Summary
In dit protocol beschrijven we een techniek om te ontdekken Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Dit protocol kan readly worden aangepast voor andere opkomende infectieziekten.
Abstract
High-density peptide microarrays toestaan screening van meer dan zesduizend peptiden op een uniforme standaard microscopie dia. Deze methode kan worden toegepast voor drugontdekking therapeutische target identificatie en ontwikkeling van diagnostiek. Hier presenteren we een protocol om te ontdekken van specifieke Zika virus (ZIKV) diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Een menselijke serummonster gevalideerd voor ZIKV infectie was geïncubeerd met een hoge dichtheid peptide microarray die hele ZIKV eiwit vertaald in 3,423 unieke 15 lineaire aminozuurresidu (aa) 's met een overlapping van 14-aa residuen bevatten afgedrukt in tweevoud. Kleuring met verschillende secundaire antilichamen binnen dezelfde array, we gedetecteerd peptiden die zich aan immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) antilichamen in het serum aanwezig binden. Deze peptiden werden geselecteerd voor verdere validatie experimenten. In dit protocol beschrijven we de strategie gevolgd om te ontwerpen, verwerken en analyseren van een high-density peptide microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnose op basis van klinische symptomen is uitdagend omdat het deelt vectoren, geografische spreiding en symptomen met Dengue en Chikungunya virus infectie1. Gezien het risico voor ongewenste zwangerschap resultaten bij vrouwen geïnfecteerd met ZIKV tijdens de zwangerschap, is het belangrijk om te onderscheiden tussen de 3 virussen. Hoewel de huidige moleculaire diagnostische tests specifiek zijn, zijn ze alleen nuttig in bloed of speeksel in de relatief korte periode van acute infectie2,3. Serologische tests zijn essentieel voor de diagnose buiten deze beginperiode van infectie4.
De ontwikkeling van een specifieke serologische test ZIKV is een uitdaging om twee redenen: ten eerste de Zika-antigenen die het menselijke immuunsysteem reageert op niet op dit moment bekend zijn; en tweede, geconserveerde flavivirussen aminozuur sequenties veroorzaken antilichaam Kruisallergie. Ons doel was om te ontdekken unieke ZIKV specifieke peptiden in diagnostiek worden gebruikt. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om scherm peptide bibliotheken die betrekking hebben op hele eiwitten met inbegrip van phage, bacteriële, en gist oppervlak weer5,6,7,8,9, 10. Onze strategie was het gebruik van een hoge dichtheid peptide microarray waarmee snelle en goedkope high-throughput serologische screenings11,12 en nadien de geïdentificeerde peptiden kunnen worden gebruikt ter verbetering van de huidige serologische tests voor de opsporing van ZIKV infectie.
Dit protocol maakt de ontdekking van Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray (Figuur 1). De high-density peptide microarray werd geproduceerd met behulp van de peptide laser printing technologie. De gehele ZIKV eiwit reeks bestaande uit 3,423 aminozuurresidu's op basis van de Frans Polynesische stam (GenBank: KJ776791.2), werd gedrukt op een standaard glasplaatje in blokken van 15 lineaire residuen met een overlapping van 14 aminozuurresidu's in tweevoud voor een totaal 6,846 peptide vlekken. Naast de gehele Zika eiwit sequentie peptides, de microarray maakt gebruik van Influenza hemagglutinine (HA) peptiden voor interne controle.
Een Zika gevalideerd positieve serummonster verkregen Wadsworth Center (Albany, NY), werd gebruikt voor het identificeren van specifieke immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) reactieve peptiden. Na incubatie met het monster 's nachts, was de microarray gekleurd met een secundaire fluorescerende geconjugeerd antilichaam (Anti-menselijke IgM of anti-menselijke IgG) en geanalyseerd op een microarray scanner. Kwantificering van plek intensiteiten en peptide aantekening werd uitgevoerd met een specifieke software geboden door hetzelfde bedrijf dat de microarray vervaardigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze gegevens zijn een onderdeel van een lopend onderzoek studie, uitgevoerd aan de New York University College voor tandheelkunde en goedgekeurd door de institutionele Review Board van de New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Klinische monsters gebruikt in deze studie werden de geïdentificeerde monsters eerder gebruikt voor diagnose en met toestemming van de Wadsworth Center van New York State Department van gezondheid, Albany, NY.
