Summary
En este protocolo, se describe una técnica para descubrir Zika virus diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Este protocolo readly puede ser adaptado para otras enfermedades infecciosas emergentes.
Abstract
Microarrays de alta densidad péptido permite detección de péptidos de más de 6 mil sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Este método puede ser aplicado para el descubrimiento de medicamentos, identificación de objetivos terapéuticos y el desarrollo del diagnóstico. Aquí, presentamos un protocolo para descubrir Zika virus (ZIKV) diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Una muestra de suero humano validada para infección por ZIKV fue incubada con una microarrays de alta densidad péptido que contiene la proteína ZIKV toda traducida en 3.423 única 15 lineal de aminoácidos (aa) los residuos con una superposición de residuos 14-aa impreso por duplicado. Coloración con los anticuerpos secundarios diferentes dentro de la misma matriz, detectamos péptidos que se unen a la inmunoglobulina M (IgM) y anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) en suero. Estos péptidos fueron seleccionados para experimentos de validación adicionales. En este protocolo, se describe la estrategia para diseñar, procesar y analizar un microarray de péptidos de alta densidad.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnosis basada en los síntomas clínicos es desafiadora porque comparte vectores, distribución geográfica y los síntomas con Dengue y Chikungunya virus infección1. Dado el riesgo de resultados adversos del embarazo en las mujeres infectadas con ZIKV durante el embarazo, es importante distinguir entre los 3 virus. Aunque las pruebas de diagnóstico moleculares actuales son específicas, son sólo útiles en sangre o saliva durante el relativamente corto período de infección aguda2,3. Análisis serológicos son esenciales para el diagnóstico fuera de este período inicial de la infección4.
El desarrollo de un ensayo serológico específico ZIKV es difícil por dos razones: en primer lugar, los Zika antígenos que el sistema inmunológico humano responde a actualmente no se conocen; y secuencias de aminoácidos de flaviviruses segundo, conservado inducen reactividad cruzada del anticuerpo. Nuestro objetivo era descubrir el únicos péptidos específicos ZIKV a utilizarse en el diagnóstico. Se han desarrollado diferentes enfoques a las bibliotecas de péptidos pantalla cubriendo todas proteínas incluyendo fagos bacterianos, y mostrar la superficie de la levadura5,6,7,8,9, 10. Nuestra estrategia era utilizar un microarray de péptidos de alta densidad que permite la rápida y de bajo costo alto rendimiento exámenes serológicos11,12 y posteriormente los péptidos identificados se pueden utilizar para mejorar la corriente serológica ensayos para la detección de infección por ZIKV.
Este protocolo permite el descubrimiento de Zika virus diagnóstico péptidos específicos con un microarray de péptidos de alta densidad (figura 1). Los microarrays de alta densidad péptido fue producido usando la tecnología de impresión de láser de péptido. La secuencia de proteína entera ZIKV consisten en residuos de aminoácidos 3.423 basado en la cepa Polinesia francesa (GenBank: KJ776791.2), fue impreso en un portaobjetos de vidrio estándar en bloques de 15 residuos lineales con una superposición de 14 residuos de aminoácidos por duplicado para un total de 6.846 puntos del péptido. Además de los péptidos de secuencia de la proteína de Zika todos el microarray utiliza hemaglutinina de Influenza (HA) péptidos para controles internos.
Una Zika validado positivo muestra de suero obtenida del centro de Wadsworth (Albany, NY), se utilizó para identificar péptidos reactivas la inmunoglobulina G (IgG) y específicos de la inmunoglobulina M (IgM). Después de la incubación con la muestra durante la noche, el microarray fue teñido con un anticuerpo conjugado del fluorocromo secundario (anti-human IgM o anti-IgG humanas) y analizado en un escáner de microarreglos. Cuantificación de intensidades spot y péptido anotación fue realizada con un software específico suministrado por la misma compañía que fabricó el microarray.
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Protocol
Estos datos son parte de un estudio de investigación llevado a cabo en la Universidad de Odontología de la Universidad de Nueva York y fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Las muestras clínicas utilizadas en este estudio fueron muestras anónima utilizadas previamente para el diagnóstico y con el permiso de la Wadsworth Center de Nueva York Departamento del estado de salud, Albany, NY.
1. instalación de la corredera de Microarray ZIKV alta densidad péptido en una bandeja de incubación específica
- Manejar lo portaobjetos de vidrio por los bordes con guantes sin polvo. Las dimensiones de la diapositiva de cristal son 75,4 mm 25,0 mm y 1 mm de espesor. Colocar el portaobjetos en la bandeja de incubación con la superficie de microarray hacia arriba.
- Coloque la parte brillante del sello hacia abajo sobre la superficie impresa de microarrays. Para asegurar una buena posición, se superponen los orificios para tornillos del sello y la placa base.
