגולמי10,11,12,13, שאלות נותרו לגבי בידול ו הארגון המרחבי של סוגי תאים השחלות במהלך הפיתוח הגולמי. בפרט, המפרט של FSCs מתרחשת בתקופה זו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, צביעת השחלות הגולמי בנקודות הזמן הרצוי — טכניקה יכול לשמש בניסויים כמובן זמן לנתח התפתחות שחלה הגולמי בפירוט הזחל מ לבמה למבוגרים.
לקחת בחשבון גודל קטן, טבלתי, הנגישות של השחלה הגולמי בתוך הבטן הגולמי, פרוטוקול זה מנצל כלים כגון מחוייט דק-היטה פסטר pipet כדי להסיר רקמות הגוף השמן בבטן חוסם גישה נוגדן השחלות. ברור, תאיים coverglass בשימוש במהלך הנוגדן מכתים הצעות הניראות של הגלמים, פלטפורמה עדינה נדנדה השחלות על "Nutator". בהתבסס על פרוטוקול עבור השחלה זחל יחליט על ידי מימון, גלבוע14, ריכוז גבוה יחסית של טריטון X-100 ננקטה השלבים הראשונים של התהליך מכתימים כדי למקסם את קרום התא permeabilization נוגדנים גישה תאים בשחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EggLaying
- לשלב כ זכר עשר חמש עשרה הנשי דרוזופילה הזבוב הבוגר של גנוטיפ הרצוי בבקבוקון של אוכל עשיר לטוס רגיל בתוספת שמרים. כדי למנוע צפיפות יתר את המבחנה, לאפשר ובסיומה הנקבות להטיל ביצים לא יותר 2 – 4 h14.
- להעביר את המבוגרים מ המבחנה לתוך בקבוקון חדש על-ידי הקשה את המבחנה פתיחה נגד בקבוקון שונים עם אוכל לעוף. אפשר כי הביצים מתפתחות לזחלים בטמפרטורת החדר במשך 3-4 ימים.
2. בחירת הזחלים הנשי
- בעזרת מברשת לחה בסדר עם זיפים רכים, לבצע תנועה מתגלגל עם המברשת לאורך החומה של הבקבוקון כדי להעביר נודד הזחלים השלישי-לחלל המבחנה לכוס טוב מלא עד הקצה עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לשטוף את פסולת המזון את הזחלים על ידי העברת אותם לשני טוב מלא 1 x PBS.
- הפרד את הזחלים זכר ונקבה באמצעות מלקחיים. זיהוי הזחלים זכר על-ידי זוג האשכים גדולות ועגולות, ולאחר שקוף מוטבע בתוך הגוף השמן על הצד הלטראלי של הגוף כשני שליש למטה מן הקצה הקדמי שלה15. הזחלים הנשי הן בממוצע יותר גדול, פחות שקוף מאשר גברים, יש גונדות קטן הרבה יותר, כי הם יותר קשה לזהות.
- בחר נגד הזחלים זכר כדי לאסוף את הזחלים הנשי. לאסוף לפחות עשרה נקבות מן הבאר. למקם את הזחלים נשית נפרדת טוב מלא 1 x PBS.
- שימוש מלקחיים להעביר את הזחלים הנשי בעדינות לתוך בקבוקון חדש של אוכל לעוף טרי בתוספת שמרים.
- מניחים את הצנצנת עם הזחלים הנשי במיקום כהה כדי להקל על pupariation16. לאורך כל היום, לנטר את הזחלים עבור pupariation. כל זחל עוצר, מתפתח prepupa, להקיף את prepupa נגד המבחנה, לרשום את הזמן המשוער מתי זה קודם מטופסי prepupa. לזהות prepupae על-ידי על בליטה של anterior spiracles והתזמון של היווצרות puparium17. אפשר את prepupae לפתח לנקודת הזמן הרצויים (נמדד בשעות לאחר היווצרות puparium, APF).
הערה: כל חיה עוברים puparium היווצרות בתוך מרווח h כ 10 יכול להיחשב של prepupa. השלב הגולמי מתחיל כ 12 שעות לאחר היווצרות puparium אחרי הנשירה פנימי התרחש.
3. הכנת הגלמים נוגדן מכתים
-
טופס על pipet זכוכית אותה לשימוש מאוחר יותר שלבים, מרוקן את הגוף השמן הגולמי.
- ממיסים את קצה זכוכית pipet פסטר מעל מבער בונזן. הזכוכית נמס, להשתמש מלקחיים למשוך את הטיפ אופקית משאר pipet כדי ליצור טיפ דק יותר.
