Summary
في هذا البروتوكول، يصف لنا تقنية لاكتشاف الببتيدات زيكا تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها مع ريادلي للأمراض المعدية الناشئة.
Abstract
[ميكروارس] هضميد عالي الكثافة السماح الفرز لأكثر من ستة آلاف الببتيدات على شريحة مجهرية معيار واحد. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لاكتشاف المخدرات وتحديد الهدف العلاجي، ووضع التشخيص. نقدم هنا، بروتوكول اكتشاف محددة Zika الفيروسات (زيكف) التشخيص الببتيدات استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. طباعة عينة مصل الإنسان التحقق من صحة للإصابة زيكف كان المحتضنة مع ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على بروتين زيكف كامل ترجمة فريدة من نوعها 3,423 15 من مخلفات الخطي من الأحماض الأمينية (أإ) مع تداخل بقايا 14-aa مكررة. تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة داخل نفس الصفيف، اكتشفنا الببتيدات التي تربط غلوبيولين مناعي M (IgM) والأجسام المضادة "ز الغلوبولين المناعي" (IgG) في مصل الدم. واختيرت هذه الببتيدات لمزيد من التحقق من صحة التجارب. في هذا البروتوكول، يصف لنا الاستراتيجية المتبعة لتصميم ومعالجة وتحليل ميكرواري ببتيد عالي الكثافة.
Introduction
تشخيص الفيروس (زيكف) Zika استناداً إلى الأعراض السريرية يمثل تحديا نظراً لأنها تشاطر نواقل، والتوزيع الجغرافي، والأعراض بحمى الضنك وداء شيكونغونيا الإصابة بالفيروس1. نظراً للخطر لنتائج الحمل السلبية في النساء المصابات زيكف أثناء الحمل، من المهم التمييز بين الفيروسات 3. على الرغم من أن اختبارات التشخيص الجزيئي الحالية محددة، أنها مفيدة فقط في الدم أو اللعاب خلال فترة قصيرة نسبيا من الإصابة الحادة2،3. الاختبارات المصلية ضرورية للتشخيص خارج هذه الفترة الأولية من الإصابة4.
تطوير زيكف المقايسة المصلية محددة يمثل تحديا لسببين: أولاً، ليست معروفة حاليا المستضدات Zika يستجيب جهاز المناعة البشري؛ وتسلسل الأحماض الأمينية فلافيفيروسيس الثاني، وحفظت حمل جسم ه. وكان هدفنا لاكتشاف فريد زيكف الببتيدات محددة لاستخدامها في تشخيص. وضعت نهج مختلفة للشاشة الببتيد مكتبات تغطي كامل البروتينات بما في ذلك بالعاثية، البكتيرية، وعرض سطح الخميرة5،،من67،،من89، 10. كان لدينا استراتيجية لاستخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة التي تسمح بالفحوص المصلية سريعة وغير مكلفة في الفائق11،12 ، وبعد ذلك يمكن استخدام الببتيدات التي تم تحديدها لتحسين الحالية المصلية فحوصات للكشف عن الإصابة زيكف.
ويتيح هذا البروتوكول اكتشاف الببتيدات Zika تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة (الشكل 1). وأنتج ميكرواري الببتيد عالي الكثافة باستخدام تكنولوجيا الطباعة الليزر الببتيد. تسلسل البروتين زيكف أسرة تتألف من بقايا الأحماض الأمينية 3,423 استناداً إلى سلالة بولينيزيا الفرنسية (بنك الجينات: KJ776791.2)، تمت طباعته على شريحة زجاج قياسية في كتل من بقايا خطي 15 مع تداخل 14 مخلفات الأحماض الأمينية في تكرار إجمالي 6,846 الببتيد البقع. بالإضافة إلى أسرة Zika بروتين تسلسل الببتيدات، يستخدم ميكرواري هيماغلوتينين إنفلونزا الببتيدات (ها) للضوابط الداخلية.
