Summary
I denne protokol beskriver vi en teknik til at opdage Zika virus specifikke diagnostiske peptider ved hjælp af en high-density peptid microarray. Denne protokol kan readly tilpasses til andre smitsomme sygdomme.
Abstract
High-density peptid microarrays tillade screening af mere end seks tusinde peptider på en enkelt standard mikroskopi dias. Denne metode kan anvendes for drug discovery, terapeutiske målet identifikation og udvikling af diagnostik. Vi præsenterer her, en protokol for at opdage specifikke Zika virus (ZIKV) diagnostiske peptider ved hjælp af en high-density peptid microarray. En human serum prøve valideret for ZIKV infektion var inkuberes med en high-density peptid microarray indeholdende den hele ZIKV protein oversat til 3,423 unikke 15 lineær aminosyre (aa) restprodukter med en 14-aa rester overlapning udskrevet i to eksemplarer. Farvning med forskellige sekundære antistoffer i samme array, opdaget vi peptider, der binder til Immunoglobulin M (IgM) og Immunoglobulin G (IgG) antistoffer i serum. Disse peptider blev udvalgt til yderligere validering eksperimenter. I denne protokol, vi beskriver den strategi, der følges for at designe, behandle og analysere en high-density peptid microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnose baseret på kliniske symptomer udfordrende, fordi den deler vektorer, geografiske fordeling og symptomer med denguefeber og Chikungunya-virus infektion1. I betragtning af risikoen for utilsigtede graviditet resultater i kvinder smittet med ZIKV under graviditet, er det vigtigt at skelne mellem de 3 vira. Selv om de nuværende Molekylær diagnostisk test er specifikke, er de kun nyttig i blod eller spyt i den relativt korte periode af akut infektion2,3. Serologiske analyser er afgørende for diagnosen uden for denne indledende periode af infektion4.
Udvikling af en specifik serologisk analyse ZIKV er udfordrende for to grunde: først, de Zika antigener, som det menneskelige immunsystem reagerer på i øjeblikket kendes ikke; og andet, bevares flavivira aminosyresekvenser inducerer antistof krydsreaktivitet. Vores mål var at opdage unikke ZIKV bestemte peptider anvendes i diagnostik. Forskellige metoder er blevet udviklet til skærmen peptid biblioteker dækker hele proteiner herunder phage, bakteriel, og gær overflade vise5,6,7,8,9, 10. Vores strategi var at bruge en high-density peptid microarray, der tillader hurtig og billig høj overførselshastighed serologisk screeninger11,12 og efterfølgende de identificerede peptider kan bruges til at forbedre nuværende serologiske assays til påvisning af ZIKV infektion.
Denne protokol giver mulighed for opdagelsen af Zika virus specifikke diagnostiske peptider ved hjælp af en high-density peptid microarray (figur 1). High-density peptid microarray blev produceret ved hjælp af peptid laser trykning teknologi. Hele ZIKV protein sekvens bestående af 3,423 aminosyrerester baseret på den franske polynesiske stamme (GenBank: KJ776791.2), blev trykt på et standard glas dias i blokke af 15 lineær restprodukter med et overlap på 14 aminosyrerester i to eksemplarer til en i alt 6,846 peptid steder. Ud over de hele Zika protein sekvens peptider, udnytter microarray Influenza hemagglutinin (HA) peptider for interne kontroller.
En Zika valideret positivt serum prøve fremstillet af Wadsworth Center (Albany, NY), blev brugt til at identificere specifikke Immunoglobulin M (IgM) og Immunoglobulin G (IgG) reaktive peptider. Efter inkubering med prøven natten over, var microarray farves med en sekundær fluorokrom konjugeret antistof (antihumant IgM eller -anti-human IgG), og analyseret på en microarray scanner. Kvantificering af spot Støtteintensiteter og peptid anmærkning blev udført med en specifik software leveret af samme selskab, der fremstilles af microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse data er en del af en igangværende forskningsundersøgelse foretaget på New York University College of Dentistry og blev godkendt af det institutionelle Review Board på New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Kliniske prøver, der indgår i denne undersøgelse blev de identificerede prøver tidligere anvendt til diagnosticering og med tilladelse fra Wadsworth Center i New York State Department af sundhed, Albany, NY.
