Summary
このプロトコルでは高密度ペプチド マイクロ アレイを用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドを発見する手法について述べる。このプロトコルは、他の新興感染症に立ち向かえない適合できます。
Abstract
高密度ペプチド マイクロ アレイは、単一の標準顕微鏡スライドの 6000 以上のペプチドのスクリーニングを許可します。このメソッドは薬剤の発見、治療標的の同定、開発を適用ことができます診断の。ここでは、高密度ペプチド マイクロ アレイを用いた特定ジカ ウイルス (ZIKV) 診断ペプチドを発見するためのプロトコルを提案する.ZIKV 感染は 14 aa 残重複 3,423 ユニークな 15 直線のアミノ酸 (aa) 残基に変換全体 ZIKV タンパク質を含む高密度ペプチド マイクロ アレイと孵化させるを検証ひと血清サンプルで重複して印刷されます。同じアレイ内で異なる二次抗体で染色、免疫グロブリン M (igm 抗体)、免疫グロブリン G (IgG) 抗体が血清中に存在するペプチドを検出しました。これらのペプチドは、さらに検証実験のために選ばれました。このプロトコルではデザイン、処理、および高密度ペプチド マイクロ アレイの分析に続いて戦略について述べる。
Introduction
デング熱とチクングニア ウイルス感染1ベクトル、地理的分布と症状で共有ために臨床症状に基づくジカ ウイルス (ZIKV) の診断が困難します。妊娠中に ZIKV に感染している女性の妊娠における有害転帰のリスクを考えると、3 つのウイルスを区別することが重要です。現在の分子診断テストが特定、のみ便利です血液や唾液で急性感染症2,3の比較的短い期間の間に。血清学的アッセイは、感染4のこの最初の期間の外の診断に不可欠です。
ZIKV 特定の血清学的アッセイの開発が困難になる 2 つの理由: 最初に、人間の免疫システムの応答にジカ抗原は現在知られていない;そして第二に、保存された発現アミノ酸抗体の交差反応を誘導します。私たちの目的は、診断で使用するユニークな ZIKV 特定ペプチドを発見するだった。カバーのバクテリオファージ、細菌などを含む全体の蛋白質画面ペプチド ライブラリに異なるアプローチが開発され、酵母表層ディスプレイ5,6,7,8,9、 10。当社の戦略により、迅速かつ安価な高スループットの血清学的上映11,12高密度ペプチド マイクロ アレイを使用して血清学的現在を改善するために識別されたペプチドを使用ことができますその後ZIKV 感染症の検出のための試金。
このプロトコルは、高密度ペプチド マイクロ アレイ (図 1) を用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドの探索を有効。 にします。高密度ペプチド マイクロ アレイは、ペプチドのレーザー印刷技術を使用して製作されました。3,423 アミノ酸残基から成る全体 ZIKV 蛋白質順序はフランスのポリネシアのひずみに基づいて (GenBank: KJ776791.2)、14 アミノ酸残基の重複の重複で 15 線形残基のブロックの標準的なガラス スライドをプリントした、6,846 ペプチド スポットの合計。全体ジカ タンパク質配列ペプチドに加えて、マイクロ アレイを利用インフルエンザ血球凝集素内部統制 (HA) ペプチド。
ジカ検証正ワズワース中心 (アルバニー、ニューヨーク) から得られた血清サンプルは特定の免疫グロブリン M (IgM) および免疫グロブリン G (IgG) 反応性ペプチドを識別するために使用されました。サンプルで一晩インキュベート後、マイクロ アレイだった二次螢光色素共役抗体 (抗ひと igm 抗体または抗ひと IgG) で染色し、マイクロ アレイ スキャナー解析。マイクロ アレイを製造する同じ会社によって提供される特定のソフトウェア スポット強度とペプチド アノテーションの定量化を行った。
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Protocol
これらのデータ、ニューヨーク大学歯学部で進行中の研究調査の一部であり、ニューヨーク大学医学部、IRB の制度検討委員会によって承認された # H10 01894。本研究で使用される臨床サンプルは、従来の診断とアクセス許可から、ワズワース センターのニューヨーク州保健省、アルバニー、ニューヨーク デ識別のサンプルです。
1. 特定のインキュベーション トレイで ZIKV 高密度ペプチド マイクロ アレイ スライドをインストール
- パウダー フリーの手袋を使用して端をスライド ガラスを処理します。ガラス スライドの寸法は、75.4 mm 25.0 mm、厚の 1 mm です。マイクロ アレイ面とインキュベーション トレイにスライドを配置します。
- マイクロ アレイの印刷面に下向きのシールの光沢のある面を置きます。良い位置を確保するため、シールとベース プレートのネジ穴が重なります。
- マイクロ アレイの商工会議所を作成には、シールの上にトレイの上の部分を配置します。
- 締め付けによって均等に蝶ネジ 1 つの別の後続いて右下左上から交互に手でトレイにスライドを固定します。インキュベーション トレイのふたを配置します。
2. 背景の相互作用検出: 染色二次抗体のマイクロ アレイ
注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準およびブロック バッファー、希釈した二次抗体) を入金するのにピペットを使用します。
