Summary
Denna artikel visar hur mus embryonala hindbrain kan användas som en modell för att studera utvecklingsmässiga neurogenes i både hela organ och vävnad avsnitt preparat.
Abstract
Mus embryo framhjärnan är oftast anställda system för att studera däggdjur neurogenes under utveckling. Den mycket vikta framhjärnan neuroepithelium är dock inte mottaglig för wholemount analys för att undersöka organ-wide neurogenes mönster. Definiera mekanismerna av framhjärnan neurogenes är dessutom inte nödvändigtvis prediktiva för neurogenes i andra delar av hjärnan; exempelvis på grund av närvaron av framhjärnan-specifika stamceller undertyper. Mus hindbrain ger en alternativ modell för att studera embryonala neurogenes som är mottaglig för wholemount analys, liksom vävnadssnitt att iaktta spatiotemporal distribution och beteendet hos neurala stamfäder. Dessutom är det enkelt dissekeras för andra nedströms applikationer, såsom cell isolering eller molekylärbiologi analys. Som mus hindbrain kan lätt analyseras i det stora antalet cell härstamning reporter och muterade mus stammar som har blivit tillgängliga, erbjuder det en kraftfull modell för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna av utvecklingstoxicitet neurogenes i ett däggdjur organismen. Här presenterar vi en enkel och snabb metod för att använda musen embryo hindbrain för att analysera däggdjur neurala stamceller cell (NPC) beteende i wholemount preparat och vävnadssnitt.
Introduction
Under embryonalutvecklingen hos däggdjur dela NPCs i ventrikulära (VZ) och subventrikulära (SVZ) zonplanerar av den expanderande neuroepithelium att generera nya nervceller i en process som kallas 'neurogenes'. Generering av nya nervceller och deras NPC prekursorer har undersökts utförligt i framhjärnan1, medan mindre är känt om denna process i andra regioner.
Framhjärnan är en komplex och sinnrikt vikta struktur som studeras i hög grad med histologiska metoder efter vävnad snittning, vilket gör förståelse neurogenes mönster över hela orgeln utmanande. Studier av framhjärnan neurogenes är dessutom inte nödvändigtvis prediktiva för neurogen beteende i andra regioner i hjärnan eller i ryggmärgen. Till exempel signalering ledtrådar kan framkalla olika svar i olika CNS regioner, som observerats vid ciliär neurotrofisk faktor och leukemi hämmande faktor, som främjar självförnyelse av NPC i laterala ganglieblockerande eminens, men enheten differentiering av ryggmärgen föräldraparets2. Dessutom en underklass av NPC som befolkar utveckla framhjärnan och bidrar väsentligt till expansion av hjärnbarken1 är frånvarande från hindbrain och ryggmärgen3. Omvänt, är det tänkbart att ryggmärgen och hindbrain innehåller alternativa NPC subtyper inte är närvarande i cortex.
Mus embryo hindbrain är evolutionärt äldsta regionen av däggdjur hjärnan och genererar lillhjärnan och hjärnstammen. Trots dess bevarande mellan arter, är relativt lite känt om hindbrain neurogenes, inklusive NPC undertyper eller deras reglering. Majoriteten av hindbrain forskning i musen har fokuserat på processen för vävnad segmentering, driven av Hox gener4och mönstringen av efter mitotiska nervceller5. Bakhjärnan har dessutom använts som modell för att studera mekanismerna för utvecklingstoxicitet angiogenes6.
I motsats till mus hindbrain, har zebrafisk bakhjärnan använts i stor utsträckning att följa NPC differentiering och härstamning progression i ryggradsdjur modellorganism (t.ex.,7,8). Chick hindbrain har också använts för att studera neurogenes under ryggradsdjur utveckling (t.ex.,9,10). Liknar zebrafisk bakhjärnan11, chick hindbrain kan vara levande avbildas för att studera NPC beteende och förordning över tid12. Likartade längsgående observation av levande imaging inte är för närvarande möjligt i däggdjur organismer, eftersom de utvecklas i livmodern. Dessutom riktade manipulation genom tekniker såsom elektroporation kan lätt appliceras på frilevande zebrafiskar embryon eller chick embryon i ovo (t.ex.13), men sådana tekniker är också mer utmanande i Utero.
