Summary
В этом протоколе мы опишем способ обнаружить Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray. Этот протокол readly могут быть адаптированы для других возникающих инфекционных заболеваний.
Abstract
Высокой плотности пептид microarrays позволяют скрининг более шести тысяч пептидов на слайде микроскопии единый стандарт. Этот метод может применяться для обнаружения наркотиков, идентификации терапевтической цели и развитие диагностики. Здесь мы представляем протокол для обнаружения конкретных диагностических пептиды Зика вирус (ZIKV), с использованием высокой плотности пептид microarray. Образец сыворотки крови человека, проверяется для ZIKV инфекции был инкубировали с высокой плотности пептид microarray, содержащий весь белок ZIKV, переведены на 3,423 уникальный 15 линейный (aa) выпарок с перекрытием 14-aa остатков печати в двух экземплярах. Окрашивание с различных вторичных антител в одном массиве, мы обнаружили пептидов, которые связывают иммуноглобулина М (IgM) и иммуноглобулина G (IgG) антител в сыворотке крови. Эти пептиды были отобраны для дальнейшей проверки экспериментов. В этом протоколе мы описываем стратегии для проектирования, обработки и анализа плотности пептид microarray.
Introduction
Зика вирус (ZIKV) диагноз на основании клинических симптомов является сложной потому, что он разделяет векторов, географического распределения и симптомы инфекции вируса денге и чикунгунья1. Учитывая риск неблагоприятных исходов беременности у женщин, инфицированных ZIKV во время беременности, важно проводить различие между 3 вирусов. Хотя текущий молекулярных диагностических тестов являются специфическими, они являются полезными только в крови или слюны в относительно короткий период острой инфекции2,3. Серологические анализы необходимы для диагностики за пределами этого первоначального периода инфекции4.
Развитие ZIKV конкретных серологического анализа сложных по двум причинам: во-первых, Зика антигены, которые иммунная система человека реагирует на данный момент не известно; и во-вторых, сохранение flaviviruses аминокислотных последовательностей побудить антитела перекрестной реактивности. Наша цель состояла в том, чтобы обнаружить уникальный ZIKV специфических пептидов, которые будут использоваться в диагностике. Для экрана пептид библиотек, охватывающих весь белков, включая фага, бактериальный, были разработаны различные подходы и дрожжи поверхность отображения,5,6,,78,9 10. Наша стратегия заключалась в использовании с высокой плотностью пептид microarray дна, которая позволяет быстрый и недорогой высокопроизводительный серологических показы11,12 и впоследствии идентифицированных пептиды могут использоваться для улучшения тока серологическим анализы для выявления ZIKV инфекции.
Этот протокол позволяет открытие Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray (рис. 1). Высокой плотности пептид microarray дна был подготовлен с помощью технология печати лазерная пептида. Вся последовательность ZIKV белок, состоящий из 3,423 аминокислотных остатков на основе французской Полинезии штамм (GenBank: KJ776791.2), был напечатан на слайде стандартного стекла в блоках 15 линейных остатков с напуском 14 аминокислотных остатков в двух экземплярах для всего 6846 пептид пятен. В дополнение к весь Зика белка последовательности пептиды, microarray использует гриппа гемагглютинин пептидов (HA) для внутреннего контроля.
Зика проверяются позитивный образец сыворотки, полученные от центра Уодсворт (Олбани, NY), была использована для выявления конкретных иммуноглобулина М (IgM) и реактивная пептиды иммуноглобулина G (IgG). После инкубации с образцом на ночь, microarray витражи с вторичной флюрохром конъюгированных антител (IgM против человека или антигуманных IgG) и проанализированы на microarray сканера. Количественная оценка пятно света и пептида аннотации была выполнена с конкретного программного обеспечения, предоставляемого той же компанией, которая изготовлена microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эти данные являются частью текущих исследований исследования, проведенного в Нью-Йорке колледж университета стоматологии и были одобрены Советом по рассмотрению институциональных из Нью-Йорка школы медицины университета, IRB # H10-01894. Клинические образцы, используемые в данном исследовании были обезличенных образцы, ранее используемые для диагностики и разрешения от Уодсворт центр Нью-Йорка государственного департамента здравоохранения, Олбани, Нью-Йорк.
1. Установка ZIKV высокоплотного пептид Microarray слайд в конкретных Инкубационный лоток
- Обработка стекла слайд по краям, с помощью непудренные перчатки. Размеры стекла слайд являются 75,4 мм х 25,0 мм и 1 мм толщиной. Поместите слайд в Инкубационный лоток с microarray поверхностью, обращенной вверх.
- Поместите глянцевой стороной вниз на поверхность печатного microarray печати. Для обеспечения хорошей позиции, перекрываются отверстия для винтов уплотнение и опорной плитой.
