Summary
Bu makalede nasıl fare embriyonik arka beyin bir model olarak tüm organ ve doku bölümü hazırlıklar gelişimsel neurogenesis eğitimi için kullanılabileceğini gösterir.
Abstract
Fare embriyo ön memeli neurogenesis geliştirme sırasında çalışmak için en çok çalışan bir sistemdir. Ancak, son derece katlanmış ön neuroepithelium organ genelindeki neurogenesis modellerini incelemek için wholemount analiz için müsait değildir. Ayrıca, ön neurogenesis mekanizmaları tanımlama mutlaka neurogenesis beynin diğer bölümlerinde akıllı değildir; Örneğin, ön özgü progenitör alt türlerinden varlığı nedeniyle. Fare arka beyin wholemount analiz yanı sıra doku bölümler kronolojik zamanmekansal dağıtım ve sinirsel ataları davranışını gözlemlemek için mükellef embriyonik neurogenesis eğitim için alternatif bir model sağlar. Ayrıca, kolayca hücre izolasyon ya da moleküler biyoloji analiz gibi aşağı akım diğer uygulamalar için kesmiştim. Fare arka beyin kolayca çok sayıda hücre lineage muhabir ve kullanılabilir hale gelmiştir mutant fare suşları için analiz edilebilir gibi bir memeli gelişimsel neurogenesis hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışmak için güçlü bir model sunuyor organizma. Burada, fare embriyo arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli nöral progenitör hücre (NPC) davranışını analiz etmek için kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.
Introduction
Embriyonik memeli geliştirme sırasında ventrikül (VZ) ve subventricular (SVZ) bölgeleri genişleyen neuroepithelium 'neurogenesis' olarak adlandırılan bir süreç içinde yeni sinir hücreleri oluşturmak için NPCs bölün. Daha az diğer bölgelerde bu işlem hakkında bilinen iken üretimi kendi NPC öncüleri ve yeni nöronlar ön1' de, kapsamlı soruşturma.
Ön anlama neurogenesis desenler arasında tüm organ zorlu yapan histolojik yöntemlerle doku kesit sonra büyük ölçüde okudu bir karmaşık ve girift katlanmış yapısıdır. Ayrıca, ön neurogenesis çalışmaların diğer beyin bölgeleri veya spinal kord Nörojenik davranışının mutlaka akıllı değildir. Örneğin, farklı CNS bölgeler arasında farklı yanıt Temin ipuçlarını gibi silier Nörotrofik faktör ve lösemi inhibitör faktörü söz konusu olduğunda sinyal, hangi kendini-NPCs yenilenmesi yanal ganglionic Hazretleri, ancak sürücü teşvik spinal kord ataları2farklılaşma. Ayrıca, gelişmekte olan ön doldurmak ve serebral korteks1 genişlemesi için önemli ölçüde katkıda NPCs bir alt sınıfı yok arka beyin ve omurilik3. Ters, spinal kord ve arka beyin korteks yok alternatif NPC alt türlerini içeren akla yatkın.
Fare embriyo arka beyin memeli beynin evrimsel en eski bölgesi ve serebellum ve beyin sapı oluşturur. Türler arasında onun koruma rağmen nispeten az NPC alt türlerinden veya kendi mevzuatı da dahil olmak üzere arka beyin neurogenesis hakkında bilinir. Arka beyin araştırma fare çoğunluğu doku segmentasyon, Hox genleri4ve sonrası Mitotik nöronlar5desenlendirme tarafından tahrik işlem üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, arka beyin bir model olarak gelişimsel angiogenez6mekanizmaları eğitim için kullanılmıştır.
Fare arka beyin aksine, Zebra balığı arka beyin yoğun NPC farklılaşma ve omurgalı model organizma (örneğin,7,8) ilerlemesinde soy takip etmek kullanılmıştır. Piliç arka beyin aynı zamanda omurgalı geliştirme sırasında (örneğin,9,10) neurogenesis çalışmaya istihdam edilmiştir. Zebra balığı arka beyin11benzer, piliç arka beyin NPC davranış ve yönetmelik saat12üzerinde çalışmaya görüntülü canlı olabilir. Çünkü onlar geliştirmek yanında canlı düşsel benzer boyuna gözlem memeli canlılar arasında şu anda mümkün değildir rahimde. Ayrıca, manipülasyon teknikleri ile elektroporasyon kolayca evrimleşmiş Zebra balığı embriyo veya civciv embriyo ovo içinde (örneğin,13) için uygulanabilir, ama böyle teknikleri de daha içinde zor gibi hedef Rahim.