Mus embryo hindbrain lämpar sig dock utsökt att definiera de molekylära och cellulära mekanismer som styr neurogenes. Analys av mus hindbrain kommer för det första, i många fall ge information som är mer relevant för människor utvecklingen än som erhålls genom att studera lägre ryggradsdjur. Dessutom, det finns ett stort antal genetiskt modifierade mus stammar att kan antingen användas för öde mappning murina NPC eller ändra reglerande mekanismer med konstituerande eller villkorlig muterade alleler av relevanta gener. Slutligen har det nyligen visats att Mikroskop av ventrikulära hindbrain föräldraparets ex vivo tillåter minst en kort genomgång av hindbrain NPC kinetik14. Ännu, i dagsläget, mycket lite är känt om spatiotemporal organisation och funktionssätt hindbrain NPCs i hela orgel sammanhang.
Här visar vi en enkel och snabb metod att använda bakhjärnan som en kraftfull modell för att analysera däggdjur NPC beteende i wholemount preparat och vävnadssnitt. Vi tillhandahåller ytterligare protokoll för att använda immunolabeling för att studera olika neurogenes parametrar och att processen hindbrain prover ytterligare för nedströms molekylär applikationer såsom kvantitativ omvänt transkriptas (qRT)-PCR.
Protocol
Alla djur arbetet utfördes i enlighet med UK Home Office och lokala etiska riktlinjer.
1. Sammanfattning av steg och Timing
- Utföra tidsstyrd parningar av vuxna möss från en stam som lämpar sig att besvara den biologiska frågan under utredning att få embryonala dag (e) 9,5-e13.5 graviditeter; kräver 12-15 dagar.
- Du kan också förbereda 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) lösning och utföra injektion (protokollet avsnitt 2). kräver ~ 1 h på dagen innan eller samma dag som embryo isolering, beroende på önskad längd på EdU/BrdU märkning.
- Utföra embryo isolering och hindbrain dissektion (protokollet avsnitt 3). kräver ~ 10 min/embryo.
- Utföra wholemount immunofluorescens märkning (Protocol avsnitt 4); kräver 3 dagar.
- Med en vibratome och utför flytande avsnitt immunofluorescens märkning (Protocol avsnitt 4): kräver 2 dagar.
- Med en kryostat och utföra immunofluorescens märkning av kryosnitt (protokollet avsnitt 5). kräver 2 dagar.
2. injicera gravida kvinnliga mus med BrdU eller EdU (tillval)
- Lös BrdU eller EdU i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en koncentration på 10 mg/mL och 1 mg/mL, respektive.
Försiktighet: BrdU och EdU är giftiga; bär lämpligt skydd. - Väga gravid musen och beräkna volymen av BrdU eller EdU lösning som ska administreras för att nå 100 mg/kg BrdU eller 5 mg/kg EdU.
- Injicera BrdU eller EdU lösning genom den intraperitoneala vägen antingen 1 h eller 1 dag innan du samlar in embryon, beroende på önskad längd av märkning.
Obs: Märkning för 1 h visualiserar hindbrain celler i S-fas. Märkning för 1 dag visualiserar avkomman av hindbrain NPCs.
3. dissekering av Hindbrains från e9.5 - e13.5 musembryon
- Avliva en timed-gravida kvinnliga mus med ett etiskt godkända förfarande i skede krävs graviditetsdiabetes (t.ex., cervikal dislokation). Med vass sax, uppskuren i bukhålan och noggrant punktskatt livmodern. Placera exciderad livmodern som innehåller embryon i en 60 mm plast skål innehållande 20 mL iskallt PBS.
