Summary
Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.
Abstract
High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.
Introduction
Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção4.
O desenvolvimento de um ensaio sorológico específico de ZIKV é um desafio por duas razões: primeiro, os antígenos Zika que o sistema imunológico humano responde não são atualmente conhecidos; e sequências de aminoácidos conservados, segundo flavivírus induzem reactividade cruzada do anticorpo. Nosso objetivo era descobrir exclusivos peptídeos ZIKV específicos para ser usado no diagnóstico. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para bibliotecas de peptídeo de tela cobrindo toda proteínas incluindo fago, bacteriano, e superfície de levedura exibir5,6,7,8,9, 10. Nossa estratégia foi usar um microarray de peptídeo de alta densidade que permite rápida e barata elevado-throughput exames serológicos11,12 e posteriormente os peptídeos identificados podem ser usados para melhorar a corrente serológico ensaios para detecção da infecção por ZIKV.
Este protocolo permite a descoberta de Zika vírus específico diagnósticos peptídeos usando um microarray de peptídeo de alta densidade (Figura 1). O peptídeo high-density microarray foi produzido usando a tecnologia de impressão laser do peptide. A sequência de proteína inteira ZIKV constituído por resíduos de aminoácidos 3.423 baseia a estirpe da Polinésia francesa (GenBank: KJ776791.2), foi impresso em um slide de vidro padrão em blocos de 15 resíduos lineares com uma sobreposição de 14 resíduos de aminoácidos em duplicado para um total de 6.846 pontos de peptídeo. Além dos peptídeos de sequência de proteínas Zika todo, o microarray utiliza hemaglutinina gripe (HA) de peptídeos para controles internos.
Uma Zika validado positivos Obtida de Wadsworth Center (Albany, NY), de amostra de soro foi usada para identificar específicas imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) reativos peptídeos. Após a incubação com a amostra durante a noite, o microarray foi manchada com um anticorpo conjugado fluorocromo secundário (anti-humano IgM ou IgG anti-humano) e analisado em um scanner de microarray. Quantificação de intensidades local e anotação de peptídeo foi realizada com um software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray.
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Protocol
Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY.
1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptídeo Microarray deslize em uma bandeja de incubação específica
- Lidar com a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões do slide de vidro são 75,4 mm 25,0 mm e 1 mm de espessura. Coloque o slide na bandeja de incubação com a superfície de microarray virada para cima.
- Coloque o lado brilhante do selo virado para baixo sobre a superfície impressa do microarray. Para garantir uma boa posição, sobrepõem-se os furos de parafuso do selo e a placa de base.
- Coloque a parte superior da bandeja para o selo para criar uma câmara de microarray.
- Fixe o slide na bandeja apertando igualmente os parafusos um após o outro com a mão em um padrão alternado, começando do canto superior esquerdo, seguido pelo canto inferior direito. Coloque a tampa da bandeja de incubação.
2. antecedentes interação deteção: Manchando o Microarray com anticorpos secundários
Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (padrão e bloqueio buffers, diluídos anticorpos secundários) no canto da câmara de microarray.
- Incubar o microarray com um buffer padrão (1 x salina tamponada fosfato (PBS), 0,05% de Tween 20, pH 7,4, filtrada com um filtro de 0,45 µm) (total de volume de 2.000 µ l/microarray) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) em um agitador orbital a 140 rpm.
- Retire o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray. Preencha os titulares slide vazio com slides em branco para evitar a quebra da corrediça microarray.
- Bloquear o microarray com o tampão de bloqueio (volume total de 2.000 µ l/microarray) por 60 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.
- Retire o tampão de bloqueio por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Incubar o microarray com anticorpo secundário, fluorocromo de IgM anti-humano conjugado, diluído 1: 5.000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) de coloração, o tampão (10% de bloqueio de buffer de buffer padrão) por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital 140 rpm.