Yine de, fare embriyo arka beyin zarif neurogenesis yöneten moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için uygundur. İlk olarak, fare arka beyin analizini birçok durumda daha insanlar gelişmeler için bundan daha düşük omurgalılar eğitim yoluyla elde edilen ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, çok sayıda genetiği değiştirilmiş fare suşları kullanılabilir ya kader fare NPCs eşleme için veya düzenleyici mekanizmaları ile ilgili genlerin kurucu veya koşullu mutant gen değiştirmek için kullanılabilir. Son olarak, bu son zamanlarda o mikroenjeksiyon gösterilmiştir ventrikül arka beyin ataları ex vivo arka beyin NPC Kinetik14kısa en az bir inceleme sağlar. Henüz, şu anda çok az arka beyin NPCs bütün organ bağlamda davranışını ve kronolojik zamanmekansal organizasyon hakkında bilinir.
Burada, biz arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli NPC davranışını analiz etmek için güçlü bir model olarak kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem göstermek. Daha fazla immunolabeling farklı neurogenesis parametreleri eğitim süreci arka beyin örnekleri daha fazla nicel transkriptaz (qRT) gibi aşağı akım moleküler uygulamalar için kullanılacak iletişim kurallarını sağlamak-PCR.
Protocol
Tüm hayvan çalışma İngiltere'de İçişleri Bakanlığı ve yerel etik kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Özet adımları ve zamanlama
- Zamanlanmış matings yetişkin farelerin embriyonik gün (e) 9,5-e13.5 gebelik elde etmek için soruşturma altında biyolojik soruyu cevaplamak uygun bir yük gerçekleştirmek; 12-15 gün gerektirir.
- İsteğe bağlı olarak 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) hazırlamak / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) çözüm ve enjeksiyon (iletişim kuralı Bölüm 2); gerektirir ~ 1 h bir gün önce veya EdU/BrdU etiketleme istenilen uzunluğa göre embriyo yalıtım günü.
- Gerçekleştirmek embriyo yalıtım ve arka beyin diseksiyon (iletişim kuralı Bölüm 3); gerektirir ~ 10 dk/embriyo.
- (İletişim kuralı Bölüm 4) etiketleme wholemount ayirt gerçekleştirmek; 3 gün gerektirir.
- Bir vibratome kullanarak bölüm ve kayan bölüm ayirt (iletişim kuralı Bölüm 4) etiketleme gerçekleştirmek: 2 gün gerektirir.
- Bir cryostat kullanarak bölüm ve ayirt cryosections (iletişim kuralı Bölüm 5); etiketleme gerçekleştirmek 2 gün gerektirir.
2. enjekte hamile kadın fare BrdU veya EdU (isteğe bağlı)
- BrdU veya EdU steril fosfat tamponlu tuz (PBS) konsantrasyonları 10 mg/mL ve 1 mg/mL, içinde sırasıyla geçiyoruz.
Dikkat: BrdU ve EdU are zehirli; uygun koruma giymek. - Hamile fare tartmak ve 100 mg/kg BrdU ulaşmak için yönetilen BrdU veya EdU çözüm hacmi hesaplamak veya 5 mg/kg EdU.
- Mayi rota üzerinden BrdU veya EdU çözüm embriyolar etiketleme gerekli uzunluğu bağlı olarak toplama önce her iki 1 s veya 1 gün enjekte.
Not: 1 h için etiketleme S fazlı arka beyin hücreleri görüntüler. 1 gün için etiketleme arka beyin NPCs döl görüntüler.
3. Hindbrains e9.5 - e13.5 fare embriyo gelen diseksiyon
- Zaman aşımına uğradı-hamile bir kadın fare gerekli gebelik aşamasında (örneğin, servikal çıkığı) etik onaylanmış bir yordam kullanarak ötenazi. Keskin makas kullanırken, Periton boşluğuna ikiye ayıracağım ve dikkatli bir şekilde rahim tüketim. Embriyo bir 60 mm plastik tabak içine 20 mL buz gibi PBS içeren içeren eksize rahim yerleştirin.