1. het installeren de ZIKV High-density Peptide Microarray Slide in een specifieke incubatie-lade
- Omgaan met het glasplaatje door de randen met poederloze handschoenen. De afmetingen van de dia glas zijn 75.4 mm door 25.0 mm en 1 mm dik. Plaats de dia in het incubatie-lade met het microarray oppervlak naar boven.
- Plaats de glanzende zijde van het zegel beneden zijn gericht op het bedrukte oppervlak van microarray. Om een goede positie, overlappen de schroefgaten van het zegel en de grondplaat.
- Plaats het bovenste gedeelte van de lade naar het zegel te maken een microarray kamer.
- Het beveiligen van de dia in de lade door aanscherping even de duimschroeven achter elkaar met de hand in een afwisselend patroon vanaf de linkerbovenhoek gevolgd door rechtsonder. Plaats het deksel van de incubatie-lade.
2. achtergrond interactie detectie: Kleuring de Microarray met secundaire antilichamen
Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard en blokkerende buffers, verdunde secundaire antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.
- Incubeer de microarray met een standaard buffer (1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7.4, gefilterd met een 0,45 µm filter) (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
- Verwijder de standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray. Vul lege dia houders met lege dia's om te voorkomen dat het breken van de dia van microarray.
- Blokkeren de microarray met de buffer met blokkerend (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 60 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
- Verwijder de buffer met blokkerend door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- Incubeer de microarray met secundair antilichaam, Anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd, verdunde 1:5000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in de kleuring buffer (10% blokkeerbuffer in standaard buffer) gedurende 30 min. bij RT in het donker op een roteerschudapparaat op 140 rpm.
- Het secundaire antilichaam verwijderen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- Dompel de dia 2 x in een vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4), (totaal volume van 200 mL).
- Droog de microarray zorgvuldig, voor ongeveer 1 min., door het zuigen overtollige vocht zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak. Het analyseren van de dia in een microarray scanner lezer.
3. blootstelling van de Microarray voor het hosten van Serum
Let op: Deze stap onder laboratoriumomstandigheden veiligheid, Biosafety Level 2 (BSL-2) vanwege de potentiële besmettelijke aard van de serum-exemplaren uitvoeren. Werken binnen een klasse II biologische veiligheidskast (BSC).
- Inactivering van serummonster bij 56 ° C gedurende 30 minuten en centrifuge op 16.000 rcf gedurende 5 minuten bij 4 ° C13.
Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (kleuring, standaard buffer en verdund serum) in de hoek van de kamer van microarray. - Verdun serummonster in kleuring buffer beginnen bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray). Houd het bij 4 ° C tot gebruik.
- Incubeer de microarray met de kleuring buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray) gedurende 15 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
- Verwijder de kleuring buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- Incubeer de microarray met de verdunde serummonster 's nachts bij 4 ° C op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
- Verwijder het verdunde serummonster door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
4. vlekken met secundaire antilichamen en gelabelde controle antilichamen
Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard buffers, verdunde middelbare en label antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.
- Verdun het secundaire antilichaam in de kleuring buffer.
Opmerking: Gebruik anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd antilichaam of anti-menselijke IgG fluorescerende geconjugeerd antilichaam bij een verdunning 1:5,000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in kleuring buffer. - Mix besturingselement label antilichaam (monoklonaal anti-HA fluorescerende geconjugeerd) bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2 000 µL/microarray) in buffer met secundair antilichaam eerder verdund in buffer kleuring vlekken.
- Incubeer met de microarray gedurende 30 min. op RT in het donker op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
- Verwijder de mix van verdunde middelbare en label antilichamen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
- 3 x met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) wassen. Elke wasbeurt is voor 1 min op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
5. Microarray scannen
- Dompel de dia 2 x in vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4) (totaal volume van 200 mL).