- 標準的なバッファー (1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、0.05% Tween 20、pH 7.4 では、0.45 μ m フィルターでフィルタ リング) とマイクロ アレイを孵化させなさい (合計 2,000 μ L/マイクロ アレイのボリューム) 140 rpm で軌道シェーカーで室温 (RT) で 15 分。
- 標準的なバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。マイクロ アレイ スライドの破損を防ぐために空白のスライドを持つ空のスライド ホルダーを入力します。
- 140 rpm で軌道シェーカーで RT で 60 分のブロック バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) をマイクロ アレイをブロックします。
- ブロックのバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
- 二次抗体、抗ひと IgM 螢光色素共役とマイクロ アレイを孵化させなさい、染色で希釈 1: 5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) が 140 で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分 (標準的なバッファー内のバッファーをブロック 10%) をバッファーrpm。
- 二次抗体を削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
- 3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。
- スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) x, (200 mL の合計容積)。
- スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に余分な水分を吸引して、約 1 分の慎重に、マイクロ アレイを乾燥します。マイクロ アレイ スキャナー リーダーのスライドを分析します。
3. 血清をホストするマイクロ アレイの露出
注意: は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 血清検体の潜在的な感染性のための研究所安全性条件の下でこの手順を実行します。クラス II 生物学的安全キャビネット (BSC) 内で動作します。
- 30 分 56 ° C で血清サンプルと 16,000 rcf134 ° C で 5 分間遠心分離を不活性化します。
注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (染色、標準的なバッファーと希釈血清) を入金するのにピペットを使用します。 - 縮尺 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈から始まる染色バッファーの血清サンプルを希釈します。使用するまで 4 ° C でそれを維持します。
- 染色バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) とマイクロ アレイ 140 rpm で軌道シェーカーで RT で 15 分間インキュベートします。
- 染色バッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
- 140 rpm で軌道シェーカー 4 ° C で一晩希釈血清サンプルのマイクロ アレイを孵化させなさい。
- 希釈血清サンプルを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
- 3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。
4. 二次抗体とラベル付きコントロール抗体染色
注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準的なバッファー、希薄化後の二次とラベル抗体) を入金するのにピペットを使用します。
- 染色バッファーで二次抗体を希釈します。
注: 使用抗ひと IgM 螢光色素共役抗体または抗ひと IgG 螢光色素共役抗体染色バッファーで 1:5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈。 - ミックス コントロール ラベル抗体 (モノクローナル抗-共役系螢光色素を HA) の縮尺 (2 000 μ L/マイクロ アレイの全容積) 以前染色バッファーで希釈した二次抗体染色バッファーで希釈。
- マイクロ アレイを用いた 140 rpm で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分で孵化させなさい。
- 希釈した二次とラベル抗体のミックスを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
- 標準バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の 3 倍を洗います。各洗浄は 140 rpm で軌道シェーカーで 1 分です。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。
5. マイクロ アレイのスキャン
- スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) (200 mL の合計容積) に x。