Not: Aseptik teknik gerekli değildir. - Tüm daha fazla diseksiyon diseksiyon mikroskop kullanarak gerçekleştirin. Saatçi forseps sayı 5 kullanarak, embriyoların ortaya çıkarmak, göbek kordonu kesilmesinin tarafından her embriyo bırakın ve sarısı sac kaldırmak için rahim kas duvar gözyaşı.
- Steril bir Pasteur pipet wide-sıkıcı açılış ile kullanarak, buz gibi PBS ile temiz plastik bir çanak içine her embriyo transfer.
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, kafa (şekil 1E) sever.
- İsteğe bağlı olarak, küçük bir parça genomik DNA izolasyon ve sonraki Genotipleme için (örneğin, bir yumurta sarısı sac veya yaklaşık 2 mm kuyruk ucu ¼) doku korumak.
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, paralel ve hemen altında yüz ve ön dokudan (şekil 1F) ayırmak için arka beyin neuroepithelium arka beyin içeren doku tüketim.
- Kaudal baş doku dorsal yan ve arka beyin yukarı getirin ve bir ince bir doku tabakası (çatı plaka) kaplı 4th ventrikül tanımlamak. Dikkatle saatçi forseps sayı 55 (şekil 1G) kullanarak çatı plaka işlemek ve forseps, rostrally orta çizgi orta üzerinde hareket ile dış görev aşırı doku soyma ve arka arka beyin ve spinal kord (şekil 1G bitti caudally ); Arka beyin şimdi bir açık kitap hazırlık (şekil 1 H) maruz.
- Hindbrains wholemount immunolabeling (seçenek 1) için hazır olun.
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, dikkatli bir şekilde uzak kalan baş Mezenşim ve forseps (şekil 1I) kullanarak arka beyin pial tarafına bağlı herhangi bir meninkslerde tease. Orta ve spinal kord doku (şekil 1J) sadece arka beyin doku (şekil 1 K) bırakmak çıkarın.
Not: girişimde büyük olasılıkla arka beyin neuroepithelium zedeleyecek çünkü bu adım yordam e9.5 veya e10.5, izlenmesi gereken değil; Arka beyin neuroepithelium immunolabeling antikor verimli nüfuz izin vermek için bu aşamada yeterince ince olduğundan Ayrıca, meninkslerde kaldırma gerekli değildir. Bu adım gerekir, ancak, meninjeal doku birleştirir, antikor penetrasyon arka beyin neuroepithelium içine geliştirmek için zaman ileriye doğru e11.5 takip edilebilir. Diseksiyon buz gibi PBS (kullanım temiz PBS için her arka beyin) gerçekleştirildiğinde en kolay yoldur.
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, dikkatli bir şekilde uzak kalan baş Mezenşim ve forseps (şekil 1I) kullanarak arka beyin pial tarafına bağlı herhangi bir meninkslerde tease. Orta ve spinal kord doku (şekil 1J) sadece arka beyin doku (şekil 1 K) bırakmak çıkarın.
- Vibratome ve cryosectioning (seçenek 2) için hindbrains hazırlamak
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, orta ve spinal kord doku (şekil 1J) kaldırın.
Not: Mezenşim ve hindbrains ( şekil 1Iiçinde gösterildiği gibi) kesit için amaçlanan meninkslerde kaldırmak için gerekli değildir.
- Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, orta ve spinal kord doku (şekil 1J) kaldırın.
- Hindbrains plastik tabak Pasteur pipet kullanarak yuvarlak popolu 2 mL tüpler için transfer tüm PBS Aspire edin ve saptamak için nazik-ajitasyon olarak PBS içinde çözünmüş taze çözdürülen % 4 w/v formaldehit ile 4 ° C'de 2 h.
Uyarı: Toksik formaldehit; uygun koruma giymek. - Hindbrains 3 x kez PBS ile yıkayın. İmmunolabeling 2-3 gün içinde başlar veya % 100 metanol-20° c de daha uzun depolama için aktarmadan önce % 50 methanol/50% PBS 5 min için PBS yerine PBS 4 ° C'de depolayın
4. Wholemount ayirt
- Gerekirse, seri olarak, oda sıcaklığında (RT) 5 min için PBS (örneğin, % 75 metanol, % 50 metanol, % 25 metanol) olarak metanol dilutions azaltma içinde hindbrains suyla temasa ve sonra PBS için transfer.