- Droog de microarray zorgvuldig, ongeveer 1 min., door zuigen zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak.
- Scan de microarray volgens de instructies van de scanner. Plaats de dia op de scanner met het bedrukte oppervlak naar boven.
- Maak een nieuw project en selecteer het scangebied. Scanner parameters als instellen: resolutie: 21 µm, intensiteit voor zowel 700 en 800 nm kanalen: 7.0, scannen kwaliteit: medium en Offset: 0.8.
- Verwerven en sla de scan onbewerkte afbeelding als een 16-bits grayscale TIFF bestandsformaat.
6. Microarray analyse met behulp van een specifieke Software
- Open de onbewerkte afbeelding (TIFF-afbeelding). Open het bestand van de grid array.
- Het raster van de array naar de scannen afbeelding uitlijnen met de pijltjestoetsen muis of het toetsenbord van de computer.
- Selecteer "Kwantificeren selectie" in de specifieke software, waardoor een uitlezing-bestand waarin de signaalsterkte voor elke vlek, de waarde van de achtergrond en de corresponderende opeenvolging van peptide.
Opmerking: Dit uitvoerbestand kan ook worden geïmporteerd naar een spreadsheetprogramma voor aanvullende analyse en grafieken.
7. Microarray opslag
- Bewaar de microarray verzegeld in het donker bij 4 ° C onder zuurstof vrij stikstof of argon gas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten verkregen met behulp van het protocol beschreven zijn afgebeeld in Figuur 2 en Figuur 3. Geen achtergrond interacties werden geconstateerd wanneer vooraf kleuring de microarray met secundaire anti-mens IgM (gegevens niet worden weergegeven). Kleuring met een anti-mens IgM resulteerde conjugaat in verschillende gebieden boven de achtergrond groene fluorescentie intensiteiten, met vermelding van de binding van deze peptides met IgM in het serummonster host (Figuur 2). IgG detectie (rode fluorescentie signaal) bleek slechts een paar peptiden (Figuur 2).
De specifieke software geboden door hetzelfde bedrijf dat de microarray vervaardigd analyseert de microarray na het scannen. De uitlezing bestand gemaakt bevat de signaalsterkte voor elke vlek, de waarde van de achtergrond en de corresponderende opeenvolging van peptide. De plek fluorescentie intensiteiten van elke peptide met een sterke reactie op IgM waren gevisualiseerd door het uitzetten van de groene voorgrond mediane waarden, verkregen na het aftrekken van de achtergrond van de ruwe waarde (Figuur 3).
Figuur 1: Schema toont het analyseproces voor de High-density Peptide Microarray. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Peptide Microarray gescande afbeeldingen. Ruwe fluorescentie beelden van de peptide microarray kleuring na incubatie met een ZIKV serum monster verdunde 1:250. De IgG-reactiviteit wordt afgebeeld in het rood (links) en de IgM-reactiviteit wordt weergegeven in het groen (rechts). HA frame controle peptiden de peptide microarray. Zoom panelen tonen groeperen van peptiden met hoge fluorescentie intensiteiten, die een sterke reactie op IgM- of IgG aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger Zika Virus Epitope Consensus volgorde reageren met IgM in het Host-serummonster. Groene voorgrond mediane waarden uit elkaar overlappende peptiden zijn uitgezet in een grafiek. Peptiden from the epitoop consensus-reeks zijn rood gemarkeerd. De peptide met de hoogste intensiteit van de fluorescentie is gemarkeerd in vet. Vector gebaseerde grafisch ontwerp software werd gebruikt voor het genereren van dit cijfer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwierpen een protocol met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray met de gehele Zika virus eiwit sequentie (Frans-Polynesische stam). De microarray werd geproduceerd door afdrukken 3,423 verschillende overlappende lineaire peptiden. Elke peptide was 15 aminozuren en gevarieerd door slechts één residu van zijn naaste buur in de reeks (d.w.z., 14 residu overlapping). Hoewel kortere overlappingen kunnen worden afgedrukt, is epitoop toewijzing nauwkeuriger met langere overlappingen. Elke peptide werd gedrukt in tweevoud om betrouwbaarheid te verhogen.