- Coloque la parte superior de la bandeja en el sello para crear una cámara de microarrays.
- Asegure el portaobjetos en la bandeja apretando igualmente los tornillos uno después de otro con la mano en un patrón alterno a partir de la parte superior izquierda, seguida por la parte inferior derecha. Coloque la tapa de la bandeja de incubación.
2. detección de interacción antecedentes: La coloración el Microarray con anticuerpos secundarios
Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (buffers estándar y de bloqueo, anticuerpos secundarios diluidos) en la esquina de la cámara de microarrays.
- Incubar el microarray con un tampón estándar (1 x 0,05% Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, filtrada con un filtro de 0.45 μm) (total de volumen de 2.000 μl/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en un agitador orbital a 140 rpm.
- Quitar el tampón estándar por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays. Llenan los titulares diapositiva vacía de diapositivas en blanco para evitar la ruptura de la diapositiva microarray.
- Bloquear el microarray con el tampón de bloqueo (volumen total de 2.000 μl/microarray) durante 60 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.
- Retire el amortiguador de bloqueo por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Incubar el microarray con el anticuerpo secundario, fluorocromo de IgM anti-humano conjugada, diluido 1: 5.000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en la tinción del almacenador intermediario (10% de bloqueo de la memoria del buffer estándar) por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.
- Quitar el anticuerpo secundario por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Sumerja el portaobjetos 2 x en un búfer que sumerge recién preparado (1 mM Tris, pH 7.4), (volumen total de 200 mL).
- Secar el microarray, aproximadamente 1 minuto, aspirando el líquido en exceso muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos. Analizar la diapositiva en un lector de escáner de microarreglos.
3. exposición de los microarrays para suero
PRECAUCIÓN: Realice este paso en condiciones de seguridad de laboratorio, bioseguridad nivel 2 (BSL-2) debido a la potencial naturaleza contagiosa de las muestras de suero. Trabajo dentro de una clase II gabinete de seguridad biológica (BSC).
- Inactivar la muestra del suero a 56 ° C por 30 min y centrifugar a 16.000 rcf durante 5 minutos a 4 ° C13.
Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (coloración, buffer estándar y suero diluido) en la esquina de la cámara de microarrays. - Diluir la muestra de suero en tampón de tinción a partir de una dilución (volumen total de 2.000 μL/microarrays) de 1:1,000. Mantener a 4 ° C hasta su uso.
- Incubar el microarray con el tampón de tinción (volumen total de 2.000 μL/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.
- Eliminar el tampón de tinción por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Incubar el microarray con la muestra de suero diluido durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital a 140 rpm.
- Retire la muestra de suero diluido por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μL/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
4. la coloración con los anticuerpos secundarios y Control etiquetado
Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (tampones estándar, secundaria diluido y etiqueta anticuerpos) en la esquina de la cámara de microarrays.
- Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de tinción.
Nota: Fluorocromo de uso anti-human IgM conjugado anticuerpo o anticuerpo anti-humana IgG fluorocromo conjugado a la dilución de 1:5,000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en tampón de tinción. - Mezcla control etiqueta anticuerpo (monoclonal anti-HA fluorocromo conjugado) a una dilución de 1:1,000 (volumen total de 2 000 μl/microarrays) en tampón de tinción con anticuerpo secundario previamente diluido en tampón de tinción.
- Incubar con el microarray por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.
- Retire la mezcla del secundario diluido y etiqueta anticuerpos por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
- Lavar 3 veces con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarrays). Cada colada es de 1 min en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
5. Análisis de Microarray
- Sumerja el portaobjetos 2 x en búfer recién preparado de inmersión (1 mM Tris, pH 7.4) (volumen total de 200 mL).
- Seque el microarray cuidadosamente, alrededor de 1 minuto, aspirando muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos.
- Análisis microarray siguiendo las instrucciones del escáner. Colocar el portaobjetos sobre el escáner con la superficie impresa hacia arriba.
- Cree un nuevo proyecto y seleccione el área de exploración. Definir los parámetros del escáner como: resolución: 21 μm, intensidad para canales de 700 y 800 nm: 7.0, de análisis de calidad: media y desvío: 0.8.
- Adquirir y guardar la imagen raw de exploración como un formato de archivo TIFF de 16 bits en escala de grises.
6. Análisis de microarrays utilizando un Software específico
- Abra la imagen raw (imagen TIFF). Abra el archivo de la red matriz.
- Alinee la red matriz para el análisis de imagen con teclas de flecha de ratón o el teclado del ordenador.
- Seleccionad "cuantificar" en el software específico, que crea un archivo de lectura que contiene la intensidad de la señal de cada punto, el valor de fondo y la correspondiente secuencia de péptido.
Nota: Este archivo de salida también se puede importar en un programa de hoja de cálculo para análisis adicional y graficar.