Not: Metanol kademeli bir dizi yavaşça hindbrains suyla temasa ve uygun doku koruma sağlamak için gereklidir. - Hindbrains % 0.1 içeren PBS 4 ° C'de 30 dk permeabilize nazik ajitasyon ile Triton X-100 (PBT).
- Hindbrains % 10 ısı inaktive keçi serum nazik ajitasyon ile içeren PBT 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
Not: ikincil antikor olarak yetiştirildik ana bilgisayar türlerden serum kullanın. Birincil antikorlar keçi, yükseltilmiş kuluçkaya için serum-serbest protein blok, örneğin % 5 sığır serum albümin PBS veya uygun bir ticari alternatif ( Tablo malzemelerigörmek). Bu non-spesifik birincil antikorlar keçi kaldırdı kullanırken sık sık gözlenen boyama azaltacaktır. - Hindbrains gecede 4 ° C'de % 1 ısı inaktive serum ve nazik ajitasyon ile birincil antikorlar içeren PBT içinde kuluçkaya (örneğin, tavşan anti-fosfo Histon H3 [pHH3] 1: 400 seyreltilmiş).
Not: keçi kaldırdı birincil antikorlar için serum PBT kullanın. - Hindbrains 4 ° C'de 5 yıkama PBT ile x 1 h için.
- Hindbrains gecede 4 ° C'de uygun fluorophore Birleşik ikincil antikorlar (örneğin, keçiyi Anti-tavşan Alexa Fluor 488), 1: 200 kullanılan birincil antikorlar karşı hedeflenen PBT içinde içeren PBT içinde kuluçkaya. Karanlıkta hindbrains buradan photobleaching fluorophores korumaya devam et.
Not: keçi kaldırdı birincil antikorlar için non-spesifik boyama azaltmak için ikincil antikorlar Anti-keçi Fab parçaları kullanın. - Hindbrains 4 ° C'de 5 yıkama PBT ile x 1 h için.
- PBS içinde % 4 formaldehit antikor bağlama uzun vadeli korunması için RT, 15 dakika içinde hindbrains sonek. Kısa bir süre içinde iki kez PBS durulayın.
- Bir cam mikroskop kaymak siyah Elektrik bandı iki kat ile kapak ve küçük bir kare bir arka beyin alacak kadar büyük bir cep oluşturmak için katmanlı kasetteki tüketim.
- Pasteur pipet ile bir cep içine her arka beyin transfer, aşırı sıvı kaldırın ve bunu yavaş yavaş kapsayan önce bindirme hava kabarcıkları coverslip altında önlemek için bir cam coverslip ile cep için uygun bir antifade reaktif ekleyin. Coverslip mühür ve ince bir tabaka halinde oje içeren yapıştırmayın. Slayt 4 ° C'de karanlık resim alma (iletişim kuralı Bölüm 7) kadar saklayın.
5. Vibratome kesit ve bölüm ayirt kayan
- Gerekirse, hindbrains metanol üzerinden 4.1 adımda anlatıldığı gibi suyla temasa.
- Hindbrains hazırlanan distile suda erimiş % 3 w/v özel katıştırın.
Not: kısa bir süre için arka beyin ısı hasarı önlemek için gömme önce yaklaşık 55 ° C soğutmak erimiş özel izin. - Enine arka beyin bölümleri bir vibratome kullanarak 70 µm kalınlık için kesti. Taze kesilmiş her bölüm bir boya fırçası ile buz gibi PBS içeren bir 24-şey plaka bir kuyunun içine aktarın.
- 4.2-4.7, adımlarda açıklandığı gibi kayan bölümler etiket ama adımları aşağıdaki gibi değiştirin: yıkama kayan 4 ° C'de 15 dakika her biri, ikincil karşı antikorlar için 2 h kuluçka zamanı azaltmak ve RT., ikincil antikor kuluçkaya kadar PBT ile 3 x bölümleri
- İsteğe bağlı olarak, diğer epitopları için antikorlar ile 5.4 adımda anlatıldığı gibi etiketleme sonra EdU+ çekirdeği kiti üreticinin talimatlarına göre etiketleme bir EdU kullanarak bulmak. Karanlıkta 37 ° C'de 30 dk için kokteyl tepki kayan bölümlerde kuluçkaya. Yıkama arka beyin 4 ° C'de 15 dakika PBT ile 3 x bölümleri.