Het is essentieel om te beginnen met het proces met vooraf kleuring de microarray met het secundaire antilichaam voor het opsporen van mogelijke achtergrond interacties en ze verschillen van het monster specifieke signaal. Met behulp van een specifieke blokkeerbuffer is ook belangrijk als andere blokkerende buffers zoals boviene serumalbumine (BSA) of gedroogde melk poeder leiden verminderde signaalsterkte tot kan. Een gevalideerde serummonster voor ZIKV IgM-antistoffen werd eerst geïncubeerd met de microarray aan 1:1,000 maar geen signaal was gevonden. Latere incubatie bij een lagere verdunning 1:500 resulteerde in een lage intensiteit signaal afkomstig van peptiden die met IgM-antistoffen in het monster reageerde. De beste resultaten werden verkregen wanneer het gevalideerde serummonster Zika was verdund op 1:250. We hebben niet het serummonster op een hogere concentratie te vermijden van een toename van het signaal van de achtergrond hertest. Voorzichtige behandeling van de microarray is essentieel om te voorkomen krassen op de oppervlakte van microarray. Dus de oplossingen die dat ons verdund serum en standaard buffer worden toegevoegd aan en verwijderd uit de hoek van de kamer van microarray. Ook belangrijk voor een succesvol resultaat is de dia specifieke incubatie lade geboden door het bedrijf dat de microarray, die is ontworpen om te werken met minimal steekproef volumes toestaan vervaardigd. De incubatie lade afmetingen zijn 13.0 cm door 9,0 cm en 3 cm dik. Er zijn 3 glijbanen aangewezen Holten in de lade van de incubatie waarmee keuring 3 verschillende dia's tegelijk. Echter, in dit experiment gebruikten we slechts 1 dia. Lege Microscoop dia's werden in de andere twee holtes evenwicht van de lade te voorkomen breken van de matrix dia geplaatst. De incubatie lade bestaat uit 4 delen: een grondplaat waar de dia's worden geplaatst in de holten van het aangewezen; een sealer samengesteld uit silicium te scheiden van elke dia van de anderen; een bovenste gedeelte waarin de duimschroeven voor het toetreden tot de sealer met de grondplaat en maken de microarray kamers voor het toevoegen van oplossingen voor de assay zoals het wassen van de buffer of serum monster. De sealer en bovenstuk Vermijd besmetting of mengen van oplossingen tussen dia's. De laatste component van de sectie is een deksel om te minimaliseren van het risico van verdamping of verontreiniging van het milieu van monsters. Een roteerschudapparaat heeft de voorkeur om optimale bevochtiging en kleuring van voorwaarden.
Afhankelijk van wanneer het virus de host de resulterende specifieke Zika IgM besmet kunnen antilichamen concentratie in sera hoog of laag. Dus werd het verwacht dat het met behulp van een serummonster met een hogere concentratie van IgM de relatieve fluorescentie signaal intensiteit zou toenemen. Na de detectie van IgM, het hetzelfde serummonster was geïncubeerd bij een verdunning 1:250 met de microarray, maar een anti-menselijke IgG werd gebruikt als het secundaire antilichaam. Anderzijds kunnen verschillende antilichaam klassen tegelijk worden gedetecteerd binnen de dezelfde microarray met behulp van een mengsel van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd elk met verschillende fluorescentie kleurstoffen. De dezelfde microarray kan opnieuw worden gekleurd met een meer geconcentreerde serummonster als laag is de intensiteit van het signaal. Indien correct opgeslagen de microarray is stabiel voor verscheidene maanden en kan eventueel opnieuw worden gebruikt.