1. installation ZIKV High-density peptid Microarray glide i en bestemt inkubation bakke
- Håndtere glas dias ved kanterne med pudderfrie handsker. Glas dias dimensioner er 75.4 mm 25,0 mm og 1 mm tyk. Placer diaset i bakken inkubation med microarray overflade vender opad.
- Placer den blanke side af seal vender nedad mod microarray udskrevne overflade. For at sikre en god position, overlap de skruehuller i forseglingen og bundpladen.
- Placer den øverste del af bakken på sæl at oprette et microarray kammer.
- Sikre dias i skuffen ved at stramme lige så fingerskruerne efter hinanden i hånden med en skiftende mønster begynder fra øverst til venstre efterfulgt af nederst til højre. Låget lægges på bakken inkubation.
2. baggrund interaktion Detection: Farvning Microarray med sekundære antistoffer
Bemærk: Brug en pipette indbetaling løsninger (standard og blokerende buffere, fortyndede sekundære antistoffer) i hjørnet af microarray kammer.
- Inkuber microarray med en standard buffer (1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,4, filtreret med et 0,45 µm filter) (samlet volumen af 2.000 µL/microarray) i 15 min. ved stuetemperatur (RT) på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjerne den standard buffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer. Fyld tomme slide indehavere med tomme dias til at forhindre bruddet på microarray dias.
- Blokere microarray med blokerende buffer (samlede volumen af 2.000 µL/microarray) for 60 min. ved RT på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjerne den blokerende buffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Inkuber microarray med sekundær antistof, antihumant IgM fluorokrom konjugeret, fortyndet 1: 5.000 (samlede volumen af 2.000 µL/microarray) i farvning buffer (10% blokerende buffer i standard buffer) for 30 min. ved RT i mørke på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjerne den sekundær antistof ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Vaske microarray 3 x, 1 min. pr. vask med standard buffer (samlede volumen af 2.000 µL/microarray på RT på en orbitalryster på 140 rpm. Efter hver vask, skal du fjerne den standard buffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Fordyb dias 2 x i en frisklavet dypper buffer (1 mM Tris, pH 7,4), (samlet volumen af 200 mL).
- Tør microarray omhyggeligt, for ca. 1 min., ved sugning overskydende væske meget omhyggeligt fra toppen til bunden af diaset uden at røre dias overflade. Analysere dias i et microarray scanner læser.
3. eksponering af Microarray vært Serum
Forsigtig: Udføre dette trin under laboratorieforhold sikkerhed biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) på grund af serumprøver potentielle smitsomme natur. Arbejde inden for en klasse II biologiske sikkerhed kabinet (BSC).
- Inaktivere serumprøven ved 56 ° C i 30 min og centrifuger på 16.000 genbrugsfibre i 5 min. ved 4 ° C13.
Bemærk: Brug en pipette indbetaling løsninger (farvning, standard buffer og fortyndede serum) i hjørnet af microarray kammer. - Fortynd serumprøven i farvning buffer starter med en 1:1,000 (samlede volumen af 2.000 μL/microarray) fortynding. Holde det ved 4 ° C indtil brug.
- Inkuber microarray med farvnings-bufferen (samlede volumen af 2.000 μL/microarray) i 15 min. ved RT på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjern farvnings-bufferen ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Inkuber microarray med den fortyndede serum prøve natten over ved 4 ° C på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjerne den fortyndede serum prøve ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Vaske microarray 3 x, 1 min. pr. vask med standard buffer (samlede volumen af 2.000 μL/microarray på RT på en orbitalryster på 140 rpm. Efter hver vask, skal du fjerne den standard buffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
4. farvning med sekundære antistoffer og mærket kontrol antistoffer
Bemærk: Brug en pipette indbetaling løsninger (standard buffere, fortyndede sekundære og etiket antistoffer) i hjørnet af microarray kammer.