- İsteğe bağlı olarak, diğer epitopları için 5,4 adımda anlatıldığı gibi sonra etiketleme, BrdU+ çekirdeği aşağıdaki gibi algılamak.
- Karanlıkta 30 dk 37 ° C'de 2 N hidroklorik asit kayan bölümlerde kuluçkaya.
- Yüzen iki kez 5 min için her RT, hidroklorik asit nötralize etmek için karanlıkta 0.1 M sodyum Borat tampon pH 8,5 bölümlerde kuluçkaya.
- Kayan bölümlerde 3 x kısaca PBS 4 ° C'de yıkama
- 5.4. adımda açıklandığı gibi BrdU için etiketleme ayirt gerçekleştirin.
- RT, 2 min 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) hücre çekirdeği counterstain için PBS için kayan bölümler kuluçkaya.
- %4 formaldehit RT., 15 dk için kayan bölümlerde postfix
- Kayan bölümlerde kısaca PBS yıkayın. Dikkatle kayan bölümler bir fırça kullanarak cam mikroskop kaymak aktarın. Bloting kağıt veya doku kullanarak bölümü çevresinde aşırı PBS kadar paspas.
- % 80 gliserol PBS ve kapak cam coverslip ile yavaş yavaş bindirme hava kabarcıklarını önlemek için kullanma bölümlerine bağlayın. Slayt 4 ° C'de karanlık resim alma (7. adım) kadar saklayın.
6. cryostat kesit ve Cryosection ayirt etiketleme
- Gerekirse, hindbrains metanol üzerinden 4.1 adımda anlatıldığı gibi suyla temasa.
- Hindbrains cryoprotect hindbrains önce dondurma için PBS içinde % 30 w/v Sükroz kuluçkaya.
Not: Hindbrains onlar genellikle ≤ 2 h alır tüpü dibine battı zaman dondurma için hazır e9.5-10,5 hindbrains ve e11.5-13,5 hindbrains için 3-6 h için. - Hindbrains optik kesim sıcaklık bileşik (OCT) daldırın ve hızlı bir şekilde hindbrains için kuru buz-50 ° C-40 ° C arasındaki soğutmalı isopentane Ekim içeren kalıplar aktararak dondurma.
Not:-20 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli kesit kadar-80 ° C dondurulmuş, katıştırılmış hindbrains saklanır. - Enine arka beyin bölümleri bir cryostat ve transfer Elektrostatik yapışkanlı mikroskop slaytlara kullanarak 10 µm kalınlığında kesilmiş.
Not: Arka beyin cryosections-20 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli etiketleme kadar-80 ° C saklanır. - Slaytları slaytlar bölümlerine kuru RT 15 dakika, kuluçkaya. Cryosections PBS ile yıkayın erime OCT ve mark hidrofobik bir engel etrafında bir PAP kalemi cryosections. 5.4-5,8 adımları yineleyin.
- 5.10 polivinil alkol bazlı montaj orta gliserol yerine kullanarak adımları yineleyin.
7. resim alma
- Bir epifluorescent veya confocal lazer tarama mikroskop lâyık Sulu ortam takılı slaytlar ve optik filtreler immunolabeling için kullanılan fluorophores için uygun lensler ile donatılmış kullanarak resim örnekleri.
- Bütün arka beyin veya bir arka beyin bölümü görüntü için bir lens kullanmak için 10 x büyütme (örneğin, şekil 2B); miktar için hindbrains alanları görmek için bir 40 X büyütme (örneğin, şekil 2B) ve tek tek hücreler görselleştirmek, (örneğin, resim 2C) 63 x büyütme ile bir lens kullanmak için kullanın.
8. alternatif yöntemler
- Adım 3.8, bir tek hücre süspansiyon Akış Sitometresi uygulamaları15için üretmek için sabitlenmemiş hindbrains homojenize.
- Adım 3.8 RNA tek hücre süspansiyonlar RT-qPCR için (örneğin, 16) ayıklamak için sabitlenmemiş hindbrains homojenize.
Not: steril ve RNase içermeyen boyunca RNA'ın yıkımı önlemek için tüm reaktifler ve ekipman tutulur emin olun. - Adım 3.8, NPCs yalıtmak ve onları vitro olarak neurospheres arka beyin NPC davranış17çözümlenmesi için yaymak için sabitlenmemiş hindbrains homojenize.
