Summary
在本协议中, 我们描述了一种利用高密度肽芯片来发现 Zika 病毒特异性诊断肽的技术。该议定书可 readly 其他新出现的传染性疾病。
Abstract
高密度肽微阵列允许在一张标准显微镜幻灯片上筛选超过6000多肽。该方法可应用于药物的发现、治疗目标的识别和诊断的发展。在这里, 我们提出了一个协议, 以发现特定的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断肽使用高密度肽芯片。用一种高密度肽微阵列对 ZIKV 感染进行了验证, 该芯片含有将整个 ZIKV 蛋白转化为3423个独特的15线性氨基酸 (aa) 残留物, 并重复打印 14 aa 的残留重叠。在同一阵列内染色不同的二次抗体, 我们检测到与血清中存在的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 抗体结合的肽。选择这些肽进行进一步的验证实验。在本协议中, 我们描述了在设计、处理和分析高密度肽芯片时所采用的策略。
Introduction
基于临床症状的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断具有挑战性, 因为它与登革热和基孔肯亚病毒感染的传播媒介、地理分布和症状有关1。鉴于怀孕期间感染 ZIKV 的妇女面临不良妊娠结局的风险, 区分3病毒是很重要的。虽然目前的分子诊断测试是特定的, 但它们只在血液或唾液中有用, 在相对较短的急性感染期间2,3。血清学检测是诊断这一初始感染期以外的重要4。
ZIKV 特异性血清学检测的发展具有挑战性的两个原因: 一是人类免疫系统反应的 Zika 抗原目前尚不为人所知;第二, 保守的 flaviviruses 氨基酸序列诱导抗体的交叉反应性。我们的目的是发现独特的 ZIKV 特定肽用于诊断。已经开发出不同的方法来筛选包括噬菌体、细菌和酵母表面在内的整个蛋白质的肽库, 显示5,6,7,8,9, 10。我们的战略是使用高密度肽芯片, 允许快速和廉价的高通量血清学筛查11,12 , 随后确定的肽可用于改善目前的血清学检测 ZIKV 感染的方法。
此协议允许使用高密度肽芯片 (图 1) 发现 Zika 病毒特定诊断肽。采用多肽激光印花技术制备高密度肽微阵列。整个 ZIKV 蛋白序列由3423种基于法国玻利尼西亚应变 (基因库: KJ776791.2) 的氨基酸残留物印在标准玻璃上, 在15条线性残留物块中, 重叠14个氨基酸残留物, 以复制共6846个肽斑。除了整个 Zika 蛋白序列多肽, 微阵列利用流感血凝素 (HA) 肽进行内部控制.
Zika 证实的阳性血清样本 (纽约州奥尔巴尼) 获得, 用于鉴定特定的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 活性肽。在一夜之间用样本孵化后, 微阵列被染成二级 fluorochrome 共轭抗体 (抗人 IgM 或抗人 IgG), 并在微阵列扫描仪上进行分析。用制造芯片的同一公司提供的特定软件对光斑强度和肽标注进行量化。
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Protocol
这些数据是纽约大学牙科学院正在进行的研究研究的一部分, 由纽约大学医学院的机构审查委员会批准, H10-01894。本研究中使用的临床样本是以前用于诊断的不确定样本, 并得到纽约州奥尔巴尼的美国卫生部的沃斯德中心的许可。
1. 在特定的孵化盘中安装 ZIKV 高密度肽微阵列幻灯片
- 使用无粉手套处理玻璃滑边。玻璃滑动尺寸是75.4 毫米25.0 毫米和1毫米厚。将幻灯片放在孵化盘中, 微阵列表面朝上。
- 将密封面的光泽面向下放置在微阵列打印表面上。为了保证良好的位置, 请将密封件和底板的螺钉孔重叠。
- 将托盘上部放在密封上, 以创建微阵列腔。
- 固定在托盘中的幻灯片, 通过在一个交替的模式, 从左上角开始, 然后右下角, 同样地拧紧螺钉。放置孵化盘的盖子。
2. 背景相互作用检测: 用二次抗体染色微阵列
注: 使用吸管将溶液 (标准和阻塞缓冲器, 稀释后的二级抗体) 存入芯片室的拐角处。
- 用标准缓冲器 (1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 0.05% 吐温 20, pH 值 7.4, 用0.45 µm 过滤器 (总容积2000µL/微阵列) 孵化芯片, 在 rpm 的轨道振动筛室温下 (RT) 进行15分钟的检测。
- 通过从微阵列腔的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。用空白幻灯片填充空幻灯片持有者, 以防止微阵列幻灯片的中断。
- 在 140 rpm 的轨道振动筛上, 用阻塞缓冲器 (总容积2000µL/微阵列) 拦截60分钟的微阵列。
- 在微阵列腔的拐角处用吸管抽吸, 以去除堵塞缓冲器。
- 用二级抗体孵化微阵列, 抗人 IgM fluorochrome 共轭, 稀释 1: 5000 (总容积2000µL/微阵列) 在染色缓冲器 (10% 阻塞缓冲器在标准缓冲器) 为30分钟在黑暗中 RT 在一个轨道振动筛在140rpm.