- לאחר קירור להתפרק רק חלק קטן של קצה pipet כדי ליצור חור עגול מסודר. לצרף נורה הקצה השני של pipet.
- טען את pipet עם 1 x PBS.
- כדי לקצור את הגלמים, אשר מודבקות לקיר של הבקבוקון, החל טיפת מים לאורך אזור קשר בין גולם בקבוקון קטן. לחכות 1 – 2 דקות כדי לתת החלבון הדבק מתמוסס ולהבהיר בעדינות הגולם מהקיר עם מברשת בסדר לח. העברת הגולם טוב לכוס מלאה 1 x PBS. להקדיש לבאר בודדת לכל גולם כדי למנוע צפיפות יתר הבאר.
- תוך אוחז בקצה האחורי של הגולם עם זוג מלקחיים, בזהירות לקרוע את החלק הקדמי של המקרה הגולמי עם זוג נוסף עד ראש הגולם יהיה גלוי.
- אחיזה בקצה הקדמי ביותר של הראש הגולמי עם מלקחיים ומשוך בעדינות את הגולם מהתיק הגולמי שלה.
הערה: חלק של שומן הגוף יכול להישפך החוצה בתהליך זה. - להפריד ולמחוק את החצי הקדמי של הגולם של החצי האחורי עד נשאר רק השק בטן.
-
לחלץ את תאי הגוף השמן מן השק בטן.
- לתפוס את השק בטן בתחתית הבאר עם מלקחיים ביד אחת תוך החזקת את pipet זכוכית מלאים 1 x PBS ביד אחר.
- מטרת הטיפ pipet דק לכיוון הפתח של שק, לאט pipet 1 x PBS לתוך. חלל הבטן כדי לשטוף את תאי שומן הגוף סביב השחלות הגולמי.
הערה: השחלות הן זוג מבנים קטנים, שקוף, מפוספס, מלבני שצריך להישאר בתוך השק בטן. - לשטוף את שומן הגוף תאים עד לפחות שני שלישים של שומן הגוף נעלם או עד השחלות גלויים ליד הפתח של השק בטן. חשוב מאוד לבצע שלב זה לאט כדי לא לשטוף את השחלות מתוך הבטן בטעות.
- לבחון את הבאר כדי לבדוק אם השחלות שפכתי החוצה במהלך לשטוף תא את שומן הגוף. אם השחלות אינם גלויים בתוך הבאר, הם צריכים להישאר בחלל הבטן. אם השחלות יש לצאת, במקום גולם חדש בבאר, חזור על שלב זה.
- להעביר את הבטן לתוך תא coverglass ברור מלא עם קיבוע מאגר (1 x PBS, 4% paraformaldehyde) ומניחים את המכסה למעלה. כדי להבטיח מספר מספיק של השחלות לעמוד על צביעת ותהליך הרכבה, לנתח השחלות יותר מכפי הצורך.
זהירות: החומר הממתן קיבוע מכיל paraformaldehyde אשר הוא רעיל. בבקשה ללבוש הגנות מתאימות כגון כפפות, בטיחות משקפיים, וכו '.
4. אימונוהיסטוכימיה
- לאורך כל התהליך מוכתמים, להשתמש מלקחיים לדחוף בעדינות את השחלות צף כל לתחתית הבאר כיסוי זכוכית כדי להבטיח כי השחלות שקועים לחלוטין בפתרון נוגדן.
- המקום רצועות סרט הדבקה דו-צדדי על גבי משטח שטוח של Nutator ולאחר מכן מקם את coverglass chambered על פני השטח דבק.
- דגירה השחלות במאגר קיבוע מהשלב 3.7 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את השחלות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 1% טריטון X-100 עבור 5, 10 ו- 45 דקות (h 1 סה כ), בהתאמה, כדי לאפשר permeabilization יסודית.
- לחסום את השחלות בנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 למשך 30 דקות.
- דגירה השחלות ללון ב- 600 µL של נוגדן ראשוני של בחירה מדולל לריכוז המתאימה ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 ב 4 º C.
- לשטוף את השחלות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100.
- דגירה השחלות עבור 2 h ב- 600 µL של נוגדנים משניים של בחירה מדולל לריכוז המתאימה ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף את השחלות פעמיים במשך 5 דקות ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 ופעם אחת למשך 5 דקות ב- 1 x PBS.
5. לנתח והרכבה השחלות הגולמי
- במקום טיפה קטנה של PBS 1 x לשקופית מיקרוסקופ. מלקחיים להשתמש כדי להעביר את השק בטן מלוח coverglass chambered כוס טוב מלא 1 x PBS. להקדיש לבאר בודדת לכל גולם כדי למנוע צפיפות יתר הבאר.