Not: tüm reaktifler ve ekipman neurosphere kültürlerin bakteriyel/mantar kontaminasyonu önlemek için steril tutulur emin olun.
Representative Results
Bu bölümde wholemount ve doku bölüm analizi ile fare embriyonik arka beyin neurogenesis okurken elde edilebilir sonuçlar örnekleri gösterilmektedir.
Mitotik işaret pHH3 ( - 2B şekil D) VZ NPCs bölme görüntüler için microdissected arka beyin bir antikor ile o wholemount immunolabeling gösteriyoruz. Biz pHH3 göstermek+ NPCs mitoz (şekil 2C) farklı aşamalarında vurgulamak için bir yüksek büyütmede. Bu etiketleme yöntemi çeşitli ardışık gelişimin bu organ (şekil 2B) NPC mitoz zaman Elbette gözlemlemek için arka beyin arasında yapılması uygun olan resimli.
EdU enjeksiyon sonra enine immunolabeled vibratome bölümleri 1 h arka beyin görüntüleme Mitotik NPCs (3B rakam), Bisiklet pseudostratified, interkinetic nükleer geçiş desen bölünme yönünü görüntüler göster ataları18 (şekil 3B, D) ve genel VZ yapı (şekil 3B - D). O Mitotik pHH3 Not+ NPCs sadece ventrikül yüzeyde mevcut ve değil daha basally (şekil 3 c), hangi tezat ön19daha kararlı NPCs Bazal bölünme desen.
Biz de nasıl NPCs ve farklılaştırılmış onların döl Bisiklete binme BrdU EdU ile NPC lineage ilerleme (şekil 4) değerlendirmek için denetimin etiketi veya göstermektedir. Fare arka beyin 1 gün sonra BrdU enjeksiyon BrdU ve Ki67 enine cryosections immunolabelingsayı ve NPCs neuroepithelium (şekil 4A, B), mademki sayısını Bisiklete binme ve konumlandırma gösterir NPCs kendini sürekli yenileyen tanımlanabildiği Ki67 yüzdesi hesaplayarak+ BrdU+ hücreleri tüm BrdU+ hücreleri (4A rakam, C) arasında.
Son olarak, biz RC2, testin NPC endfeet (şekil 5B) ve süreçleri (şekil 5C) görselleştirmek için özel sinirsel ara filaman bir antijen immunolabeling arka beyin vibratome bölümlerin örneği gösterilmektedir. İnce cryosections, yerine Vibratome bölümleri gelişmiş gözlem çok dallı NPCs ve aynı zamanda genel neuroepithelial yapı sağlar.
Resim 1 : Anahtar adımlar bir arka beyin diseksiyon içinde e11.5 fare embriyonun. (A - D) Arka beyin mikrodiseksiyon şematik gösterimi. (A) Kaudal baş doku kırmızı noktalı çizgiler kesilmesinin tarafından kaldırılır. (B) çatı plaka deldi ve uzak (dikey kırmızı çizgiler) orta çizgi boyunca rostral ve Kaudal yönlerde yırtık ve daha sonra yanal arka beyin neuroepithelium ortaya çıkarmak için. (C) neuroepithelium her iki yapıları arasında forseps ekledikten sonra uzak meninkslerde oradayken ve orta ve omurilik doku kırmızı noktalı çizgiler boyunca Forseps ile doku kesilmesinin tarafından kaldırılır. (D) bu yordamı düzleştirilmiş bir arka beyin verir. (E-K) Görüntü yakalama arka beyin mikrodiseksiyon yordamdaki anahtar aşamaları. (E) embriyo noktalı çizgi kesilmesinin tarafından kafası. (F) arka beyin ve çatı plaka, içine 4th ventrikül varlığına ve noktalı çizgiler kesilmesinin tarafından başından ayrılmış. Çatı plaka (yıldız işareti) küçük bir delik delinmiş önce (G) 4th ventrikül yukarı doğru odaklı vardır. Delik doku dikkatle hem rostrally hem de caudally arka beyin ortaya çıkarmak için orta hat (oklar) peeling tarafından genişletilmiş. Konumlandırılmış pial yüzü aşağı ve dışarı bir açık kitap hazırlığı kapağı sol arka beyin olduğunu (H; siyah ok ucu arka beyin sinir dokusu gösterir). Arka beyin wholemount immunolabeling için gerekliyse, pial membran hafifçe arka beyin neuroepithelium forseps (Ben) kullanarak çevredeki meninjeal membranlar üzerinden gözetleyen tarafından kaldırılır. Fazla orta (mb) ve spinal kord (sc) doku olduğunu kaldırıldı (noktalı çizgiler içinde J) (K) arka beyin izole etmek. Ölçek çubuğu: 500 µm (E), (F - K) için 300 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Wholemount immunolabeling-ebilmek var olmak kullanılmış-NPC mitoses arka beyin arasında ölçmek için. (A)şeması tr yüz görüntüleme arka beyin ventrikül katmanındaki Mitotik NPCs gösteren. V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. (B) Confocal