- Место в верхней части панели на печать для создании microarray дна камеры.
- Закрепите слайд в лоток, затянув одинаково барашковые винты один за другим вручную в попеременного, начиная от левого верхнего угла, следуют внизу справа. Поместите крышку Инкубационный лоток.
2. фон взаимодействия обнаружения: Пятнать Microarray с вторичные антитела
Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (стандартные и блокировки буферов, разбавленных вторичных антител) в углу камеры microarray.
- Инкубировать microarray с стандартного буфера (1 x-фосфатный буфер (PBS), 0,05% 20 анимации, рН 7,4, отфильтрованные с помощью фильтра 0.45 мкм) (общий объем 2000 мкл/microarray) за 15 мин при комнатной температуре (RT) на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удаление стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray. Заполните пустой слайд Держатели с пустых слайдов для предотвращения взлома microarray слайда.
- Блокировать microarray с блокирующий буфер (общий объем 2000 мкл/microarray) для 60 мин на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удалите блокирующий буфер, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Инкубировать microarray с вторичное антитело, антинародным флюрохром IgM проспряганное, разбавленных 1:5000 (общий объем 2000 мкл/microarray) в окрашивание буфера (10% блокирует буфер в стандартного буфера) за 30 мин при RT в темноте на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удалите вторичное антитело, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Вымойте microarray 3 x, 1 мин на мыть с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray дна на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Погрузите слайд 2 x в свежеприготовленные погружения буфер (1 мм трис, рН 7,4), (общий объем 200 мл).
- Насухо microarray тщательно, для примерно 1 мин, аспирационных лишнюю жидкость очень тщательно от верхней к нижней части слайда не касаясь поверхности слайда. Анализируйте слайд в microarray сканера читателя.
3. воздействие Microarray провести сыворотки
Предостережение: Выполняйте этот шаг в лабораторных условиях безопасности, биобезопасности уровня 2 (BSL-2) из-за потенциального инфекционного характера образцов сыворотки. Работа в рамках класса II биологической безопасности кабинета (BSC).
- Инактивирует образцов сыворотки в 56 ° C за 30 мин и центрифуги на 16000 РПРС для 5 мин при 4 ° C13.
Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (окрашивание, стандартного буфера и разбавленных сыворотки) в углу камеры microarray. - Разбавьте образца сыворотки в окрашивание buffer, начиная с 1:1,000 (общий объем 2000 мкл/microarray) разрежения. Держите его на 4 ° C до использования.
- Microarray с окрашивание буфера (общий объем 2000 мкл/microarray) Инкубируйте 15 мин на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удалите окрашивание буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Инкубируйте microarray дна, с образец разбавленный сыворотки на ночь при 4 ° C на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удалите образец разбавленный сыворотки, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Вымойте microarray 3 x, 1 мин на мыть с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray дна на RT на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
4. окрашивание с вторичные антитела и помечены управления антител
Примечание: Используйте пипетку на хранение решения (стандартные буферы, разбавленным среднего и лейбл антител) в углу камеры microarray.
- Разбавьте вторичное антитело пятная буфера.
Примечание: Использование антинародным флюрохром IgM проспряганное антитела или антигуманных IgG флюрохром конъюгированных антител при разбавлении 1:5,000 (общий объем 2000 мкл/microarray) пятная буфера. - Сочетание управления Метка антитела (моноклонального анти-Ха флюрохром конъюгированных) при разбавлении 1:1,000 (общий объем 2 000 мкл/microarray) в пятнать буфер с вторичное антитело, предварительно разводят в пятнать буфера.
- Проинкубируйте с microarray для 30 мин на RT в темноте на орбитальный шейкер на 140 об/мин.
- Удалите смеси разреженных среднего и лейбл антител, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
- Вымойте 3 x с стандартного буфера (общий объем 2000 мкл/microarray). Каждый мыть — 1 мин на орбитальный шейкер на 140 об/мин. После каждого мытья удалите стандартного буфера, аспирационных с пипеткой от угла камеры microarray.
5. Microarray сканирование
- Погрузите слайд 2 x в свежеприготовленные погружения буфер (1 мм трис, рН 7,4) (общий объем 200 мл).
- Тщательно высушить microarray около 1 мин, аспирационных очень тщательно от верхней к нижней части слайда не касаясь поверхности слайда.
- Сканировать microarray следуя инструкциям сканера. Поместите слайд на сканер с печатной поверхностью, обращенной вверх.
- Создайте новый проект и выберите область сканирования. Задать параметры сканера как: резолюция: 21 мкм, интенсивности для 700 и 800 Нм каналов: 7.0, качество сканирования: средний и смещение: 0,8.
- Приобрести и сохранить сканирования raw изображений в формате TIFF 16-битные оттенки серого.
6. Microarray Анализ с использованием конкретного программного обеспечения
- Откройте сырые изображения (TIFF). Откройте файл сетки массива.