زيكا التحقق من صحة إيجابية المصل العينة التي تم الحصول عليها من مركز ادسورث (ألباني، نيويورك)، استخدمت لتحديد محددة غلوبيولين مناعي M (IgM) والببتيدات رد الفعل "ز الغلوبولين المناعي" (IgG). بعد حضانة مع العينة بين عشية وضحاها، ميكرواري ملطخة بجسم مترافق fluorochrome ثانوي (IgM المضادة الإنسان أو الإنسان المضادة IgG)، وحلل على ماسح ضوئي ميكرواري. التحديد الكمي لكثافة بقعة والشرح الببتيد أجرى مع برمجيات خاصة المقدمة من نفس الشركة المصنعة ميكرواري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذه البيانات هي جزء من دراسة البحوث الجارية في "كلية جامعة نيويورك لطب الأسنان"، وأقرها "مجلس المراجعة المؤسسية" نيويورك جامعة كلية الطب، الكندي # H10-01894. وكانت العينات السريرية المستخدمة في هذه الدراسة المحددة دي العينات المستخدمة سابقا للتشخيص، ومع الإذن من "مركز ادسورث نيويورك الدولة وزارة" الصحة، ألباني، نيويورك.
1-تركيب زيكف الكثافة الببتيد ميكرواري الشريحة في "علبة حضانة" محددة
- التعامل مع الشرائح الزجاجية من الحواف باستخدام قفازات خالية من مسحوق. أبعاد الشريحة الزجاجية 75.4 مم من 25.0 مم و 1 مم سميكة. وضع الشريحة في علبة حضانة مع السطح ميكرواري مواجها لأعلى.
- ضع الجانب اللامع الختم تواجه هبوطاً على سطح ميكرواري المطبوعة. لضمان وضع جيد، تتداخل الثقوب المسمار الختم والصفيحة القاعدية.
- ضع الجزء العلوي من العلبة على الختم لإنشاء دائرة ميكرواري.
- تأمين الشريحة في العلبة بتشديد على قدم المساواة الاتجار واحداً تلو الآخر باليد في نمط تناوب بدءاً من أعلى اليسار يليه اليمنى السفلي. ضع غطاء علبة حضانة.
2-كشف التفاعل الخلفية: تلطيخ ميكرواري مع الأجسام المضادة الثانوية
ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (المخازن المؤقتة القياسية وحظر، والأجسام المضادة الثانوية المخفف) في ركن الغرفة ميكرواري.
- احتضان ميكرواري مع عازلة قياسية (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 0.05% 20 توين، ودرجة الحموضة 7.4، التي تمت تصفيتها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) (مجموع حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
- إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري. تعبئة أصحاب الشريحة فارغة مع شرائح فارغة لمنع كسر الشريحة ميكرواري.
- كتلة ميكرواري مع المخزن المؤقت حظر (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) لمدة 60 دقيقة في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
- إزالة المخزن المؤقت حظر بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- احتضان ميكرواري مع الجسم المضاد الثانوي، الإنسان المضادة IgM fluorochrome مترافق، المخفف 1: 5,000 (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) في تلطيخ المخزن المؤقت (10% حجب المخزن المؤقت في المخزن المؤقت القياسية) مدة 30 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري في 140 دورة في الدقيقة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- أغسل ميكرواري 3 x, 1 دقيقة لكل غسل مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- تزج الشريحة 2 x إلى مخزن مؤقت غمس طازجة (1 مم تريس، ودرجة الحموضة 7.4), (إجمالي حجم 200 مل).
- الجافة في ميكرواري بعناية، لحوالي 1 دقيقة، قبل يسفط السوائل الزائدة بعناية فائقة من الأعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة. تحليل الشريحة في قارئ ميكرواري الماسح ضوئي.