kiremit tarama z destesini Mitotik işaret pHH3 (kırmızı) için wholemount immunolabeling takip e10.5 Arka beyin. Beyaz kutu daha yüksek büyütmede (D) ikinci panelinde gösterilen alanı gösterir. (C) ön anafaz (beyaz ok ucu) ve anafaz (siyah ok ucu) Mitotik figürler Mitotik NPCs. (D) saat ders wholemount pHH3 e9.5-13,5 etiketleme toplam kohort içinde ayırdedilebilir. Ölçek çubukları: 500 µm (B); 20 µm (C); 100 µm (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Rostral arka beyin onların germinal bölgesi içinde Bisiklete binme NPCs. Mitotik (yeşil) ve S-faz (kırmızı) NPCs arka beyin ventrikül yüzeyde ve periventriküler alanındaki konumunu sırasıyla tasvir eden(a)şeması. Arka beyin aracılığıyla sanal bir kesit daha yüksek büyütmede sağ tarafta görüntülenir. Siyah oku farklılaşma bölge doğru hücre döngüsü bölgeden çıkış yaptılar NPC döl geçiş yönünü belirtir. (B) Confocal z kayan e11.0 arka beyin bölümünden 1 h EdU nabız alınan bir embriyo yığını; immunolabeling pHH3 ve EdU Mitotik (yeşil) ve S-faz (kırmızı) NPCs, sırasıyla görselleştirmek için kullanıldı. Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. Beyaz kutu tarafından belirtilen alanı ilave olarak daha yüksek büyütmede görüntülenir; oklar, anafaz, ventrikül yüzeyine göre bir NPC bölünme boyutunda gösterir. (C) tek kanal pHH3 immunolabeling yalnızca görüntüleme. Mitotik NPCs tarafından mavi ok uçları gösterilir; Bazal bölünmeler eksikliği sadece EdU etiketleme görüntüleme Δ. (D) tek kanal tarafından belirtilir. EdU+ NPC pseudostratified dağıtım interkinetic onların nükleer geçiş nedeniyle evlat. Temsil edici bir turuncu çizgiyle belirtildiği şekilde NPCs uzak ventrikül yüzey göç mesafe ölçülebilir. Ölçek çubukları: 100 µm (B -D); 10 µm (B) iç metin içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Arka beyin NPC kendini yenileme kapasitesini belirlemek için Ki67 etiketleme ile birleştirerek BrdU. (A)Confocal z etiketleme Ki67 (yeşil) ve 1 gün BrdU takip BrdU (kırmızı) darbe için sonra bir e10.5 Arka beyin cryosection yığını. Çift-pozitif ventrikül bölgedeki BrdU dahil olması ve hücre döngüsünün hala hareket NPCs Ki67 etiketleme tarafından belirtildiği şekilde hücrelerdir. Çift etiketli hücreleri arasında toplam BrdU+ nüfus oranının kendini yenileyerek NPCs. (B, C) yüzdesini gösterir tek kanal Ki67 görüntüleme (B) ve (C) BrdU immunolabeling sadece. Ki67 yoksun ve bu nedenle büyük olasılıkla hücre döngüsünün çıkıldığı BrdU+ hücrede mavi ok ucu (A,C) simgesiyle gösterilir. Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. Ölçek çubuğu: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Testin immunolabeling görüntüler NPC süreçleri ve endfeet. (A - C) Ayirt bir epitope testin sinirsel ara filaman tanır, RC2 için NPC morfolojisi arasında arka beyin neuroepithelium gösterir. (A)Confocal z RC2 immunolabeling takip e11.5 Arka beyin kayan bir bölümünden yığını; Kutulu alanları içinde daha yüksek büyütmede gösterilir (B, B'; apikal/ventrikül bölge) ve (C, C'; Bazal Bölge). Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. (B, C) Confocal z yığınları kutulu yerlerde (A); Tek optik bölümleri içinde gösterilir (B', C'), anılan sıraya göre. Ventrikül yüzeyde demirlemiş bir NPC apikal endfoot (B') bir okla belirtilir. Tek ve fasciculated NPC süreçleri içinde siyah ve beyaz ok uçları belirttiği (C'), anılan sıraya göre. Ölçek çubukları: 100 µm, (A); 25 µm (B, C) için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı, gelişimsel neurogenesis mekanizmaları incelemek için bir model olarak fare embriyonik arka beyin kullanmayı açıklamaktadır. Farklı immunolabeling yöntemler kullanarak, arka beyin NPCs görüntülenmeyecektir ve doku bölümleri veya organ wholemounts genelinde sayıları sayılabilir. Arka beyin organ çapında neurogenesis kalıpları üzerinde bilgi toplamak için bir 'açık kitap' hazırlık görüntüsü diseksiyon ve düz anatomi kolaylığı sağlar.