- 慎重に、マイクロ アレイをドライ スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に吸引で約 1 分。
- スキャナーの指示に従ってマイクロ アレイをスキャンします。印刷面をスキャナーの上にスライドを配置します。
- 新しいプロジェクトを作成し、スキャンする領域を選択します。スキャナーとしてのパラメーターを設定: 解像度: 21 μ m、700 と 800 nm チャンネルの強度: 7.0、スキャン品質: 媒体およびオフセット: 0.8。
- 取得し、16 ビット グレースケール TIFF ファイル形式としてスキャンの raw 画像を保存します。
6 特定のソフトウェアを使用してマイクロ アレイ解析
- Raw 画像 (TIFF イメージ) を開きます。アレイ グリッド ファイルを開きます。
- コンピューターのマウスまたはキーボードの矢印キーでスキャン画像を配列グリッドに合わせます。
- 各スポットの信号の強さ、背景値、および対応するペプチド配列を含む読み出しファイルを作成する特定のソフトウェアで「定量化選択」を選択します。
注意: この出力ファイルは、追加の分析とグラフ作成のスプレッドシート ・ プログラムにインポートもできます。
7. マイクロ アレイ ストレージ
- 酸素遊離窒素またはアルゴン ガス下の 4 ° C で暗闇の中で密封されたマイクロ アレイを格納します。
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Representative Results
説明されたプロトコルを使用して得られた結果は、図 2に示すと図 3。事前二次抗ひと IgM (データは示されていない) とマイクロ アレイを汚した場合、背景の相互作用はみられなかった。抗ひと igm 抗体染色結果背景緑色蛍光強度、ホスト血清サンプル (図 2) では IgM とこれらのペプチドの結合を示す上記のいくつかの領域。IgG の検出 (赤い蛍光性信号) は、のみいくつかペプチド (図 2) を明らかにしました。
マイクロ アレイを製造する同じ会社によって提供される特定のソフトウェアは、スキャンした後、マイクロ アレイを分析します。作成された読み出しファイルには、各スポットの信号の強さ、背景値、および対応するペプチッド シーケンスが含まれています。IgM に強い応答を各ペプチド スポット蛍光強度は、(図 3) の生の値からバック グラウンドを除去後に得られた緑の前景中央値をプロットし, 可視化されました。
図 1:高密度ペプチド マイクロ アレイの分析のプロセスを示す概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ペプチド マイクロ アレイのスキャン イメージ。ZIKV 血清とインキュベート後ペプチド マイクロ アレイを染色の未加工の蛍光画像サンプル希釈 1: 250。IgG の反応が (左)、赤で描かれている、(右) グリーンで IgM の反応性を示します。ハ制御ペプチドのペプチド マイクロ アレイをフレームします。ズーム パネルは、IgM や IgG に強い反応を示す高い蛍光強度を有するペプチドのグループを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:代表ジカ エピトープ コンセンサスシークエンス ホスト血清サンプルでは IgM の反応します。ペプチドから緑の前景中央値をプロットしたグラフ。エピトープ コンセンサス配列からペプチドは、赤色でハイライトされます。最高の蛍光強度とペプチドは、太字で示されます。ベクトル ベースのグラフィック デザイン ソフトウェアは、この図の生成に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ジカ ウイルス蛋白質シーケンス (フランス ポリネシアひずみ) の全体を含む高密度ペプチド マイクロ アレイを利用したプロトコルを考案しました。マイクロ アレイは、印刷 3,423 異なる重複線形ペプチドによって製造されました。各ペプチド 15 アミノ酸とシーケンス (すなわち、14 残重複) 最も近い隣人から 1 つだけ残基によって変化します。短い重複を印刷することができます、エピトープ マッピングは長く重複とより正確です。各ペプチドは、信頼性を高めるため重複でプリントしました。
あらかじめ染色可能な背景の相互作用を検出し、サンプルの特定の信号からそれらを区別するために二次抗体のマイクロ アレイを持つプロセスを開始することが欠かせません。特定のブロック バッファーを使用してもウシ血清アルブミン (BSA) または乾燥ミルクの粉は減らされた信号強度につながるような他のブロック バッファーとして重要です。ZIKV IgM 抗体のための検証済み血清サンプルされた縮尺でマイクロ アレイと培養したが、信号は検出されなかった。1: 500 の低希釈でその後インキュベーションは、サンプル中の IgM 抗体と反応したペプチドから来る低輝度信号で起因しました。ジカ検証された血清サンプルに希釈したとき、最高の結果が得られました。我々 はしないバック グラウンド信号の増加を避けるために高濃度で血清サンプルを再テストします。マイクロ アレイの慎重な取り扱いはマイクロ アレイ表面の傷を避けるために不可欠です。そのため、ソリューションのような私たち希釈血清および標準的なバッファーに追加され、マイクロ アレイの部屋の隅から削除します。また、最小限のサンプル ボリュームを操作できるように設計されているマイクロ アレイの製造会社によって提供されるスライド特定インキュベーション トレイは成功した結果のために重要です。インキュベーション トレイ寸法は 13.0 cm × 9.0 cm、厚さ 3 cm です。