3-التعرض ميكرواري استضافة المصل
تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة تحت ظروف المختبر السلامة، السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2) بسبب طبيعة عينات المصل المعدية المحتملة. العمل في إطار "الدرجة الثانية" سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC).
- إلغاء تنشيط عينة المصل في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 16,000 لمدة 5 دقائق في13من 4 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (تلطيخ والمخزن المؤقت القياسية والمصل المخفف) في ركن الغرفة ميكرواري. - تمييع عينة المصل في المخزن المؤقت المصبوغة بدءاً بإضعاف (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري) 1:1,000. يبقيه في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- احتضان ميكرواري مع المخزن المؤقت المصبوغة (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري) لمدة 15 دقيقة في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
- إزالة المخزن المؤقت المصبوغة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- احتضان ميكرواري مع عينة المصل المخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
- إزالة عينة المصل المخفف بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- أغسل ميكرواري 3 x, 1 دقيقة لكل غسل مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
4-تلوين مع الأجسام المضادة الثانوية والأجسام المضادة لعنصر التحكم المسمى
ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (المخازن المؤقتة الموحدة والثانوية المخفف وتسمية الأجسام المضادة) في ركن الغرفة ميكرواري.
- تضعف جسم الثانوية في المخزن المؤقت المصبوغة.
ملاحظة: استخدام الإنسان المضادة IgM fluorochrome مترافق جسم أو الإنسان المضادة IgG fluorochrome جسم مترافق في إضعاف 1:5,000 (الحجم الإجمالي ل 2,000 ميليلتر/ميكرواري) في المخزن المؤقت المصبوغة. - ميكس عنصر تحكم تسمية جسم (مكافحة [مونوكلونل]-مترافق fluorochrome هكتار) في إضعاف 1:1,000 (إجمالي حجم 2 000 ميليلتر/ميكرواري) في تلطيخ المخزن المؤقت مع الأجسام المضادة الثانوية تضعف سابقا في تلطيخ المخزن المؤقت.
- احتضان مع ميكرواري مدة 30 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
- إزالة المزيج المخفف الثانوية والأجسام المضادة للتسمية يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
- أغسل x 3 مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري). كل غسل لمدة 1 دقيقة على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
5-ميكرواري المسح الضوئي
- تزج الشريحة 2 x إلى المخزن غمس الطازجة (1 مم تريس، درجة الحموضة 7.4) (إجمالي حجم 200 مل).
- الجاف في ميكرواري بعناية، حوالي 1 دقيقة، بواسطة يسفط بعناية فائقة من الأعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة.
- مسح ميكرواري اتباع التعليمات من الماسح الضوئي. ضع الشريحة على الماسح الضوئي مع السطح المطبوع مواجها لأعلى.
- إنشاء مشروع جديد وقم بتحديد منطقة المسح الضوئي. تعيين معلمات الماسح الضوئي ك: القرار: 21 ميكرومتر، كثافة لكل 700 و 800 نانومتر القنوات: 7.0، المسح الجودة: المتوسطة والإزاحة: 0.8.
- اقتناء وحفظ الصورة الخام المسح الضوئي كتنسيق ملف TIFF رمادي 16-بت.
6-ميكرواري تحليل استخدام برامج محددة
- قم بفتح الصورة الخام (صورة TIFF). فتح ملف الشبكة الصفيف.
- محاذاة إلى الشبكة الصفيف لمسح الصورة مع مفاتيح السهم الماوس أو لوحة المفاتيح الخاصة بالكمبيوتر.
- حدد "التحديد الكمي للتحديد" في برنامج محدد، الذي يقوم بإنشاء ملف قراءات تحتوي على كثافة إشارة لكل بقعة وقيمة أساسية، وتسلسل الببتيد المقابلة.
ملاحظة: هذا الملف الناتج يمكن أيضا استيراد إلى برنامج جدول بيانات لتحليل إضافي والرسوم البيانية.