Obs: Det krävs inte att aseptisk teknik. - Utföra alla ytterligare dissektion med dissekera Mikroskop. Använda urmakare pincett nummer 5, riv muskulatur i livmodern väggen för att exponera embryon, släppa varje embryo av severing navelsträngen och ta bort gulesäcken.
- Med en steril Pasteur-pipett med en wide-bore öppning, över varje embryo till en ren plast skålen med iskall PBS.
- Med hjälp av urmakare pincett nummer 55, sever huvudet (figur 1E).
- Du kan också behålla en liten bit vävnad (t.ex., ¼ av en gulesäck eller cirka 2 mm tail tip) genomisk DNA isolering och efterföljande genotypning.
- Med hjälp av urmakare pincett nummer 55, punktskatt vävnad innehållande hindbrain parallellt med och omedelbart nedanför den hindbrain neuroepithelium att skilja det från ansikts- och framhjärnan vävnad (figur 1F).
- Ställning hindbrain och stjärtfenan huvud vävnad ryggsidan upp och identifiera den 4: e ventrikeln, som täcks av en tunn vävnad skikt (taket plattan). Noggrant genomborra tak plattan med urmakare pincett nummer 55 (figur 1 g) och skala bort överflödig vävnad med pincett, flytta rostrally längs mittlinjen över mellanhjärnan, och sedan caudally över bakre hindbrain och ryggmärgen (figur 1 g ); bakhjärnan bör nu exponeras i en öppen bok förberedelse (figur 1 H).
- Förbereda hindbrains för wholemount immunolabeling (alternativ 1).
- Använda urmakare pincett nummer 55, noggrant retas bort återstående huvud mesenchyme och eventuella hjärnhinnorna kopplad till pial sida av bakhjärnan använder tången (figur 1I). Ta bort mellanhjärnan och ryggmärgsvävnad (figur 1J) för att lämna endast hindbrain vävnad (figur 1 K).
Obs: Detta steg i proceduren bör inte följas på e9.5 eller e10.5, eftersom försöker göra det sannolikt skulle skada den hindbrain neuroepithelium; Dessutom är ta bort hjärnhinnorna inte nödvändigt eftersom den hindbrain neuroepithelium är tillräckligt tunn i detta skede att möjliggöra effektiv penetration av antikroppar för immunolabeling. Detta steg bör dock, följas från e11.5 och framåt, när meningeal vävnaden konsoliderar, för att förbättra antikropp genomträngningen in i hindbrain neuroepithelium. Dissektion är enklast när de utförs i iskall PBS (Använd ren PBS för varje hindbrain).
- Använda urmakare pincett nummer 55, noggrant retas bort återstående huvud mesenchyme och eventuella hjärnhinnorna kopplad till pial sida av bakhjärnan använder tången (figur 1I). Ta bort mellanhjärnan och ryggmärgsvävnad (figur 1J) för att lämna endast hindbrain vävnad (figur 1 K).
- Förbereda hindbrains för vibratome och kryosnitt (alternativ 2)
- Ta bort använder urmakare pincett nummer 55, mellanhjärnan och ryggmärgsvävnad (figur 1J).
Obs: Det är inte nödvändigt att ta bort mesenchyme och hjärnhinnorna av hindbrains avsedd för snittning (som visas i figur 1I).
- Ta bort använder urmakare pincett nummer 55, mellanhjärnan och ryggmärgsvävnad (figur 1J).
- Överföra hindbrains från plast skålen till rundkolv 2 mL rör med Pasteur pipett, aspirera alla PBS och fixa för 2 h vid 4° C med mild-agitation i nymalen tinade 4% w/v formaldehyd löst i PBS.
Försiktighet: Formaldehyd är giftiga; bär lämpligt skydd. - Skölj hindbrains 3 x gånger med PBS. Förvaras vid 4 ° C i PBS om immunolabeling kommer att inledas inom 2-3 dagar eller ersätta PBS med 50% methanol/50% PBS för 5 min innan du överför till 100% metanol för längre lagring vid-20° C.