- 在微阵列腔的拐角处用吸管吸除二次抗体。
- 用标准缓冲器清洗微阵列 3x, 每洗1分钟 (总容积为2000µL/微阵列, 在 140 rpm 的轨道振动筛上。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。
- 将幻灯片2x 浸入新鲜准备的浸渍缓冲 (1 毫米, pH 值 7.4), (总体积为200毫升)。
- 仔细地干燥微阵列, 大约1分钟, 通过从顶部到幻灯片底部非常仔细地吸出多余的液体而不触及滑动面。分析微阵列扫描仪读取器中的幻灯片。
3. 微阵列暴露于宿主血清中
注意: 在实验室安全条件下执行这一步骤, 生物安全等级 2 (BSL-2), 因为血清标本的潜在感染性。在第二类生物安全柜 (BSC) 内工作。
- 在4°c13的5分钟内, 在1.6万个区域合作框架内对30分钟和离心机进行56摄氏度灭活血清样品。
注: 使用吸管将溶液 (染色, 标准缓冲液和稀释后的血清) 存入芯片室的角落。 - 稀释血清样品在染色缓冲从 1:1, 000 (总容量 2000 ul/微阵列) 稀释。保持在4摄氏度, 直到使用。
- 用染色缓冲器 (2000 ul/微阵列的总容积) 孵化微阵列, 在 140 rpm 的轨道振动筛上进行15分钟的 RT。
- 在微阵列腔的拐角处用吸管吸出, 去除染色缓冲器。
- 用稀释后的血清样本在 140 rpm 的轨道振动筛上过夜, 将微阵列孵化为4摄氏度。
- 在微阵列的拐角处用吸管吸出稀释后的血清样品。
- 用标准缓冲器清洗微阵列 3x, 每洗1分钟 (总容积 2000 ul/微阵列在轨道振动筛 140 rpm。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。
4. 用二次抗体染色和标记控制抗体
注: 使用吸管将溶液 (标准缓冲器, 稀释的二次和标签抗体) 存入芯片室的拐角处。
- 稀释染色缓冲器中的二次抗体。
注: 使用抗人 IgM fluorochrome 共轭抗体或抗人 IgG fluorochrome 共轭抗体稀释 1:5, 000 (总容积2000µL/微阵列) 染色缓冲器。 - 混合控制标签抗体 (单克隆抗 HA fluorochrome 共轭) 在稀释 1:1, 000 (总容量 2 000 µL/微阵列) 在染色缓冲器与二次抗体以前稀释在染色缓冲。
- 用微阵列孵育30分钟, 在黑暗的轨道振动筛在 140 rpm。
- 在微阵列的拐角处用吸管抽吸, 去除稀释后的二级和标签抗体的混合。
- 用标准缓冲器清洗 3x (总容积为2000µL/微阵列)。每个洗涤是1分钟在一个轨道振动筛在140转每分钟。每次清洗后, 通过从芯片室的拐角处吸出吸管来去除标准缓冲器。
5. 微阵列扫描
- 将幻灯片2x 浸入新鲜准备的浸渍缓冲液 (1 毫米, pH 值 7.4) (总体积为200毫升)。
- 仔细地干燥芯片, 大约1分钟, 通过非常小心地从顶部到幻灯片底部, 而不触及幻灯片表面。
- 按照扫描仪的说明扫描微阵列。将幻灯片置于扫描仪上, 打印面朝上。
- 创建一个新项目并选择扫描区域。将扫描仪参数设置为: 分辨率:21 µm, 强度为700和 800 nm 通道: 7.0, 扫描质量: 中和偏移: 0.8。
- 获取并保存扫描原始图像作为16位灰度 TIFF 文件格式。
6. 使用特定软件的微阵列分析
- 打开原始图像 (TIFF 图像)。打开阵列网格文件。
- 使用计算机的鼠标或键盘箭头键将阵列网格与扫描图像对齐。