- Remova o anticorpo secundário por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Mergulhe a lâmina 2 x em um buffer de imersão recentemente preparado (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).
- Seca o microarray cuidadosamente, por cerca de 1 min, aspirando o excesso de líquido com muito cuidado da parte superior à parte inferior do slide sem tocar a superfície do slide. Analise o slide em um scanner leitor de microarray.
3. exposição do Microarray para hospedar o soro
Atenção: Execute esta etapa em condições de segurança do laboratório, nível de biossegurança 2 (BSL-2) devido à natureza infecciosa potencial das amostras de soro. Trabalhar dentro de uma classe II de segurança biológica (CSB).
- Inativar a amostra de soro a 56 ° C por 30 min e centrifugar rcf 16.000 por 5 min a 4 ° C13.
Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (coloração, tampão-padrão e soro diluído) no canto da câmara de microarray. - Dilua a amostra de soro em coloração buffer, começando com uma diluição de (volume total de 2.000 μL/microarray) 1:1,000. Mantê-lo em 4 ° C até o uso.
- Incube o microarray com buffer de coloração (volume total de 2.000 μL/microarray) por 15 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.
- Remova o buffer de coloração por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Incube o microarray com a amostra de soro diluído durante a noite a 4 ° C, em um agitador orbital a 140 rpm.
- Retire a amostra de soro diluído por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 μL/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
4. coloração com anticorpos secundários e anticorpos controle rotulada
Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (buffers padrão, secundário diluído e anticorpos rótulo) no canto da câmara de microarray.
- Dilua o anticorpo secundário no buffer de coloração.
Nota: O fluorocromo de IgM anti-humano uso conjugado anticorpo ou anticorpo conjugado anti-humano IgG fluorocromo a uma diluição de 1:5,000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) no buffer de coloração. - Anticorpo de rótulo de controle de mistura (anticorpo monoclonal anti-HA conjugados a fluorocromo) a uma diluição de 1:1,000 (volume total de 2 000 µ l/microarray) na coloração de tampão com anticorpo secundário previamente diluído em tampão de coloração.
- Incube com o microarray por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital a 140 rpm.
- Retire a mistura de secundário diluído e anticorpos rótulo por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
- Lave 3x com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray). Cada lavagem é por 1 min em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
5. Microarray digitalização
- Mergulhe a lâmina 2 x em buffer mergulhando recentemente preparada (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).
- Seque o microarray cuidadosamente, em torno de 1 min, aspirando cuidadosamente do topo para o fundo do slide sem tocar a superfície do slide.
- Digitalize o microarray, seguindo as instruções do scanner. Coloque o slide para o scanner com a superfície impressa voltada para cima.
- Crie um novo projeto e selecione a área de digitalização. Definir os parâmetros do scanner como: resolução: 21 µm, intensidade para canais de 700 e 800 nm: 7.0, qualidade de digitalização: médio e deslocamento: 0.8.
- Adquirir e salve a imagem raw de varredura como um formato de arquivo TIFF em tons de cinza de 16 bits.
6. Microarray Analysis usando um Software específico
- Abra a imagem raw (imagem TIFF). Abra o arquivo de grade do matriz.
- Alinhe a grade de matriz para a varredura de imagem com as teclas de seta do mouse ou o teclado do computador.
- Selecione "Quantificar seleção" no software específico, que cria um arquivo de leitura que contém a intensidade do sinal para cada local, o valor de plano de fundo e a correspondente sequência de peptídeo.
Nota: Este arquivo de saída também pode ser importado para um programa de planilha para análise adicional e gráficos.
7. Microarray armazenamento
- Armazene o microarray selado no escuro a 4 ° C, sob livre gás nitrogênio ou argônio oxigênio.
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Representative Results
Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amostra de soro de hospedeiro (Figura 2). Deteção de igG (sinal de fluorescência vermelha) revelou apenas alguns peptídeos (Figura 2).