4. Wholemount immunofluorescens
- Om så krävs, rehydrera hindbrains i seriellt fallande utspädningar av metanol i PBS (t.ex.75% metanol, 50% metanol, 25% metanol) vid rumstemperatur (RT) för 5 min varje och sedan överföra till PBS.
Obs: En graderad serie metanol krävs att försiktigt rehydrera hindbrains och säkerställa korrekt vävnad bevarande. - Permeabilize hindbrains för 30 minuter vid 4 ° C i PBS som innehåller 0,1% Triton x-100 (PBT) med försiktig skakning.
- Inkubera hindbrains för 1 h vid 4 ° C i PBT innehållande 10% Värmeinaktiverade get serum med försiktig skakning.
Obs: Använd serum från värdarter som sekundära antikropparna togs upp i. För primära antikroppar uppvuxen i get, inkubera i serumfritt protein block, till exempel 5% bovint serumalbumin i PBS eller ett lämpligt kommersiellt alternativ (se Tabell för material). Detta kommer att minska icke-specifik färgning ofta observerats vid användning av primära antikroppar uppvuxen i get. - Inkubera hindbrains övernattning på 4 ° C i PBT som innehåller 1% Värmeinaktiverade serum och primära antikroppar med mild agitation (t.ex., kanin anti-phospho Histon H3 [pHH3] utspädd 1: 400).
Obs: För primära antikroppar uppvuxen i get, använda PBT utan serum. - Tvätta hindbrains vid 4 ° C 5 x med PBT för 1 h varje.
- Inkubera hindbrains övernattning på 4 ° C i PBT som innehåller lämpliga fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar (t.ex., get anti-kanin Alexa Fluor 488) på 1: 200 i PBT riktade mot de primära antikroppar används. Håll hindbrains i mörkret här på att skydda fluorophores från fotoblekning.
Obs: För primära antikroppar uppvuxen i get, använda anti get Fab fragment av sekundära antikroppar för att minska icke-specifik färgning. - Tvätta hindbrains vid 4 ° C 5 x med PBT för 1 h varje.
- Postfix i hindbrains i 4% formaldehyd i PBS för 15 min vid RT för långsiktigt bevarande av antikropp bindande. Kort skölj två gånger i PBS.
- Täcka ett glas objektglas med två lager svart eltejp och punktskatt ett litet torg från de lager tejpen för att skapa en ficka som är stor nog att rymma en hindbrain.
- Överföra varje hindbrain i en ficka med en Pasteur-pipett, ta bort överflödig vätska och lägga till ett lämpligt antifade reagens i fickan innan täcker det långsamt med ett täckglas att undvika svällning luftbubblor under täckglaset. Försegla täckglaset och fästa den på bilden med ett tunt lager av nagellack. Lagra bilden vid 4 ° C i mörker tills bild förvärvandet (Protocol avsnitt 7).
5. Vibratome snittning och flytande avsnitt immunofluorescens
- Om så krävs, rehydrera hindbrains från metanol som beskrivs i steg 4.1.
- Bädda in hindbrains i smält 3% w/v-agaros som beretts i destillerat vatten.
Obs: Låt smälta agarosen svalna till cirka 55° C kort för inbäddning för att förhindra värmeskador hindbrain. - Skär tvärgående hindbrain sektioner till en tjocklek av 70 µm med hjälp av en vibratome. Överföra varje nyklippt avsnitt med en pensel i ett väl 24-well platta innehållande iskall PBS.
- Etikett i flytande avsnitt som beskrivs i steg 4.2-4.7, men ändra stegen som följer: tvätta den flytande avsnitt vid 4 ° C 3 x med PBT för 15 min varje, minska inkubationstiden för sekundära antikroppar till 2 h och inkubera i sekundär antikropp på RT.
- Alternativt efter märkning med antikroppar för andra epitoper som beskrivs i steg 5,4, upptäcka EdU+ kärnor med en EdU märkning kit enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera i flytande avsnitt i reaktionen cocktail under 30 minuter vid 37 ° C i mörker. Tvätta hindbrain avsnitten vid 4 ° C 3 x med PBT för 15 min varje.