- לקרוע לגזרים השק הבטן ואת כל הגוף השמן שנותרו עם מלקחיים.
הערה: השחלות, אשר הם זוג של מבנים קטנים, שקוף, מפוספס, מלבני, צריך להיות גלוי בתוך הבאר. השחלות מוקפים לעיתים קרובות בחוזקה שומן הגוף, לכן חשוב לוודא כי כל הגוף השמן ביסודיות נקרע לגזרים. - העברת השחלות מן הבאר לתוך הירידה של 1 x PBS בהמיקרוסקופ שקופית על-ידי אחיזה במרכז השחלות בין קצות המלקחיים. חשוב מאוד להשתמש אחיזה חזקה מבלי לסחוט את השחלות כדי לא להפסיד או להשמיד אותם במהלך ההעברה. הוסף מספר טיפות של PBS 1 x אל השקופית כאשר הפתרון מתייבש עם הזמן.
- לאחר כל השחלות גזור והעבירו אל השקופית מיקרוסקופ, pipet 40 µL של הרכבה בינונית על גבי coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ בעלת המקום coverslip בעדינות על השחלות. תן שקופית הלילה יבש לפני הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצוע מוצלח של הליך זה צריך לגרום נוגדן ברור מכתים החושפת את המבנה ואת הארגון הסלולר של השחלה הגולמי דרוזופילה . אימונוהיסטוכימיה המתוארות ב פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות סוגי תאים בדרך כלל צבעונית של השחלות זחל ומבוגרים. תאים של הקנה הגולמי המופק נחיל תאים18 (שתואר על ידי Fasciclin השלישי בלבן) מוצגים באיור3. בנוסף סימון הארגון הסלולר של השחלות הגולמי, נוגדן מכתים ספיציפית התפשטות תאים (כגון פוספו-היסטון H3 צביעת איור 3, מוצגים בירוק) יכול לשמש כדי ללמוד דפוסי חלוקת התא של תאי גזע ועוד סוגי תאים mitotically פעיל. אם הנוגדן פלורסנט אותות חלשים כאשר בחן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סביר להניח כי השחלות לא מספיק נחשפו הנוגדנים בשל החילוץ לא מספיק שומן הגוף בבטן הגולמי. אפשרות אחרת ייתכן כי הפתח שק הגולמי קרס במהלך ההכתמה.
איור 1: השוואה Side-by-side של זכר מול נקבה הזחלים. (א) זחל זכר בפתרון PBS המזוהה על-ידי זוג האשכים שקופה, מלבני ממוקם כשני שליש במורד מסופה הקדמי. (B) הנקבה זחל בפתרון PBS המזוהה על-ידי העדר של האשכים גדולים, שקוף. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של השחלות הגולמי לאחר אימונוהיסטוכימיה. (א) תמונה של זוג מפוספס, שקוף הגולמי שחלות (עיגולים אדומים) הוסרה מן השק בטן בעת אימונוהיסטוכימיה מכתים. השחלות הגולמי היו גזור כ 48 שעות APF. תאי שומן הגוף הנותרים (חץ שחור) זה לא חולצו בשלב 3.6 מופצים ב- PBS פתרון. (B) דימוי השחלה הגולמי יחיד בפתרון PBS גזור כ 48 שעות APF. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ויטראז'ים פראי-סוג השחלה הגולמי גזור 48 שעות APF. תמונה נרכשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הכתב מסלול ונ ט, Fz3 RFP8 (אדום), מתבטא בתאים סומטיים הקדמי. נוגדנים ביים לתאים מתאר (לבן) Fasciclin השלישי של הקנה הגולמי. הגרעינים היו counterstained עם דאפי (כחול). פוספו-היסטון H3 מכתים (ירוק) מדגיש תאים עוברים מיטוזה. קווים לבנים אלכסוניים מציינים את הקצוות של התמונה המקורית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר וקשה של פרוטוקול זה כרוך הכנה הגולמי השחלות לפני קיבוע. כדי להבטיח השחלות, קטן והיא קבורה על-ידי תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, מוכתמים מספיק נוגדנים, חשוב לא רק תקרע חור גדול בתוך השק בטן עם מלקחיים, אבל גם לחלץ תאי שומן הגוף ההגנתיים החוסמים השחלות של הנוגדנים. ביצוע מוצלח של שלב זה דורש הפעלת לחץ עדין על הנורה pipet פסטר בעת שטיפת תאי שומן הגוף מתוך השק בטן (למשל 1-2 תאי שומן הגוף צריך להשאיר את הבטן לשניה במהלך שלב זה). כשל להשתמש בכוח עדין יגרום כנראה השחלות לשפוך מתוך הבטן, לתוך הכוס טוב. מכיוון השחלות בכוחות עצמם הם קטנים, שקוף, וקשה לתפוס עם מלקחיים, הם חייבים להישאר בתוך השק בטן לאורך כל תהליך צביעת. לפיכך, אם השחלות לצאת הבטן במהלך השלב הכנה לפני קיבוע, זה יהיה קשה מאוד לאחזר, כתם לטעון אותם בצורתם מבודד במהלך הפרוטוקול.