- 在特定软件中选择 "量化选择", 它创建一个读数文件, 其中包含每个点的信号强度、背景值和相应的肽序列。
注意: 此输出文件还可以导入到电子表格程序中, 以进行其他分析和绘图。
7. 微阵列存储
- 储存在黑暗中密封的微阵列在4°c 下无氧氮气或氩气。
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Representative Results
由制造芯片的同一公司提供的特定软件对扫描后的微阵列进行了分析。所创建的读出文件包含每个点的信号强度、背景值和相应的肽序列。通过绘制在从原始值中减去背景后获得的绿色前景中值 (图 3), 可以直观地描绘出每个肽对 IgM 有强烈反应的斑点荧光强度。
图 1:显示高密度肽微阵列分析过程的示意图.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:多肽微阵列扫描图像.ZIKV 血清样品稀释1:250 后, 在孵化后对多肽微阵列进行染色的原始荧光图像。IgG 反应性以红色 (左) 描述, IgM 反应性以绿色 (右) 显示。HA 控制肽框架的肽芯片。变焦面板显示高荧光强度的多肽组, 表明对 IgM 或 IgG 的强烈反应。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:代表 Zika 病毒表位一致序列与 IgM 在宿主血清样品中反应.在图上绘制了重叠多肽的绿色前景中值。表位一致性序列中的肽以红色突出显示。荧光强度最高的肽以粗体标记。基于矢量的图形设计软件用于生成这个数字。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们设计了一个协议, 利用高密度肽芯片包含整个 Zika 病毒蛋白序列 (法国玻利尼西亚人菌株)。该芯片是通过打印3423不同的重叠线性多肽制造的。每一个肽是15氨基酸并且由它的最近的邻居仅一个残余在序列 (例如, 14 残余重叠) 变化。虽然可以打印较短的重叠, 但表位映射更精确, 重叠时间更长。每一个肽都以重复打印, 以提高可靠性。
重要的是开始的过程中, 预先染色的微阵列与二级抗体, 以检测可能的背景相互作用, 并区别于样本特定的信号。使用特定的阻塞缓冲区也很重要, 因为其他阻塞缓冲区如牛血清白蛋白 (BSA) 或奶粉可能导致信号强度降低。ZIKV IgM 抗体的经证实的血清样品首先用微阵列在 1:1, 000, 但没有检测到信号。随后的孵化在低稀释1:500 导致了低强度信号来自肽, 反应与 IgM 抗体在样品。Zika 经证实的血清样品稀释 1:250, 取得了较好的效果。我们没有重新测试血清样本的浓度较高, 以避免增加的背景信号。仔细处理芯片是必不可少的, 以避免擦伤芯片表面。因此, 这种美国稀释血清和标准缓冲器的解决方案被添加到并从芯片室的角落中移除。此外, 重要的是成功的结果是由生产芯片的公司提供的幻灯片特定孵化托盘, 这是设计允许使用最小的样本量。孵化托盘尺寸为13.0 厘米, 9.0 厘米和3厘米厚。孵化盘中有3张幻灯片指定的腔, 可以同时测定3张不同的幻灯片。然而, 在这个实验中, 我们只用了1张幻灯片。将空白显微镜幻灯片放在其他两个腔中, 以平衡托盘并防止阵列幻灯片的破裂。孵化托盘由4部分组成: 在指定腔内放置滑轨的底板;由硅组成的封口机, 用于将每一张幻灯片与其他图片分开;包含螺钉的上部, 用于将封口机与基板连接在一起, 并创建微阵列以添加用于检测的溶液, 如洗涤缓冲器或血清样品。密封件和上部避免了在幻灯片之间的污染或混合的解决方案。最后一部分组件是一个盖子, 以尽量减少蒸发或环境污染的样品的风险。一个轨道振动筛是首选, 以获得最佳的润湿和染色条件。