- Alternativt efter märkning för andra epitoper som beskrivs i steg 5,4, upptäcka BrdU+ kärnor enligt följande.
- Inkubera flytande sektioner i 2 N saltsyra vid 37 ° C i 30 min i mörker.
- Inkubera flytande sektioner i 0,1 M natriumborat buffert pH 8.5 två gånger för 5 min varje på RT i mörkret för att neutralisera saltsyra.
- Tvätta flytande avsnitten 3 x kort i PBS vid 4 ° C.
- Utföra immunofluorescens märkning för BrdU som beskrivs i steg 5,4.
- Inkubera flytande avsnitten för 2 min på RT i 10 µg/mL 4', 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI) i PBS till motfärg cellkärnor.
- Postfix avsnitten flytande i 4% formaldehyd i 15 min på RT.
- Tvätta flytande sektioner kort i PBS. Noggrant överföra flytande sektioner till ett objektglas av glas med hjälp av en pensel. Torka upp överflödig PBS runt avsnittet använda läskpapper eller vävnad.
- Montera avsnitt långsamt med 80% glycerol i PBS och täck med ett täckglas för att undvika svällning luftbubblor. Lagra bilden vid 4 ° C i mörker tills bild förvärvandet (steg 7).
6. kryostaten snittning och Cryosection immunofluorescens märkning
- Om så krävs, rehydrera hindbrains från metanol som beskrivs i steg 4.1.
- Inkubera hindbrains i 30% w/v sackaros i PBS att cryoprotect hindbrains före frysning.
Obs: Hindbrains är redo för frysning när de har sjunkit till botten av röret, vilket vanligtvis tar ≤ 2 h för e9.5-10.5 hindbrains och 3-6 h för e11.5-13,5 hindbrains. - Doppa hindbrains i optiska skärtemperatur förening (ULT) och frysa snabbt genom att överföra formar innehållande hindbrains i okt till isopentan kyls till mellan-40 ° C och -50 ° C på torris.
Obs: Frysta, inbäddade hindbrains kan förvaras vid-20 ° C kort och -80 ° C lång sikt tills snittning. - Skär tvärgående hindbrain sektioner till en tjocklek av 10 µm med hjälp av kryostaten och överföring till elektrostatiskt självhäftande objektglas.
Obs: Hindbrain kryosnitt kan förvaras vid-20 ° C kort och -80 ° C lång sikt tills märkning. - Odling av objektglas på RT för 15 min torka sektioner till bilderna. Tvätta kryosnitt med PBS till lös OCT och markera en hydrofoba barriär runt kryosnitt använder en PAP-penna. Upprepa steg 5,4-5,8.
- Upprepa steg 5.10 använda en polyvinyl alkohol-baserade monteringsmedium i stället för glycerol.
7. bild förvärv
- Bild exempel med en epifluorescerande eller confocal laserskanning Mikroskop utrustade med linser lämpar sig för vattenhaltiga media-monterade diabilder och optiska filter som är lämpliga för den fluorophores som används för immunolabeling.
- För att bild hela hindbrain eller hindbrain avsnitts, använda ett objektiv för 10 x förstoring (t.ex., figur 2B); för att visualisera hindbrains områden för kvantifiering, Använd en 40 X förstoring (t.ex., figur 2D) och för att visualisera enskilda celler, använda en lins med en 63 x förstoring (t.ex., figur 2 c).
8. alternativa metoder
- Efter steg 3.8, homogenisera ofixerade hindbrains för att producera en enda cellsuspension för flödescytometri program15.
- Efter steg 3.8, homogenisera ofixerade hindbrains extrahera RNA från enda cellsuspensioner för RT-qPCR (t.ex., 16).