תאי שומן הגוף, שכוללים בעיקר השומנים טיפות, הם הטריגליצרידים אחסון organelles נפוץ למצוא חרקים כולל דרוזופילה melanogaster19,20. מאז כמה תאי שומן הגוף נשארים בבטן הגולמי על קיבעון, פרוטוקול זה מנצל ריכוזים גבוהים יחסית של טריטון X-100 ב שטיפות PBS שלושת לחלץ ליפידים רבים ככל האפשר בין שני cell membranes בשחלה בכל שארית שומן רקמות המקיפים את השחלות. כפי שמגלה את נוגדן בהיר של חלבון קרום התא השלישי Fasciclin מכתים איור 3, באמצעות 1 x PBS עם 1% טריטון X-100 במהלך שלוש שטיפות עובד היטב כדי מקסימאלית תמצית ליפידים תוך שמירה על שלמות התא ממברנה.
ברגע שומן הגוף חולץ, השלב השני הקריטי ביותר הוא לוודא שהשחלות יישארו בתוך השק בטן ברחבי קיבוע נוגדן מכתים. זה עוזר למקם אותם בתוך coverglass ברור, תאיים ולא צינור microcentrifuge עבור ניראות יותר ברור הבטן הגולמי במהלך צביעה. להשתמש מלקחיים לדחוף בעדינות את השקים בטן לחלק התחתון של החדר, כך הרקמות בטן בתוך השק מלא נבלע נוגדן פתרון.
לבסוף, זהירות רבה יש לנקוט כדי להעביר את השחלות השק בטן השקופית מיקרוסקופ במהלך תהליך הרכבה. למרות שהשחלות קטן וקשה לתפוס עם מלקחיים ללא בצביטה, הדרך הטובה ביותר להעביר אותם אל השקופית הוא בכך בחוזקה המרכז של השחלות. הם יישארו מבנית מהרגע ששמים על השקופית. ניתן לנתח את השחלות מהבטן ישירות על גבי השקופית מיקרוסקופ כדי להימנע מאובדן השחלה, אבל זה עלול להוביל כמות מוגזמת של הרכבה בינונית בשקופית עלול לסבך את תהליך ההרכבה.
המגבלות של פרוטוקול זה לערב את כמות הזמן תהליך ניתוח כולו עשוי לארוך, התשואה פוטנציאל נמוך של השחלות היטב מוכתם, ומיומנות הדרושים כדי להשלים בהצלחה את כל שלב. מכיוון השחלות הגולמי דורשים הגוף השמן נרחב החילוץ, הכנת גולם אחד קיבוע יכולה לקחת בין 10 ל 20 דקות. יתר על כן, כדי להבטיח מספר מספיק של השחלות לעמוד כולו מכתים הליך, מומלץ לנתח הגלמים יותר מאשר לצורך הניסוי. משמעות הדבר היא כי כמות גדולה של זמן עשוי להיות בילה בפשטות על הכנת הגלמים עוד לפני שלב קיבוע.
השחלה הגולמי והניתוחים שונים במידה רבה מן הפרוטוקולים עבור זחל14 ולמבוגרים21 השחלה והניתוחים. למטרתו של השחלה בתוך תיק הגולמי מציג אתגרים ייחודיים הם נפגשו על ידי הכלים המשמשים פרוטוקול זה. שיטות אלה עשויים להיות מוחל על שושלת היוחסין ניסויים העקיבה כדי לקבוע מתי FSCs, ליווי תאים צוינו השחלה הגולמי לאורך זמן. גירסה שונה של פרוטוקול זה מעורבים תא חרקים תרבות המדיה יכול לשמש גם פוטנציאל לנתח השחלות הגולמי לניתוח שמחוץ בשידור חי הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (RO1 GM079351 כדי D.K.). אנו מודים דורותיאה מפציר על לה עצות מועילות על השחלה הגולמי והניתוחים בהתבסס על הפרוטוקול המקורי שלה. אנו מודים גם איימי Reilein לה סיוע והערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