- Fortynd den sekundær antistof i bufferen til farvning.
Bemærk: Brug antihumant IgM fluorokrom konjugeret antistof eller -anti-humant IgG fluorokrom konjugeret antistof på en fortynding af 1:5,000 (samlede volumen af 2.000 µL/microarray) i farvning buffer. - Mix control etiket antistof (monoklonale anti-HA fluorokrom konjugeret) i en fortynding af 1:1,000 (samlede volumen af 2 000 µL/microarray) i farvning buffer med sekundær antistof tidligere fortyndet i farvning buffer.
- Inkuber med microarray for 30 min på RT i mørke på en orbitalryster på 140 rpm.
- Fjerne blandingen af fortyndede sekundære og etiket antistoffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
- Vask 3 x med standard buffer (samlede volumen af 2.000 µL/microarray). Hver vask er for 1 min på en orbitalryster på 140 rpm. Efter hver vask, skal du fjerne den standard buffer ved sugning med en pipette fra hjørnet af microarray kammer.
5. Microarray Scanning
- Fordyb dias 2 x til frisklavet dypper buffer (1 mM Tris, pH 7,4) (samlede volumen af 200 mL).
- Tør microarray omhyggeligt, ca 1 min, af sugning meget omhyggeligt fra toppen til bunden af diaset uden at røre dias overflade.
- Skan microarray ifølge vejledningen i scanneren. Placer diasset på scanneren med den udskrevne overflade vender opad.
- Opret et nyt projekt og vælg scanningsområdet. Indstille scanneren parametre som: opløsning: 21 µm, intensitet for både 700 og 800 nm kanaler: 7,0, Scanning kvalitet: medium og Offset: 0,8.
- Erhverve og gemme scan raw-billede som en 16-bit gråtoneskala TIFF-filformat.
6. Microarray analyse ved hjælp af en specifik Software
- Åbne raw-billede (TIFF-billede). Åbn filen matrix gitter.
- Justere gitteret array til at scanne billedet med computerens mus eller tastatur piletasterne.
- Vælg "Kvantificere Selection" i den specifikke software, hvilket skaber en udlæsning fil, der indeholder signal intensiteten af hver plet, baggrund værdi og den tilsvarende peptid sekvens.
Bemærk: Denne outputfilen kan også importeres til et regnearksprogram for yderligere analyse og graftegning.
7. Microarray opbevaring
- Gemme microarray forseglet i mørke ved 4 ° C under ilt frie nitrogen eller argon gas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne ved hjælp af protokollen beskrevet er vist i figur 2 og figur 3. Ingen baggrund interaktioner blev konstateret når pre farvning microarray med sekundære antihumant IgM (data ikke vist). Farvning med en anti-menneskelige IgM resulterede konjugat i flere områder over baggrunden grønne fluorescens intensiteter, der angiver bindingen af disse peptider med IgM i serumprøven vært (figur 2). IgG påvisning (rød fluorescens signal) afslørede kun et par peptider (figur 2).
Den specifikke software leveret af samme selskab, der fremstilles af microarray analyserer microarray efter scanning. Udlæsning fil oprettet indeholder signal intensiteten af hver plet, baggrund værdi og den tilsvarende peptid sekvens. Spot fluorescens-intensiteten af hver peptid med en stærk reaktion på IgM blev visualiseret ved at plotte de grønne forgrund median værdier opnået efter fratrække baggrund fra den rå værdi (figur 3).