インキュベーション トレイ 3 の別のスライドを同時に試金ができる空洞を指定された 3 つのスライドがあります。ただし、この実験では、のみ 1 スライドを使用しました。空白の顕微鏡のスライドは、トレイのバランスをとり、配列スライドの破損を防ぐために他の 2 つのキャビティに置かれました。インキュベーション トレイは、4 つの部分で構成されています: 指定されたキャビティにスライドを配置する場所ベース プレート他人から各スライドを分離するシリコン成ってシーラーシーラーをベース プレートに参加し、バッファーまたは血清サンプルを洗浄などの試金のためのソリューションを追加するためのマイクロ アレイ室蝶ネジを含む上部。シーラーと上の部分は、汚染やスライド間のソリューションの混合を避けてください。最後のセクション コンポーネントは、サンプルの環境汚染や蒸発の危険性を最小限に抑えるための蓋です。軌道のシェーカーは、濡れ、染色条件に最適を取得する優先されます。
ホストの結果特定ジカ IgM がウイルスに感染している場合に応じて、血清中の抗体濃度、高または低。したがって、それは血清サンプルを用いた高 IgM 濃度が相対的な蛍光信号強度を増加することが予想されました。IgM 検出後同じ血清サンプルは、マイクロ アレイの 1: 250 の希釈で培養した、抗ひと igg 抗体は、二次抗体として使用されました。また、異なる抗体クラスは、異なる蛍光色素でそれぞれ共役二次抗体の混合物を使用して同じマイクロ アレイ内で同時に検出できます。同じマイクロ アレイは、信号強度が低い場合より集中している血清サンプルを再び汚すことができます。適切に保存マイクロ アレイは数ヶ月は安定と、再度使用する可能性があります。
また配列形式のテンプレートを".psf"ファイルを提供するマイクロ アレイを製造会社から独自のソフトウェアを使用してスポット強度とペプチド注釈の定量化を行った。Psf ファイルは本質的に独自のソフトウェアを使用して生のスキャナー画像に配置されるグリッドです。ソフトウェア アルゴリズムを生に各スポットの相対的な蛍光強度分析 (スポットの信号の強さの値)、前景色および背景 (非特異的結合によって引き起こされる信号の推定値) (生からバック グラウンド減算値) 信号。また、前景中央値と複製における各ペプチドの 2 つの中央のスポットの値の平均値に対応する集計の前景の中央値を計算します。さらに、ソフトウェアは、コンセンサス モチーフ/ペプチドのエピトープを識別します。また、信号強度を示すことができるマイクロ アレイ スキャナー ソフトウェアし、配列形式のテンプレートを使用すると、ペプチド配列を識別できます。
このプロトコルでは、次のいくつかの有力なペプチドは、蛍光強度に基づいて識別されました。その後ブラスト14分析は、他のフラビ ウイルスに潜在的な交差反応性の残基を識別するために使用されました。14 特定されたペプチドの合計が ZIKV 3 プロテオーム データベースで識別にのみ存在です。マイクロ アレイの 2 番目のシリーズの計画最初の配列から選択したペプチドを含みます。複数検証標本と同様にのみ ZIKV 以外のフラビ ウイルスに感染した人からのサンプル特異性を確認するをテストできるようになります。スクリーニング、選択したペプチドでプレートのコーティングとひと血清および唾液のサンプルで ZIKV 特定の抗体にバインディングのテスト、ELISA アッセイ形式を適応します。
ZIKV 処理は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 施設15での作業が必要です。血清サンプル クラス II 内のすべてのサンプル操作を行う BSL 2 施設で働いていた ZIKV 感染の検証済み (またはより高い) 生物学的安全キャビネット (BSC) との共同作業。だからこそ、我々 はマイクロ アレイ13のサンプルの孵化前に 30 分の 56 ° c 血清サンプルを加熱ウイルスを不活化します。オススメ次の熱不活化、感染の可能性を避けるために適切な良い研究室安全対策と BSL 2 施設で作業を続けます。
考案したマイクロ アレイでは、線形のペプチドと診断が見逃されている可能性がありますので、有用な構造的エピトープのみを含まれています。この制限は、密度を使用して解決することができますループ エピトープを模倣する環状の制約されたペプチドを含むマイクロ アレイ構造の16。潜在的な診断ペプチドの発見の新しいマイクロ アレイを設計できます一度に蛋白質順序は知られているのでこのプロトコル急速に他の病原体に適応することができます。バイオ マーカー探索17、ワクチン開発や治療標的18,19抗原及びエピトープの探索などのアプリケーションに適応することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
現在のサポートは、NIDCRR44 DE024456 から SBIR (中小企業技術革新研究) 管理サプリメント補助金によって提供されます。NIDCR から進化した NIDCR HIV 助成金は、HIV の検証ポイント ・ オブ ・ ケア診断の開発の u01 で DE017855 を付与します。我々 は感謝して彼女のテクニカル サポートと親切なサポートのためシルク Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) を認めます。我々 はまた、李 COR オデッセイ イメージング システムの NYU Langone 医療センターを感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
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