7. microarrays de almacenamiento
- Almacenar los microarrays en la oscuridad a 4 ° C en gas libre de nitrógeno o argón oxígeno.
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Representative Results
Se muestran los resultados obtenidos con el protocolo descrito en la figura 2 y la figura 3. No hay interacciones de fondo fueron observadas cuando la tinción el microarray con secundario anti-humano IgM (datos no mostrados). Tinción con un anti-human IgM conjugado dio lugar a varias áreas sobre intensidades de fluorescencia verde de fondo, lo que indica la Unión de estos péptidos con IgM en la muestra de suero del huésped (figura 2). Detección de igG (señal de fluorescencia roja) reveló solamente unos péptidos (figura 2).
El software específico suministrado por la misma empresa que fabrica los microarrays analiza el microarray después del análisis. El archivo de lectura creado contiene la intensidad de la señal de cada punto, el valor de fondo y la correspondiente secuencia de péptido. Las intensidades de fluorescencia punto de cada péptido con una fuerte respuesta IgM fueron visualizadas mediante la representación de los valores medianos de primer plano verde obtenidos después de restar el fondo del valor del crudo (figura 3).
Figura 1: Esquema mostrando el proceso de análisis de los microarrays de alta densidad péptido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes escaneadas de péptido Microarray. Imágenes de fluorescencia crudo de coloración el microarray de péptido tras incubación con suero ZIKV muestra diluida 1: 250. La reactividad IgG aparece en rojo (izquierda), y la reactividad IgM aparece en verde (derecha). HA péptidos control marco el microarray de péptido. Zoom paneles Mostrar grupo de péptidos con intensidades de fluorescencia alta, indicando una fuerte respuesta a IgM o IgG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Secuencia de consenso del epítopo representante Zika Virus reaccionando con IgM en la muestra de suero del anfitrión. Valores medianos verde primer plano de superposición de péptidos se trazan en un gráfico. Péptidos de la secuencia de consenso del epítopo son remarcados en rojo. El péptido con la intensidad de fluorescencia más alta está marcado en negrita. Vector base diseño gráfico software fue utilizado para generar esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos diseñado un protocolo de utilización de un microarray de alta densidad péptido que contiene la secuencia de proteína de virus Zika entera (cepa Polinesia francesa). El microarray fue fabricado por péptidos lineales superpuestas diferentes 3.423 impresión. Cada péptido fue 15 aminoácidos y variados por un único residuo de su vecino más cercano en la secuencia (es decir, superposición de residuos 14). Aunque se superpone más corto puede ser impreso, Mapeo epitopo es más preciso con traslapos más. Cada péptido fue impreso por duplicado para aumentar confiabilidad.
Es esencial para iniciar el proceso con la coloración el microarray con el anticuerpo secundario para detectar interacciones fondo posible y diferenciarlos de la señal específica de la muestra. También es importante como otros búferes de bloqueo como la albúmina de suero bovino (BSA) o leche en polvo polvo puede dar lugar a intensidad reducida de la señal usando un tampón de bloqueo específico. Una muestra de suero validado por ZIKV IgM anticuerpos primero se incubó con el microarray en 1:1,000 pero no hay señal fue detectada. Posterior incubación a una dilución menor de 1: 500 dio lugar a una señal de baja intensidad proveniente de peptidos que reaccionaron con los anticuerpos de IgM en la muestra. Los mejores resultados se obtuvieron cuando la muestra de suero validado Zika se diluyó en 1: 250. No nos vuelva a probar la muestra de suero en una concentración más alta para evitar un aumento de la señal de fondo. El tratamiento cuidadoso de los microarrays es esencial para evitar rayar la superficie de microarrays. Por lo tanto, las soluciones de tales que nos diluido con suero y buffer estándar se agrega a y desde la esquina de la cámara de microarrays. También, es importante para un resultado exitoso la bandeja de incubación específica diapositiva de la compañía que fabrica los microarrays, que está diseñado para permitir trabajar con volúmenes mínimos de muestra. Las dimensiones de la bandeja de incubación son cm 13,0 9,0 cm y 3 cm de espesor. Hay 3 toboganes señalados cavidades en la bandeja de incubación que permiten ensayo 3 toboganes diferentes simultáneamente. Sin embargo, en este experimento hemos utilizado sólo 1 tobogán. Portaobjetos de microscopio en blanco fueron colocados en las otras dos cavidades para balancear la bandeja y evitar la ruptura de la diapositiva de la matriz. La bandeja de incubación consta de 4 partes: una placa base donde las diapositivas se colocan en cavidades designadas; un sellador compuesto por silicio para separar cada diapositiva de los otros; una parte superior que contiene tornillos para unirse el sellador con la placa base y crear las cámaras de microarrays para añadir soluciones para el análisis como muestra de suero o tampón de lavado. El sellador y la parte superior evitan la contaminación o la mezcla de soluciones entre las diapositivas. El último componente de la sección es una tapa para reducir al mínimo el riesgo de evaporación o contaminación ambiental de las muestras. Un agitador orbital es preferido para obtener óptima adherencia de soldadura y condiciones de tinción.