O software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray analisa o microarray após a digitalização. O arquivo de leitura criado contém a intensidade do sinal para cada local, o valor de plano de fundo e a correspondente sequência de peptídeo. As intensidades de fluorescência local de cada peptídeo com uma forte resposta de IgM foram visualizadas plotando os valores medianos de primeiro plano verde obtidos após subtraindo-se o plano de fundo do valor bruto (Figura 3).
Figura 1: Esquema mostrando o processo de análise para o Microarray high-density do Peptide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Peptídeo Microarray imagens digitalizadas. Imagens de fluorescência cru de manchar o peptídeo microarray após incubação com um soro ZIKV amostra diluída 1: 250. A reatividade da IgG é retratada em vermelho (à esquerda), e a reatividade de IgM é mostrada em verde (direita). HA de peptídeos de controle quadro o peptídeo microarray. Painéis de zoom mostram um grupo de péptidos com intensidades de fluorescência de alta, indicando uma forte resposta de IgM ou IgG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante Zika vírus Epitope consenso sequência reagindo com IgM em amostra de soro a Host. Valores medianos de primeiro plano verde de sobreposição peptídeos foram plotados em um gráfico. Peptídeos da sequência de consenso de epítopo são destacados em vermelho. O peptídeo com a maior intensidade de fluorescência é marcado em negrito. Vector baseado software foi usado para gerar este valor de design gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso com sobreposições mais tempo. Cada peptídeo foi impresso em duplicado para aumentar a confiabilidade.
É essencial para iniciar o processo com pre-manchando o microarray com anticorpo secundário para detectar interações possíveis antecedentes e diferenciá-los do sinal específico da amostra. Usar um tampão específico de bloqueio também é importante como outros buffers de bloqueio como pó de soro Albumina bovina (BSA) ou leite em pó pode resultar em intensidade de sinal reduzido. Uma amostra de soro validado para anticorpos IgM ZIKV primeiro foi incubada com o microarray em 1:1,000, mas nenhum sinal foi detectado. Posterior incubação numa menor diluição de 1: 500 resultou em um sinal de baixa intensidade, provenientes de peptídeos que reagiram com anticorpos de IgM na amostra. Os melhores resultados foram obtidos quando a amostra de soro validado Zika foi diluída a 1: 250. Nós não teste novamente a amostra de soro em uma concentração mais elevada para evitar um aumento do sinal de fundo. Cuidado com o microarray é essencial para evitar riscar a superfície de microarray. Portanto, as soluções de tal que nos diluído buffer padrão e o soro são adicionados ao e removidos do canto da câmara de microarray. Também, a bandeja de incubação específicas de slide fornecida pela empresa que fabricava o microarray, que é projetado para permitir trabalhar com volumes de amostra mínima é importante para um resultado bem sucedido. As dimensões da bandeja de incubação são 13,0 cm por 9,0 cm e 3 cm de espessura. Existem 3 slides designados cavidades na bandeja de incubação que permitem a análise do 3 lâminas diferentes simultaneamente. No entanto, neste experimento, usamos apenas 1 slide. Corrediças do microscópio em branco foram colocadas nas outras duas cavidades para equilibrar a bandeja e evitar a quebra do slide matriz. A bandeja de incubação consiste em 4 partes: uma placa de base, onde os slides são colocados em cavidades designadas; um aferidor composto de silício para separar cada slide dos outros; uma parte superior que contém parafusos para juntar o cimento com a placa de base e criar câmaras de microarray para adição de soluções para o ensaio como amostra de soro ou tampão de lavagem. O selador e parte superior evitam contaminação ou mistura de soluções entre os slides. O último componente da seção é uma tampa para minimizar o risco de evaporação ou contaminação ambiental de amostras. Um agitador orbital é preferido para obter ideal molhar e manchar as condições.