Anmärkning: Se till att alla reagenser och utrustning hålls sterila och RNase-gratis i hela att förhindra nedbrytning av RNA. - Efter steg 3.8, homogenisera ofixerade hindbrains för att isolera NPC och sprida dem i vitro som neurospheres för analys av hindbrain NPC beteende17.
Anmärkning: Se till att alla reagenser och utrustning hålls sterila att förhindra bakterier/svamp kontaminering av neurosphere kulturer.
Representative Results
Detta avsnitt visar exempel på resultat som kan erhållas när man studerar neurogenes i mus embryonala hindbrain genom wholemount och vävnaden avsnitt analys.
Vi visar att wholemount immunolabeling av microdissected hindbrain med en antikropp för den mitotiska markör pHH3 visualiserar att dividera NPCs i VZ (figur 2B – D). Vi visar pHH3+ NPC vid hög förstoring att belysa olika stadier av Mitos (figur 2 c). Vi har illustrerat som denna märkning metod är lämplig ska utföras över flera på varandra följande stadier av hindbrain utveckling att följa tidsförloppet för NPC Mitos i detta organ (figur 2D).
Vi visar att imaging tvärgående immunolabeled vibratome delar av bakhjärnan 1 h efter EdU injektion, visualiserar klyvning orientering av mitotiska NPC (figur 3B), mönstret pseudostratified, interkinetic nukleära migrering av cykling föräldraparets18 (figur 3B, D), och den övergripande VZ strukturen (figur 3B – D). Observera att mitotiska pHH3+ NPC är närvarande endast vid ventrikulära ytan och inte mer basally (figur 3 c), som kontrasterar den basala division mönstret av mer engagerad NPCs i framhjärnan19.
Vi illustrerar också hur cykling NPC och deras differentierade avkomma kan märkas med BrdU eller EdU att bedöma NPC härstamning progression (figur 4). Immunolabeling av tvärgående kryosnitt av mus hindbrain 1 dag efter BrdU injektion för BrdU och Ki67visar antal och placering av cykling NPCs i neuroepithelium (figur 4A, B), whereby numrera av själv förnya NPC kan definieras genom att beräkna procentandelen av Ki67+ BrdU+ celler bland alla BrdU+ celler (figur 4A, C).
Slutligen visar vi ett exempel på immunolabeling av hindbrain vibratome sektioner för RC2, antigen i neurala-specifika mellanliggande glödtråden nestin, för att visualisera NPC endfeet (figur 5B) och processer (figur 5 c). Vibratome sektioner, snarare än tunna kryosnitt, tillåta bättre observation av de starkt förgrenade NPC och också av neuroepithelial struktur.
Figur 1 : Nyckel steg i dissektion av en hindbrain från ett e11.5 mus embryo. (A – D) Schematiska skildring av hindbrain lokalt. (A) den kaudala huvud vävnaden tas bort genom att bryta längs de röda streckade linjerna. (B), taket plattan är genomborrad och sedan slets bort i både rostralt och stjärtfenan riktningar längs mittlinjen (vertikal röda linjer) och sedan sidled för att avslöja den hindbrain neuroepithelium. (C), neuroepithelium är pried från hjärnhinnorna efter isättning tången mellan båda strukturer och mitthjärnan och ryggmärg vävnader avlägsnas genom severing vävnaden med hjälp av tången längs de röda streckade linjerna. (D) detta förfarande ger en tillplattad hindbrain. (E–K) Bildinsamling av viktiga skeden i förfarandet hindbrain lokalt. (E), embryot är halshuggas av severing längs den streckade linjen. (F) hindbrain och 4: e ventrikeln, inneslutna av taket plattan, är censurerade och åtskilda från huvudet av severing längs de streckade linjerna. (G) den 4: e ventrikeln är orienterad uppåt innan ett litet hål är genomborrad i taket plattan (asterisk). Hålet vidgas genom peeling vävnaden noggrant både rostrally och caudally längs mittlinjen (pilar) att exponera bakhjärnan. Bakhjärnan är placerade pial sida ner och vänster att vika ut i en öppen bok förberedelse (H; svart pilspets anger hindbrain nervvävnad). Om hindbrain krävs för wholemount immunolabeling, tas pial membranet bort genom att försiktigt bända den hindbrain neuroepithelium från de omgivande meningeal membran med hjälp av tången (jag). Överskott av mellanhjärnan (mb) och ryggmärgen (sc) vävnad är borttagna (streckade linjer i J) att isolera hindbrain (K). Skalstapeln: 500 µm för (E), 300 µm för (F – K). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Wholemount immunolabeling kan användas för att kvantifiera NPC mitoser över bakhjärnan. (A) Schematisk illustrerar sv möta avbildning av mitotiska NPCs i hindbrain ventrikulära lagret. V, ventrikulär hindbrain sida; P, pial hindbrain sida. (B) Confocal kakel scan z bunt e10.5 hindbrain efter wholemount immunolabeling för den mitotiska markör pHH3 (röd). Den vita rutan anger det område som visas på högre förstoring i den andra panelen i (D). (C) före Anaphasen (vit pil) och Anaphasen (svart pilspets) mitotiska är distinguishable inom den totala kohorten naturligtvis mitotiska NPCs. (D) tid av wholemount pHH3 märkning från e9.5-13,5. Skala barer: 500 µm i (B). 20 µm i (C). 100 µm i (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Cykling NPC inom deras germinal zon i rostralt bakhjärnan. (A) Schematisk föreställande mitotiska (grön) och S-fas (röd) NPC hindbrain ventrikulära yta och i området periventrikulär ställning respektive. Ett virtuellt tvärsnitt genom hindbrain visas på högre förstoring till höger. Den svarta pilen anger riktningen för migrering av NPC avkomma som har lämnat cellcykeln mot zonen differentiering. (B) Confocal z stack i en flytande e11.0 hindbrain avsnitt från ett embryo som fick en 1 h EdU puls; immunolabeling för pHH3 och EdU användes för att visualisera mitotiska (grön) och S-fas (röd) NPC, respektive. Hindbrain ytor betecknas av streckade linjer; V, ventrikulär hindbrain sida; P, pial hindbrain sida. Området anges med en vit ruta visas i högre förstoring i infällt; pilarna visar klyvning plan en NPC i Anaphasen, i förhållande till ventrikulära ytan. (C) enda kanal visar pHH3 immunolabeling bara. Mitotiska NPC indikeras av cyan pilspetsar; brist på basal divisioner indikeras av Δ. (D) enda kanal visar EdU märkning endast. EdU+ NPC anta en pseudostratified distributionen på grund av deras interkinetic nukleära migration. Avståndet som NPC migrera bort från ventrikulära yta kan mätas, som anges med en representativ orange linje. Skala barer: 100 µm (B -D); 10 µm i infällda i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kombinera BrdU med Ki67 märkning att bestämma hindbrain NPC självförnyelse kapacitet. (A) Confocal z stack av en e10.5 hindbrain cryosection efter märkning för Ki67 (grön) och BrdU (röd) efter en 1 dag BrdU puls. Dubbel-positiva celler i zonen ventrikulära är NPC som har införlivat BrdU och fortfarande går genom cellcykeln, indikerat av Ki67 märkning. Andelen av dubbel-märkt celler bland befolkningen BrdU+ representerar procentandelen själv förnya NPCs. (B, C) enstaka kanaler visar Ki67 (B) och BrdU (C) immunolabeling endast. En BrdU+ -cell som saknar Ki67 och därför sannolikt har lämnat cellcykeln indikeras av en cyan pilspetsen i (A,C). Hindbrain ytor betecknas av streckade linjer; V, ventrikulär hindbrain sida; P, pial hindbrain sida. Skalstapeln: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Nestin immunolabeling visualiserar NPC processer och endfeet. (A – C) Immunofluorescens för RC2, som erkänner en epitop på neurala mellanliggande glödtråden nestin, illustrerar NPC morfologi över den hindbrain neuroepithelium. (A) Confocal z stack i en flytande avsnitt från en e11.5 hindbrain efter RC2 immunolabeling; Boxed områden visas på högre förstoring i (B, B', apikala/ventrikulär regionen) och (C, C'; basala regionen). Hindbrain ytor betecknas av streckade linjer; V, ventrikulär hindbrain sida; P, pial hindbrain sida. (B, C) Confocal z travar av boxed områden i (A). enda optiska avsnitten visas i (B', C'), respektive. En NPC apikala endfoot förankrade vid ventrikulära ytan indikeras av en pil i (B'). Enkel- och fasciculated NPC processer indikeras med vita och svarta pilspetsar i (C'), respektive. Skala barer: 100 µm, (A). 