Dependiendo de Cuándo el virus infectó el host específico resultante Zika IgM concentración de anticuerpos en el suero puede ser alta o baja. Por lo tanto, se preveía que con una muestra de suero con una mayor concentración de IgM se incrementaría la intensidad de la señal de fluorescencia relativa. Después de la detección de IgM, la misma muestra de suero fue incubada en una dilución de 1: 250 con el microarray, pero una IgG anti-humano fue utilizado como el anticuerpo secundario. Alternativamente, pueden detectarse simultáneamente clases de anticuerpos diferentes dentro del misma microarray con una mezcla de anticuerpos secundarios conjugado cada uno con fluorescencia diferentes tintes. El mismo microarray puede manchado otra vez con una muestra de suero más concentrada si la intensidad es baja. Si está almacenado correctamente el microarray es estable durante varios meses y posiblemente puede ser utilizado otra vez.
Cuantificación de intensidades spot y péptido anotaciones fue realizada usando software propietario de la empresa que fabrica el microarray que también proporciona un archivo de ".psf" con la plantilla del formato de matriz. El archivo psf es esencialmente una rejilla que se alinea con la imagen de escáner raw utilizando el software propietario. Un algoritmo de software analiza las intensidades de fluorescencia relativa de cada punto en crudo (valor de la intensidad de la señal del lugar), (valor estimado de la señal causada por el atascamiento no específico) de fondo y primer plano (restar el fondo de la materia prima señal de valor). También calcula los valores medianos de primer plano y medio primer plano agregado correspondiente a la media de los dos valores punto medianos de cada péptido por duplicado. Además, el software identifica motivos consenso/epitopo dentro de superposición de péptidos. Como alternativa, pueden cuantificarse la intensidades de la señal con el software de escáner de microarreglos y luego con la plantilla del formato de matriz, se puede identificar la secuencia del péptido.
Siguiendo este protocolo, se identificaron varios candidatos prometedores de péptido basado en la intensidad de fluorescencia. Posterior explosión14 análisis fue utilizado para identificar los residuos con potencial reactividad cruzada a otros flavivirus. Un total de 14 péptidos identificados están presentes sólo en ZIKV identificadas en 3 bases de datos de proteoma. Está prevista una segunda serie de microarrays que contienen los péptidos seleccionados de la primera matriz. Esto permitirá que múltiples muestras validadas así como muestras de personas infectadas sólo por flavivirus diferente ZIKV para confirmar la especificidad de la prueba. Para la investigación, se adaptará un formato de análisis de ELISA, prueba el atascamiento a anticuerpos específicos ZIKV en muestras humanas de suero y saliva y recubrimiento de las placas con los péptidos seleccionados.
ZIKV manejo requiere trabajar en instalaciones de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)15. Como trabajamos con un suero muestra validadas para infección por ZIKV que trabajamos en instalaciones BSL-2 realizando toda la manipulación de la muestra dentro de una clase II (o superior) gabinete de seguridad biológica (BSC). Por esta razón que inactiva el virus de la calefacción de la muestra de suero a 56 ° C por 30 min antes de incubar la muestra con el microarray13. Después de la inactivación de calor, se recomienda también seguir trabajando en una facilidad BSL-2 con adecuada buena seguridad práctica de laboratorio para evitar la posibilidad de infección.
El microarray que diseñamos sólo contiene péptidos lineales y epitopos conformacionales consecuente que podrían ser valiosos como diagnóstico puede haberse omitido. Esta limitación puede resolverse mediante el uso de una alta densidad microchips que contienen péptidos cíclicos con restricciones que imitan el bucle epítopo estructuras16. Este protocolo puede ser rápidamente adaptado a otros patógenos porque una vez se conoce la secuencia de la proteína un nuevo microarray puede ser diseñado para el descubrimiento de péptidos diagnóstico potencial. También puede ser adaptado para otras aplicaciones, como el descubrimiento de biomarcadores17, el descubrimiento de antígenos y epítopos para el desarrollo de una vacuna o dianas terapéuticas18,19.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Es actual apoyado por una subvención de suplemento administrativo SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Subvención NIDCR VIH que evolucionó de subvención NIDCR U01 DE017855 para el desarrollo de un diagnóstico confirmatorio de punto de atención para el VIH. Agradecemos a Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) su asistencia técnica y apoyo. También agradecemos a NYU Langone Medical Center por el LI-COR odisea sistema de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
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