7-ميكرواري التخزين
- تخزين ميكرواري مختومة في الظلام في 4 درجات مئوية تحت غاز الأكسجين الحر النيتروجين أو الأرجون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم إظهار النتائج المتحصل عليها باستخدام البروتوكول هو موضح في الشكل 2 و الرقم 3. ولوحظت لا تفاعلات الخلفية عندما قبل تلطيخ ميكرواري مع الثانوي الإنسان المضادة IgM (البيانات لا تظهر). تلطيخ مع الإنسان المضادة IgM المتقارن أسفرت عن العديد من المجالات أعلاه خلفية كثافات الفلورية الخضراء، التي تشير إلى ربط هذه الببتيدات مع IgM في عينة مصل المضيف (الشكل 2). مفتش الكشف (إشارة حمراء الأسفار) كشفت سوى عدد قليل من الببتيدات (الشكل 2).
ويحلل البرمجيات الخاصة المقدمة من نفس الشركة المصنعة ميكرواري ميكرواري بعد المسح. ملف قراءات الذي تم إنشاؤه يحتوي على كثافة إشارة لكل بقعة، وقيمة أساسية، وتسلسل الببتيد المقابلة. كانت تصور شدة الأسفار بقعة من كل الببتيد برد قوي على IgM بالتآمر الأمامي أخضر متوسط القيم التي تم الحصول عليها بعد طرح الخلفية من قيمة الخام (الشكل 3).
رقم 1: التخطيطي يبين عملية التحليل بالنسبة ميكرواري الببتيد عالي الكثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ميكرواري الببتيد الصور الممسوحة ضوئياً. عينة الصور الفلورية الخام لتلطيخ ميكرواري الببتيد بعد حضانة مع مصل زيكف المخفف 1: 250. هو يصور مفاعليه مفتش باللون الأحمر (يسار)، ويرد مفاعليه IgM باللون الأخضر (علىاليمين). ها الببتيدات تحكم الإطار ميكرواري الببتيد. تكبير/تصغير لوحات إظهار مجموعة من الببتيدات مع كثافات عالية الأسفار، مشيراً إلى استجابة قوية ل IgM أو مفتش. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فيروس Zika الممثل توافق حانمه تسلسل التفاعل مع IgM في عينة مصل المضيف. تم رسم القيم الوسيطة في الصدارة خضراء من تداخل الببتيدات على الرسم بياني. ويبرز الببتيدات من تسلسل توافق حانمه الأحمر. يتم وضع علامة الببتيد مع أعلى كثافة الأسفار بخط غامق. ناقل على أساس تصميم الرسوم البيانية واستخدمت برامج لتوليد هذا الرقم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قمنا بتصميم بروتوكول استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على تسلسل البروتين فيروس زيكا كامل (سلالة بولينيزيا الفرنسية). ميكرواري تم تصنيعها من قبل الطباعة الببتيدات 3,423 مختلفة الخطية المتداخلة. وكان 15 من الأحماض الأمينية كل الببتيد ومتنوعة من بقايا واحد فقط من جارتها الأقرب في التسلسل (أي، تداخل بقايا 14). على الرغم من أن يمكن طباعة التداخل أقصر، رسم الخرائط حانمه أكثر دقة مع تداخلات أطول. وطبع كل الببتيد في تكرار زيادة الموثوقية.