Biz daha fazla NPC morfoloji ve hücre döngüsü ile ilgili NPC konumlandırma kolayca içinde yüzen görüntülenmeyecektir olduğunu gösterir-ya da arka beyin cryosections. Her iki davranış daha önce memeli telencephalon20dakika sonra gerçekleştirilen gibi yeni yaratıcı nüfus, tanımlamak için istismar. Örneğin, erken oluşan Sox2+ neuroepithelia ve Pax6+ apikal Radyal glia arka beyin21,22' var, ancak arka beyin Tbr2+ Bazal ataları3 eksik .
Burada açıklanan protokolü de floresan canlı görüntüleme ve/veya sabit dokularda soy izleme için etiketleme tarafından özel NPC altgrupları davranışlarını gözlemlemek için adapte edilebilir. Bu, örneğin, hindbrains üzerinden tamoxifen indüklenebilir Sox1-iCreERT2 transgene ve Rosa26tdTomato muhabir23taşıyan fareler inceleyerek elde edilebilir.
Arka beyin daha fazla benzer olması beklenen son derece korunmuş beyin bölgesi olduğu için fare neurogenesis bilgisine artırmanın yanı sıra, arka beyin eğitim türler arasında paylaşılır geniş ilgili Nörojenik mekanizmaları aydınlatmak ön daha omurgalı türler arasında.
Arka beyin neurogenesis ön neurogenesis23daha nispeten daha kısa bir zaman penceresi üzerinden gerçekleşir gibi yeterince karşılaştırmak için ihtiyaç embriyo sahnelenen dikkate almak önemlidir. Buna göre deneysel önyargı sayma ve onun arka beyin izole önce bir embriyo somite çiftlerinin sayısı kayıt tarafından önlenmiş olur. Arka beyin doku kırılgandır ve forseps bu nedenle dikkatli bir şekilde baş Mezenşim ve meninkslerde arka beyin doku ayıran zaman ele alınmalıdır; değerli embriyo diseksiyon çalıştı önce 'uygulama çalışan' bir çift bu nedenle tavsiye olabilir. Ayrıca, hindbrains bir tüp sizden bir geniş-geçişli Pasteur pipet kullanarak başka bir yerine (pipet'ın açılış genişlemiş ucu kesme tarafından temiz makasla) zarar görmemesi için Forseps ile aktarılmalıdır. Son olarak, her ne kadar nadir, S-faz NPCs içine EdU/BrdU şirketleşme ölçüde değişken, özellikle kısa (Yani, 1 h) darbeleri sırasında olabilir. Etiketleme artırmak için çözüm şırınga yüklemeden önce EdU/BrdU düzgün çözünmüş emin olun ve dikkatle Periton boşluğuna enjekte. Bu subkutan kaza ile yaptığı gibi zavallı enjeksiyonları kaybetme veya EdU/BrdU çözüm bindirme neden ve dolaşımı girmesini önlemek.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarları ya da çakışan ilgi alanları yok.
Acknowledgments
Vasiliki Chantzara zamanlı matings ve fare yetiştiriciliği için Oftalmoloji UCL Enstitüsü biyolojik kaynak birimi personeli dışarı taşımak için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada Wellcome güven Araştırmacı Ödülü 095623/Z/11/Z CR tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F.
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