Figur 1: Skematisk viser analyse proces for High-density peptid Microarray. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Peptid Microarray scannede billeder. Rå fluorescens billeder af farvning peptid microarray efter inkubering med en ZIKV serum prøve fortyndet 1:250. IgG reaktivitet er afbildet med rødt (venstre), og IgM reaktivitet er vist i grøn (tilhøjre). HA ramme kontrol peptider peptid microarray. Zoom paneler Vis gruppe af peptider med høj fluorescens intensiteter, der angiver en stærk reaktion på IgM eller IgG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentant Zika Virus epitop konsensus sekvens reagerer med IgM i serumprøven vært. Grøn forgrunden median værdier fra overlappende peptider blev afbildet på en graf. Peptider fra epitop konsensus sekvens er fremhævet med rødt. Peptid med den højeste fluorescens-intensiteten er markeret med fed skrift. Vektor baseret grafisk design software blev brugt til at generere denne figur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet en protokol, der udnytter en high-density peptid microarray indeholdende hele Zika virus protein sekvens (franske polynesiske stamme). Microarray blev fremstillet af udskrivning 3,423 forskellige overlappende lineær peptider. Hver peptid blev 15 aminosyrer og varieret ved kun en rest fra nærmeste nabo i rækkefølge (dvs., 14 rester overlapning). Selv om kortere overlapninger kan printes, er epitop kortlægning mere præcise med længere overlapninger. Hver peptid blev trykt i to eksemplarer til at øge pålideligheden.
Det er vigtigt at starte processen med pre farvning microarray med den sekundære antistof til at opdage mulige baggrund interaktioner og differentiere dem fra prøven specifikke signal. Ved hjælp af en specifik blokerende buffer er også vigtigt som andre blokerende buffere som bovint serumalbumin (BSA) eller tørmælk pulver kan resultere i reduceret signal intensitet. En valideret serumprøven for ZIKV IgM antistoffer var først inkuberet med microarray på 1:1,000 men intet signal blev opdaget. Efterfølgende inkubation ved en lavere fortynding på 1: 500 resulterede i en lav intensitet signal kommer fra peptider, der reagerede med IgM antistoffer i prøven. De bedste resultater blev opnået når Zika validerede serumprøven blev fortyndet på 1:250. Vi ikke retest serumprøven ved en højere koncentration at undgå en stigning i baggrunden signal. Omhyggelig håndtering af microarray er afgørende for at undgå at ridse microarray overflade. Derfor, de løsninger sådan os fortyndede serum og standard buffer er tilføjet og fjernet fra hjørnet af microarray kammer. Slide specifikke inkubation bakke, den virksomhed, der fremstillede microarray, som er designet til at tillade arbejde med minimal prøve diskenheder er også vigtig for et vellykket resultat. Inkubation bakke dimensioner er 13.0 cm af 9,0 cm og 3 cm tyk. Der er 3 dias udpeget hulrum i bakken inkubation, der giver mulighed for materialeprøvning 3 forskellige dias samtidigt. Dog i dette eksperiment brugte vi kun 1 dias. Tom objektglas var placeret i de andre to hulrum til balance bakken og forhindre bruddet på diasset array. Inkubation bakke består af 4 dele: en bundplade, hvor dias er placeret i udpegede hulrum; en sealer, der består af silicium til at adskille hvert dias fra de andre; en øvre del, der indeholder fingerskruerne for at deltage sealer med bundpladen og oprette microarray kamre for at tilføje løsninger for analyse såsom vask buffer eller serum prøve. Sealer og øverste del undgå kontaminering eller sammenblanding af løsninger mellem dias. Komponenten sidste afsnit er en låg til at minimere risikoen for fordampning eller miljøforurening af prøver. En orbitalryster er foretrukket at få optimal befugtning og farvning betingelser.