- Выравнивание сетки массива для сканирования изображений с клавишами со стрелками мыши или клавиатуры компьютера.
- Выберите «Выделение количественно» конкретного программного обеспечения, которое создает значение индикации файл, который содержит интенсивности сигнала на каждом месте, значение фона и соответствующей последовательности пептид.
Примечание: Этот выходной файл можно также импортировать в программу электронных таблиц для дополнительного анализа и построения графиков.
7. Microarray хранения
- Храните в темноте при температуре 4 ° C под свободного азота или аргона газообразного кислорода герметичный microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты, полученные с помощью протокола описаны показаны на рисунке 2 и на рисунке 3. Без фона взаимодействия были отмечены когда предварительное окрашивание microarray с вторичной античеловеческие IgM (данные не показаны). Окрашивание с антинародным IgM конъюгата привели в нескольких областях выше фона зеленая Флуоресценция интенсивности, указывающее привязку этих пептидов с IgM в образце сыворотки хост (Рисунок 2). IgG обнаружения (красная флюоресценция сигнал) выявлено лишь несколько пептидов (рис. 2).
Конкретного программного обеспечения, предоставляемого той же компанией, которая изготовлена microarray Анализ microarray после сканирования. Созданный файл индикация содержит интенсивности сигнала на каждом месте, значение фона и соответствующей последовательности пептид. Пятно флуоресценции интенсивности каждого пептида с сильным ответом на IgM были визуализированы путем построения зеленый переднего медианные значения, полученные после вычитания фон из необработанного значения (рис. 3).
Рисунок 1: Схема показывает процесс анализа для высокой плотности пептид Microarray. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пептид Microarray отсканированные изображения. Изображения сырье флуоресценции окрашивания пептид microarray после инкубации с ZIKV сыворотки образец разбавленный 1: 250. IgG реактивности изображен в красном (слева), и реактивности IgM показано зеленым цветом (справа). HA управления пептиды кадр пептид microarray. Зум панели показывают группа пептидов с интенсивностью высокой флюоресценции, указывающее сильный ответ на IgM и IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Последовательность консенсуса Epitope представитель Зика вирус, реагируя с IgM в образце сыворотки принимающей. Медианные значения зеленый переднего плана из перекрывающихся пептиды были нанесены на график. Пептиды из последовательности консенсуса эпитоп, выделены красным цветом. Пептид с высокой интенсивностью флуоресценции помечается жирным шрифтом. Вектор основе графического дизайна программного обеспечения был использован для создания этой цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали протокол, используя microarray высокой плотности пептид, содержащий всю последовательность Зика вирус белка (Французской Полинезии штамм). Microarray был изготовлен печати 3,423 различных перекрывающихся линейной пептиды. Каждый пептид было 15 аминокислот и разнообразных остатками только один из его ближайшего соседа в последовательности (т.е., перекрытие 14 остатков). Хотя короче перекрытия могут быть напечатаны, epitope сопоставление является более точным с больше совпадений. Каждый пептид был напечатан в двух экземплярах для повышения надежности.
Важно, чтобы начать процесс с предварительно пятнать microarray с вторичное антитело для выявления возможных фон взаимодействий и дифференцировать их от образца конкретного сигнала. Используя соответствующий блокирующий буфер важна также как другие блокировки буферов как бычьим сывороточным альбумином (БСА) или сухого молока порошок может привести к интенсивности снижение сигнала. Образец проверенных сыворотки для ZIKV IgM антител сначала инкубируют с microarray на 1:1,000, но сигнал не обнаружен. Последующие инкубации в нижней разбавления 1: 500 в результате низкой интенсивности сигнала, исходя из пептидов, которые реагируют с IgM антител в пробе. Лучшие результаты были получены при Зика проверенных сыворотки образец был разведен в 1: 250. Мы не делали тестирование образцов сыворотки в более высокой концентрации, чтобы избежать увеличения фонового сигнала. Бережного обращения microarray важно избежать царапин на поверхности microarray. Таким образом решения таких нас разводят сыворотки и стандартного буфера добавляются и удаляются из угла камеры microarray. Кроме того важное значение для успешного результата является слайд конкретных Инкубационный лоток, предоставляемые компанией, производятся microarray дна, который предназначен для работы с минимальными образца томов. Инкубационный лоток размеры являются 13,0 см 9,0 см и 3 см толщиной. Есть 3 слайды места для полостей в Инкубационный лоток, которые позволяют опробование 3 различные слайды одновременно. Однако в этом эксперименте мы использовали только один слайд. Пустой Микроскоп слайды были размещены в двух углублениях сбалансировать лоток и предотвращения взлома массива слайда. Инкубационный лоток состоит из 4 частей: основание где слайды размещены в назначенный полостей; герметик, состоящий из кремния для разделения каждого слайда от других; Верхняя часть, содержащую барашковые винты присоединиться к герметик с опорной плитой и создании microarray дна камеры для добавления решений для assay например мойки буфер или сыворотки образца. Sealer и верхняя часть избежать загрязнения или смешивания решений между слайдами. Последний раздел компонент является крышкой для сведения к минимуму риска испарения или загрязнения окружающей среды образцов. Орбитальный шейкер предпочли получить оптимальное увлажнение и пятнать условий.