根据病毒感染宿主的时间, 所产生的特定 Zika IgM 抗体浓度在血清中可以是高还是低。因此, 预计使用具有较高 IgM 浓度的血清样本会增加相对荧光信号强度。在 IgM 检测后, 用微阵列对同一血清样品进行稀释1:250 的孵化, 但用抗人 IgG 作为继发抗体。另外, 不同的抗体类可以同时检测同一芯片内使用的二次抗体混合物每共轭不同的荧光染料。如果信号强度低, 同样的微阵列可以再次沾上更浓的血清样本。如果正确存储, 微阵列稳定了几个月, 可能再次使用。
对光斑强度和肽标注进行量化是使用公司专有软件制作的, 该芯片还提供了一个带有数组格式模板的 ". psf" 文件。psf 文件实质上是一个网格, 它使用专有软件与原始扫描仪映像对齐。软件算法分析了每个点的相对荧光强度 (光斑信号的强度值)、背景 (非特定绑定引起的信号估计值) 和前景 (从原始值) 信号。同时计算了各肽中两个中点值的平均前向中值和总前景中位数。此外, 该软件还确定了重叠肽内的一致图案/表位。另外, 信号强度可以用微阵列扫描仪软件进行量化, 然后使用数组格式的模板, 可以识别多肽序列。
根据该协议, 在荧光强度的基础上确定了几种有前景的肽候选者。随后的爆炸14分析用于识别与其他黄潜在的交叉反应的残留物。只有在3蛋白质组数据库中确定的 ZIKV 中, 共有14个已确定的多肽存在。计划将包含第一个数组中选定的多肽的第二系列微阵列。这将允许测试多个经过验证的标本, 以及来自感染黄的人的样本, 而不是 ZIKV, 以确认特异性。为筛查, 我们将适应 ELISA 检测的格式, 涂层的选择肽和测试的结合, 以 ZIKV 特异抗体的人血清和唾液样本。
ZIKV 处理要求在生物安全级别 2 (BSL-2) 设施15中工作。当我们工作的血清样本验证 ZIKV 感染, 我们工作在 BSL-2 设施执行所有的样本操作在第二类 (或更高) 生物安全柜 (BSC)。这就是为什么我们在用微阵列13进行样品孵化之前, 将血清样品加热56摄氏度, 使其在30分钟内灭活。在热失活后, 还建议继续在 BSL-2 设施工作, 并提供适当的实验室安全操作规程, 以避免感染的机会。
我们设计的微阵列只包含线性多肽和必然的构象表位, 因为诊断可能已被遗漏。这种限制可以通过使用含有周期性约束肽的高密度微阵列来模拟环状表位结构16来解决。这个协议可以迅速地适应其他病原体, 因为一旦蛋白质序列被知道一个新的微阵列可以设计, 以发现潜在的诊断肽。它还可以适应其他应用, 如生物标志物发现17, 抗原和表位发现为疫苗开发或治疗目标18,19。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
目前的支持由 NIDCRR44 DE024456 的 SBIR (小型企业创新研究) 行政补充补助金提供。NIDCR 艾滋病毒补助金的发展 NIDCR 赠款 U01 DE017855, 以制定一个验证性的护理点诊断艾滋病毒。我们感谢 Silke Weisenburger (德国海德堡 PEPperPRINT) 的技术援助和亲切支持。我们还感谢纽约大学朗格尼医学中心的李-林奥德赛成像系统。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
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