Afhængigt af Hvornår virussen inficerede vært den resulterende specifikke Zika IgM kan antistof koncentration i sera være høj eller lav. Derfor var det forventet at bruge en serum prøve med en højere IgM koncentration ville øge relative fluorescens signal intensitet. Efter påvisning af IgM, samme serumprøven blev inkuberet ved en fortynding af 1:250 med microarray, men en-anti-humant IgG blev brugt som den sekundære antistof. Alternativt kan forskellige antistof klasser påvises samtidig inden for den samme microarray ved hjælp af en blanding af sekundær antistoffer hver konjugeret med forskellige fluorescens farvestoffer. Den samme microarray kan farves igen med en mere koncentreret serum prøve, hvis signal intensiteten er lav. Hvis gemt korrekt microarray er stabil i flere måneder og kan eventuelt bruges igen.
Kvantificering af spot Støtteintensiteter og peptid anmærkninger blev udført ved hjælp af leverandørejet software fra selskabet, der fremstilles af microarray, der også giver en ".psf" fil med skabelonen af array format. Filen psf er hovedsagelig et gitter, der er justeret til rå scanner billedet ved hjælp af leverandørejet software. En software algoritme analyserer relative fluorescens intensiteter af hver plet i raw (intensitetsværdien spot's signal), baggrund (anslået værdi af signalet forårsaget af ikke-specifik binding) og forgrunden (trækkes baggrund fra den rå værdi) signal. Det beregner også forgrunden median værdier og samlede forgrunden median svarende til gennemsnittet af de to median spot værdier for hver peptid i to eksemplarer. Desuden identificerer softwaren konsensus motiver/epitop inden for overlappende peptider. Alternativt, signal intensiteter kan kvantificeres med microarray scannersoftware og derefter bruge skabelonen af array format, peptid sekvens kan identificeres.
Efter denne protokol identificeret flere lovende peptid kandidater baseret på fluorescens-intensiteten. Efterfølgende BLAST14 analyse blev anvendt til at identificere restkoncentrationer med potentielle krydsreaktivitet til andre flavivirus. Ialt 14 identificerede peptider findes kun i ZIKV som er identificeret i 3 proteomet databaser. En anden serie af microarrays er planlagt, vil indeholde de valgte peptider fra den første array. Dette vil give mulighed for afprøvning flere validerede prøver samt prøver fra mennesker smittet kun med flavivirus end ZIKV for at bekræfte specificiteten. Til screening, vil vi tilpasse en ELISA assay format, belægning plader med de valgte peptider og test binding til ZIKV specifikke antistoffer i human serum og spyt prøver.
ZIKV håndtering kræver arbejder i biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) facilitet15. Da vi arbejdede med en serum prøve validerede for ZIKV infektion vi arbejdede i BSL-2 anlæg udfører alle prøve manipulation i en klasse II (eller højere) biologisk sikkerhed kabinet (BSC). Det er derfor vi inaktiveret virus varme serumprøven ved 56 ° C i 30 min før inkubere prøve med microarray13. Efter varme inaktivering, anbefales det også fortsætte med at arbejde i et BSL-2 anlæg med passende god laboratoriepraksis med sikkerhed at undgå risikoen for smitte.
Microarray, vi designet indeholder kun lineær peptider og som følge heraf konformationelle epitoper, der kan være værdifuld som diagnostik kan have været overset. Denne begrænsning kan løses ved hjælp af en high-density microarray indeholdende cyklisk begrænsede peptider, der efterligner loopes epitop strukturer16. Denne protokol kan hurtigt tilpasses til andre patogener fordi når protein sekvens kendes en ny microarray kan være konstrueret til opdagelsen af potentielle diagnostiske peptider. Det kan også tilpasses til andre applikationer såsom biomarkør discovery17, antigen og epitop opdagelse for vaccine udvikling eller terapeutiske mål18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Nuværende støtte fra en SBIR (Small Business Innovation Research) administrative supplement tilskud fra NIDCRR44 DE024456. NIDCR HIV grant, udviklet sig ud af NIDCR grant U01 DE017855 for udviklingen af en bekræftende punkt af pleje diagnostiske for HIV. Vi parlamentsarbejdet Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) for hendes teknisk bistand og venlige støtte. Vi takker også NYU Langone Medical Center for LI-COR Odyssey Imaging systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