من الضروري أن تبدأ العملية تلطيخ ميكرواري مع الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن التفاعلات الممكنة الخلفية وتمييزها من عينة إشارة محددة سلفا. استخدام المخزن مؤقت حظر محدد مهم أيضا كمخازن حظر الأخرى مثل مسحوق الحليب المجفف أو ألبومين المصل البقري (BSA) يمكن أن ينتج إشارة انخفاض كثافة. أولاً كان المحتضنة عينة مصل المصادق عليها للأجسام المضادة IgM زيكف مع ميكرواري في 1:1,000 ولكن تم الكشف عن أي إشارة. حضانة اللاحقة في إضعاف أقل من 1: 500 أسفرت عن انخفاض كثافة إشارة قادمة من الببتيدات التي تفاعلت مع الأجسام المضادة IgM في العينة. تم الحصول على أفضل النتائج عندما كان المخفف العينة زيكا المصل تم التحقق من صحتها الساعة 1: 250. نحن لا الاختبار عينة المصل في أعلى تركيز لتجنب زيادة الإشارات الخلفية. المعالجة الدقيقة ميكرواري ضروري لتجنب خدش السطح ميكرواري. ولذلك، الحلول مثل لنا المخفف المصل والمخزن المؤقت القياسية إضافة إلى ويتم إزالة من زاوية الدائرة ميكرواري. هامة للحصول على نتيجة ناجحة أيضا، هو الدرج حضانة محددة الشريحة بتوفيرها من قبل الشركة المصنعة ميكرواري، الذي صمم للسماح بالعمل مع وحدات التخزين نموذج الحد الأدنى. أبعاد علبة الحضانة سم 13.0 في 9.0 سم و 3 سم من سميكة. وهناك 3 شرائح عين تجاويف في علبة الحضانة التي تسمح للمعايرة 3 شرائح مختلفة في وقت واحد. ومع ذلك، في هذه التجربة استخدمنا شريحة واحدة فقط. ووضعت شرائح المجهر فارغة في تجاويف اثنين آخرين لتحقيق التوازن في العلبة والحيلولة دون كسر الشريحة الصفيف. علبة حضانة يتكون من أربعة أجزاء: لوحة قاعدة حيث يتم وضع الشرائح في تجاويف المعينة؛ السدادة تتكون من السيليكون لفصل كل شريحة من الآخرين؛ جزء العلوي يحتوي على الاتجار في الانضمام السدادة مع الصفيحة القاعدية وإنشاء دوائر ميكرواري لإضافة حلول للمقايسة مثل غسل عينة المخزن المؤقت أو المصل. السدادة والجزء العلوي لتفادي التلوث أو خلط الحلول بين الشرائح. مكون قسم آخر غطاء للتقليل من خطر التبخر أو التلوث البيئي للعينات. هو المفضل شاكر مداري للحصول على أمثل التبول وتلطيخ الظروف.
اعتماداً على عندما إصابة الفيروس المضيف IgM زيكا المحددة الناجمة عن ذلك يمكن تركيز الأجسام المضادة في الأمصال عالية أو منخفضة. ولذلك، كان من المتوقع أن يزيد استخدام عينة مصل مع أعلى تركيز IgM كثافة إشارة fluorescence النسبي. بعد الكشف عن IgM، كان المحتضنة نفس العينة المصل في إضعاف 1: 250 مع ميكرواري، ولكن كمفتش الإنسان المضادة الأجسام المضادة الثانوية. بدلاً من ذلك، يمكن اكتشاف جسم مختلف الفئات في وقت واحد داخل ميكرواري نفسه باستخدام خليط من الأجسام المضادة الثانوية كل مترافق مع الأصباغ الفلورية مختلفة. يمكن الملون ميكرواري نفسه مرة أخرى مع عينة مصل تتركز أكثر إذا كانت كثافة إشارة منخفضة. إذا كانت مخزنة بشكل صحيح ميكرواري هو مستقر لعدة أشهر وربما يمكن استخدامها مرة أخرى.