Dependendo de quando o vírus infectou o host a resultante específico Zika IgM concentração de anticorpos no soro pode ser alta ou baixa. Portanto, prevê-se que usar uma amostra de soro com uma maior concentração de IgM aumentaria a intensidade do sinal de fluorescência relativo. Após a detecção de IgM, a mesma amostra de soro foi incubada a uma diluição de 1: 250 com o microarray, mas um IgG anti-humano foi usado como o anticorpo secundário. Alternativamente, classes diferentes de anticorpo podem ser detectadas simultaneamente dentro do mesmo microarray usando uma mistura de anticorpos secundarios conjugado a cada um com fluorescência diferentes corantes. A mesma microarray pode ser manchado novamente com uma amostra de soro mais concentrada se a intensidade do sinal é baixa. Se armazenado corretamente o microarray é estável por vários meses e possivelmente pode ser usado novamente.
Quantificação de intensidades local e anotações de peptídeo foi realizada usando software proprietário da empresa que fabricava o microarray que também fornece um arquivo de "PSF" com o modelo do formato de matriz. O arquivo do psf é essencialmente uma grade alinhada à imagem crua scanner usando o software proprietário. Um algoritmo de software analisa as intensidades de fluorescência relativo de cada ponto em bruto (valor da intensidade do sinal do local), (valor estimado do sinal causado por ligação não específica) e fundo (subtraído ao fundo da matéria-prima sinal de valor). Ele também calcula os valores medianos de primeiro plano e mediana de primeiro plano agregado, correspondente à média dos dois valores ponto medianos de cada peptídeo em duplicado. Além disso, o software identifica o consenso motivos/epítopo dentro sobreposição peptídeos. Alternativamente, as intensidades de sinal podem ser quantificadas com o software do scanner microarray e em seguida, usando o modelo do formato de matriz, a sequência do peptídeo pode ser identificada.
Na sequência deste protocolo, vários candidatos promissores de peptídeo foram identificados com base na intensidade da fluorescência. Análise de14 subsequente explosão foi usado para identificar resíduos com reactividade cruzada com outros flavivirus. Um total de 14 peptídeos identificados estão presentes somente em ZIKV, conforme identificado em 3 bancos de dados do proteoma. Está planeada uma segunda série de microarrays que conterá os peptídeos selecionados da primeira matriz. Isto permitirá testar vários espécimes validados, bem como amostras de pessoas infectadas apenas com flavivirus além ZIKV para confirmar a especificidade. Para a seleção, nos adaptaremos um formato de ensaio de ELISA, revestindo as placas com os peptídeos selecionados e teste a ligação de anticorpos específicos contra o ZIKV em amostras de soro e saliva humanas.
Manipulação de ZIKV requer que trabalham em instalações de nível de biossegurança 2 (BSL-2)15. Como nós trabalhamos com uma soro amostra validado para infecção ZIKV que trabalhamos em BSL-2 instalação executar toda a manipulação da amostra dentro de uma classe II (ou superior) de segurança biológica (CSB). Eis porque nós inativado o vírus aquecimento a amostra de soro a 56 ° C durante 30 min antes de incubar a amostra com o microarray13. Após a desactivação do calor, recomenda-se também continuar a trabalhar em uma facilidade BSL-2 com prática de segurança do laboratório adequado para evitar a chance de infecção.
O microarray que desenhamos contém apenas peptídeos lineares e epítopos conformacionais consequentemente que podem ser valiosos como diagnóstico pode ter sido perdido. Esta limitação pode ser resolvida usando uma alta densidade de microarray contendo peptídeos restritos cíclicos que imitam o epítopo em loop estruturas16. Este protocolo rapidamente pode ser adaptado para outros patógenos, porque uma vez que a sequência de proteínas é conhecida um microarray novo pode ser projetado para descoberta de peptídeos diagnósticos potenciais. Também pode ser adaptado para outras aplicações tais como biomarcador descoberta17, detecção do antígeno e epítopo para desenvolvimento de vacinas ou alvos terapêuticos18,19.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
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