В зависимости от того, когда узел Результирующая конкретных Зика IgM инфицированных вирусом концентрация антител в сыворотке может быть высоким или низким. Таким образом предполагалось, что использование образца сыворотки с более высокой концентрации IgM увеличит интенсивность сигнала относительной флуоресценции. После обнаружения IgM той же пробы сыворотки был инкубировали при разбавлении 1: 250 с microarray дна, но IgG против человека был использован в качестве вторичного антитела. Кроме того различные антитела классов могут быть обнаружены одновременно в пределах же microarray, используя смесь вторичных антител, которые каждый конъюгированных с различными флуоресценции красители. Же microarray дна могут быть окрашены снова с более концентрированной сыворотки образца при низкой интенсивности сигнала. При хранении microarray стабильной в течение нескольких месяцев и могут быть использованы снова.
Количественная оценка пятно света и пептида аннотации была выполнена с использованием патентованного программного обеспечения от компании, которая изготовлена microarray дна, который также обеспечивает «.psf» файл с шаблоном формата массива. ПСФ файл является по существу сетку, которая выравнивается необработанный сканера изображение с помощью патентованного программного обеспечения. Программный алгоритм анализирует относительные флуоресценции интенсивности каждого пятна в сырье (значение интенсивности сигнала на месте), фона (предполагаемое значение сигнала, вызванные неспецифической привязки) и (вычитается фон из сырья значение) сигнал. Она также вычисляет переднего медианные значения и совокупных переднего медиана соответствующее среднее значения двух средний место каждого пептида в двух экземплярах. Кроме того программное обеспечение определяет мотивы/epitope консенсуса внутри перекрывающихся пептиды. Кроме того, может быть определена количественно интенсивности сигнала с microarray программного обеспечения сканера и затем с помощью шаблона в формате массива, можно определить последовательность пептида.
После этого протокола несколько перспективных кандидатов пептида были определены на основе интенсивности флуоресценции. Последующий анализ14 взрыва была использована для выявления остатков с потенциальными перекрестной реактивности с другими flavivirus. В общей сложности 14 выявленных пептиды присутствуют только в ZIKV, как это определено в 3 протеома баз данных. Вторая серия microarrays планируется, будет содержать отдельные пептиды из первого массива. Это позволит тестирования несколько проверенных образцов, а также образцы от только инфицированных flavivirus помимо ZIKV для подтверждения специфику. Для скрининга, мы приспособим формате пробирного ELISA, покрытие пластин с выбранной пептидов и тестирования привязки к ZIKV специфических антител в образцах сыворотки крови и слюны.
ZIKV обработка требует, работающих в объекте 2-го уровня биобезопасности (BSL-2)15. Как мы работали с образцом сыворотки для ZIKV инфекции мы работали в Фонд BSL-2, выполняя все примеры манипуляции в пределах класса II (или выше) биологической безопасности кабинета министров (BSC). Вот почему мы инактивированный вирус, Отопление образцов сыворотки в 56 ° C за 30 мин до инкубации образца с microarray13. После тепловой инактивации, также рекомендуется продолжать работу в учреждении BSL-2 с соответствующим надлежащей лабораторной практики безопасности, чтобы избежать вероятность инфицирования.
Microarray что мы разработали содержит только линейные пептидов и следовательно конформационные epitopes, которая может быть ценным, как диагностики могут быть пропущены. Это ограничение можно решить с помощью высокой плотности microarray дна, содержащие циклические ограничением пептидов, которые имитируют петельные epitope структуры16. Этот протокол быстро можно адаптировать для других патогенов, потому что после последовательности белка известен новый microarray дна могут быть разработаны для обнаружения потенциальных диагностических пептидов. Это также может быть адаптирована для других приложений, таких как биомаркер открытие17, антиген и epitope обнаружения для разработки вакцины или терапевтических целей18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Текущая поддержка предоставляется Грант административные дополнение SBIR (небольшой бизнес инновационных исследований) от NIDCRR44 DE024456. NIDCR ВИЧ Грант, которая развилась из гранта U01 DE017855 NIDCR для развития подтверждающих точку ухода диагностики ВИЧ. Мы с благодарностью признаем Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) за ее техническую помощь и поддержку. Мы также благодарим NYU Langone медицинский центр для LI-COR Одиссея Imaging системы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