تم إجراء التحديد الكمي كثافات الموضعية والتعليقات التوضيحية الببتيد باستخدام البرمجيات المسجلة الملكية من الشركة المصنعة ميكرواري كما يوفر ملف ".psf" مع قالب نموذج الصفيف. ملف psf هي أساسا شبكة الذي تمت محاذاته إلى الصورة الخام الماسح الضوئي باستخدام البرمجيات المسجلة الملكية. خوارزمية برنامج يحلل كثافات fluorescence النسبي من كل بقعة في الخام (قيمة كثافة إشارة على الفور)، الأمامية والخلفية (القيمة التقديرية للإشارة الناجمة عن الربط غير محددة) (طرح الخلفية من الخام إشارة القيمة). فإنه أيضا بحساب القيم الوسطية الأمامية والوسطية الإجمالية المقدمة المقابلة لمتوسط القيمتين بقعة الوسطية لكل الببتيد في التكرارات. وباﻹضافة إلى ذلك، يحدد البرنامج توافق زخارف/حانمه ضمن تداخل الببتيدات. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس كثافة إشارة مع برنامج الماسح الضوئي ميكرواري ومن ثم استخدام القالب لصيغة الصفيف، يمكن تحديد تسلسل الببتيد.
وعقب هذا البروتوكول، حددت عدة مرشحين الببتيد الواعدة استناداً إلى كثافة الأسفار. تحليل14 انفجار لاحقة استخدمت لتحديد بقايا مع ه المحتملة إلى أخرى مصفر. ما مجموعة 14 الببتيدات المحددة موجودة فقط في زيكف كما تم تحديدها في 3 قواعد بيانات البروتين. ويزمع سلسلة ثانية من [ميكروارس] التي تحتوي على الببتيدات مختارة من الصفيف الأول. هذا سوف يسمح اختبار متعددة عينات تم التحقق من صحتها، فضلا عن عينات من الأشخاص المصابين مصفر خلاف زيكف فقط لتأكيد الخصوصية. للفرز، وسوف نكيف شكل الإنزيم ELISA، طلاء اللوحات مع الببتيدات المحدد واختبار الربط لأجسام مضادة محددة زيكف في عينات مصل الدم واللعاب البشري.
يتطلب التعامل مع زيكف يعملون في مرفق السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL-2)15. كما أننا عملنا مع عينة مصل التحقق من صحة للإصابة زيكف عملنا في مرفق BSL-2 أداء كل عينة التلاعب ضمن من "الفئة الثانية" (أو أعلى) السلامة البيولوجية مجلس الوزراء (BSC). وهذا السبب في أننا إبطال الفيروس تدفئة عينة المصل في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تفرخ العينة مع ميكرواري13. وعقب الحرارة المنظمة، من المستحسن أيضا مواصلة العمل في منشأة BSL-2 مع ممارسات السلامة المختبرية الجيدة الملائمة لتجنب فرصة الإصابة.
ميكرواري التي قمنا بتصميم يحتوي على الببتيدات الخطي وكونفورماشونال بالتبعية [ابيتوبس] قد تكون قيمة كما قد تم أخطأت التشخيص فقط. هذا القيد يمكن معالجتها باستخدام عالي الكثافة ميكرواري يحتوي على الببتيدات مقيدة دوري التي تحاكي حانمه يحلق هياكل16. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمسببات الأمراض الأخرى سريعاً لأنه متى عرفت تسلسل البروتين ميكرواري جديدة يمكن أن تصمم لاكتشاف الببتيدات التشخيصية المحتملة. كما يمكن تكييفها لتطبيقات أخرى مثل اكتشاف العلامات البيولوجية17، اكتشاف مستضد وحانمه لتطوير اللقاحات أو الأهداف العلاجية18،19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الدعم الحالي من قبل منحة ملحق إداري SBIR (بحوث الابتكار الأعمال الصغيرة) من NIDCRR44 DE024456. منح منحة NIDCR فيروس نقص المناعة البشرية التي تطورت من أصل NIDCR U01 DE017855 لوضع تشخيص نقطة الرعاية المؤكدة لفيروس نقص المناعة البشرية. ونعترف Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) سيلك امتنان للمساعدة التقنية والدعم الكريم. ونشكر أيضا جامعة نيويورك Langone المركز الطبي للي كو "أوديسي التصوير النظام".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