Kwantificering van plek intensiteiten en peptide aantekeningen werd uitgevoerd met behulp van propriëtaire software van het bedrijf dat de microarray die ook voorziet in een ".psf"-bestand met de sjabloon van de indeling matrix vervaardigd. De psf-bestand is in wezen een raster dat is afgestemd op de beeld van de ruwe scanner met behulp van de propriëtaire software. Een algoritme van de software analyseert de fluorescentie van de relatieve intensiteiten van elke plek in raw (de intensiteitswaarde van de dribbels signaal), (geschatte waarde van het signaal veroorzaakt door niet-specifieke binding) achtergrond en voorgrond (afgetrokken van de achtergrond van de raw waarde) signaal. Het berekent ook de voorgrond mediane waarden en statistische voorgrond mediaan overeenkomt met het gemiddelde van de twee mediaan plek waarden van elke peptide in tweevoud. Bovendien, identificeert de software consensus motieven/epitoop binnen overlappende peptiden. Als alternatief, signaal intensiteit kunnen worden gekwantificeerd met de software van microarray scanner en vervolgens met behulp van de sjabloon van het matrix-formaat, de volgorde van de peptide kan worden geïdentificeerd.
Naar aanleiding van dit protocol, werden verschillende veelbelovende kandidaten van de peptide geïdentificeerd op basis van de intensiteit van de fluorescentie. Latere BLAST14 analyse werd gebruikt om de residuen identificeren met potentiële Kruisallergie aan andere flavivirus. Een totaal van 14 geïdentificeerde peptides aanwezig alleen in ZIKV zoals aangegeven in 3 Proteoom-databases zijn. Een tweede reeks van microarrays is gepland dat de geselecteerde peptiden uit de eerste matrix zal bevatten. Hierdoor zal het testen van meerdere gevalideerde specimens, alsmede monsters van mensen die besmet zijn met flavivirus dan ZIKV alleen om te bevestigen de specificiteit. Voor screening, zullen we een indeling van de assay ELISA, aanpassen coating van de platen met de geselecteerde peptiden en testen van de binding aan specifieke antilichamen van de ZIKV in menselijk serum en speeksel monsters.
ZIKV behandeling vereist werken in Biosafety Level 2 (BSL-2) faciliteit15. Aangezien we met een serummonster gevalideerd voor ZIKV infectie werkten werkten we in BSL-2 faciliteit uitvoeren van alle het monster manipulatie binnen een klasse II (of hoger) biologische veiligheid kabinet (BSC). Dit is de reden waarom we de verwarming van het serummonster bij 56 ° C gedurende 30 minuten vóór het broeden van het monster met de microarray13virus geïnactiveerd. Na inactivering van de warmte, het is ook aanbevolen doorwerken in een faciliteit van de BSL-2 met passende goede laboratoriumpraktijken veiligheid om te voorkomen dat de kans op infectie.
De microarray die we ontworpen bevat alleen lineaire peptiden en éénduidige conformationele epitopes die mogelijk waardevol, zoals diagnostiek kan hebben gemist. Deze beperking kan worden aangepakt met behulp van een diskette met hoge dichtheid microarray met cyclische beperkte peptiden die lus epitoop na te bootsen structuren16. Dit protocol kan snel worden aangepast aan andere ziekteverwekkers, omdat zodra het eiwit sequentie is bekend een nieuwe microarray kan worden ontworpen voor de ontdekking van potentiële diagnostische peptiden. Het kan ook worden aangepast voor andere toepassingen zoals biomerker ontdekking17, antigeen en epitoop ontdekking voor de ontwikkeling van een vaccin of therapeutische doelen18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Huidige wordt ondersteund door een SBIR (Small Business Innovation Research) administratieve toeslag subsidie van NIDCRR44 DE024456. U01 DE017855 NIDCR HIV-subsidie die ontstaan uit NIDCR verlenen voor de ontwikkeling van een bevestigende diagnose van de point-of-care voor HIV. Wij erkennen dankbaar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) voor haar technische bijstand en vriendelijke ondersteuning. Wij danken ook NYU Langone Medical Center voor het LI-COR Odyssey Imaging systeem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