25 µm för (B, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver hur du använder mus embryonala bakhjärnan som en modell för att studera mekanismerna för utvecklingstoxicitet neurogenes. Använda en mängd olika immunolabeling metoder, hindbrain NPC kan visualiseras och deras antal kvantifieras i vävnadssnitt eller över organ wholemounts. Förenklar dissektion och platt anatomi säkerställer att hindbrain kan avbildas i en 'öppen bok' förberedelse att samla information om orgel-wide neurogenes mönster.
Vi visar vidare att NPC morfologi och cellcykeln-relaterade NPC positionering enkelt kan visualiseras i flytande- eller kryosnitt av bakhjärnan. Båda beteenden kan utnyttjas för att definiera nya stamceller populationer, som tidigare har fullgjorts i däggdjur telencephalon20. Till exempel tidig-bildade Sox2+ neuroepithelia och Pax6+ apikala radiella glia är närvarande i hindbrain21,22, men hindbrain saknar Tbr2+ basala föräldraparets3 .
Protokollet beskrivs här kan också anpassas till observera beteendet hos specifika NPC subpopulations av fluorescerande märkning för levande imaging eller lineage tracing i fasta vävnader. Detta kan uppnås, till exempel genom att studera hindbrains från möss bära den tamoxifen-inducerbara Sox1-iCreERT2 -transgenens och den Rosa26tdTomato reporter23.
Förutom att förbättra kunskapen om murina neurogenes, kan studera hindbrain belysa i huvudsak relevanta neurogena mekanismer som delas av alla arter, eftersom hindbrain är en mycket hjärnregionen som förväntas vara mer lik mellan ryggradsdjur än framhjärnan.
Som hindbrain neurogenes äger rum över en jämförelsevis kortare tidsfönster än framhjärnan neurogenes23, är det viktigt att överväga behovet av att jämföra tillräckligt iscensatt embryon. Således undviks experimentellt partiskhet genom att räkna och registrera antalet somite par i ett embryo före isolera dess hindbrain. Hindbrain vävnaden själv är bräcklig och pincett ska därför hanteras noggrant när separera hindbrain vävnaden från huvudet mesenchyme och hjärnhinnorna; ett par av 'praktiken körningar' kan därför vara lämpligt innan dissektion av värdefulla embryon är försök. Dessutom bör hindbrains överföras från en tub till en annan med en wide-bore Pasteur-pipett i stället för med pincett för att undvika skador (pipettens öppning kan utvidgas genom att skära av spetsen med ren sax). Slutligen, även om det är ovanligt, omfattningen av EdU/BrdU införlivande i S-fas NPC kan vara variabel, i synnerhet under kort (dvs, 1 h) pulser. För att förbättra märkning, säkerställa att EdU/BrdU löses upp ordentligt innan du laddar lösningen i sprutan och injicera försiktigt in i bukhålan. Fattiga injektioner, som de subkutant från olycka, kommer att resultera i att förlora eller svällning EdU/BrdU lösningen och förhindra att det kommer in i cirkulationen.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Vasiliki Chantzara för att utföra tidsstyrd parningar och personalen i de biologiska resursenhet på den UCL Institute of Ophthalmology för mus djurhållning. Denna studie stöddes av en Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z till CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
