Summary
本研究は、手術手順の簡略化と神経電極の絶縁の海綿状の神経刺激を実行する方法について説明します。 海綿静脈洞部圧力測定とシリコーン接着剤を使用して複雑な。
Abstract
海綿神経 (CN) の刺激および海綿静脈洞部の圧力 (ICP) の測定は、テストおよび評価の勃起不全の治療に広範囲に使用されています。ただし、使用される方法によって異なります所、落とし穴がまだ存在します。本研究の目的は、信頼性と再現性のあるモデルを提供する手技を記述するためだった。坐骨結節に挿入、その時点坐骨海綿体筋を公開すると、陰茎の cru は、最小限の郭清と勃起機能に関与する構造への損傷 cannulated でした。持ち上げると、乾燥を必要とせず、CN の繰り返しの刺激電極神経複合体を分離する 125 μ m バイポーラ銀電極と生体適合性のシリコン接着剤を使用して達成されました。このメソッドはストレッチと神経を乾燥を減らすことによって neuropraxia を防ぎ電気的なリークを否定し、代替経路の刺激を防止する神経の完全な分離を提供します。
Introduction
実験動物の勃起機能のin vivo研究はエックハルト1の先駆的な実験的な作品で 1863 年創業。骨盤神経の電気刺激は、犬の増加の ICP を誘導するために使用されました。20 世紀を通して似たような実験的プロトコルは犬、猿、猫、ウサギなどの大型動物で使用されました。ラットにおける勃起機能評価最初 1989年2クインランらによって開発されました。メソッドは以来変更、いくつか他のグループ3の4によって更新されます。今日では、ラットは最も広く勃起不全の病理を勉強し、新たな治療法の選択肢を評価するための動物モデルを使用します。頸動脈, 測定 ICP、陰茎の cru のカニュレーションと CN の刺激の直線を使用して、ICP の増加を誘発する全身の血圧を記録、手続きの主な手順が含まれます。いくつかの研究は、モデルを改良した、再現性、問題が残る場合、変数の結果は、異なる研究室で報告されています。いくつかの落とし穴をまだ保持します。
前の記事5,6,7,8,9,10は、陰茎海綿体のカニュレーションの degloving の完全陰茎露出の使用をについて説明します。これは操作として最適なアプローチではなく、破壊的な郭清は、勃起機能に不可欠な構造に傷害を引き起こします。神経刺激が実験結果に影響を与えることができる複数の要因のために最適ではないが、CN の郭清は記述10、11にしました。CN 刺激の手法は、神経の周りに置き、バイポーラ フック電極上を引っ張ってくると刺激の前に神経を乾燥、周囲の組織から神経を持ち上げる含まれています。これは神経の損傷や電気の漏電、減少応答または代替経路など、骨盤底筋、膀胱の刺激による誘導で虚偽の増加の結果と胃腸の様々 な程度につながることができます。管12。これらすべての要因は、再現性を制限します。
私たちの研究の中に両方の深さと麻酔の種類である ICP に深遠な効果を観察しました。ペントバルビ タール ナトリウム、ケタミン ・ キシラジンまたはケタミン/ミダゾラム注射イソフルラン/酸素吸入、麻酔剤です。
ここで簡略化された手術法を説明、実験的プロトコルの標準化をサポートするためのデータを提供します。
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Protocol
動物は、制度のガイドラインに従って南デンマーク大学動物医療施設に収容されました。ケアと実験動物の使用のための健康の国民の協会ガイドに従ってすべての動物実験を行った。これは、急性、生存非手術です。
1. チューブ、電極、および外科手術用器具の準備
- 次の顕微鏡機器を使用: 外科はさみ、斜めマイクロはさみ、ティッシュ鉗子、デュモン #7 のペアと #5 湾曲したマイクロ鉗子、マイクロ針ホルダーとリトラクター。
注:急性の手順としては、器具を滅菌する必要はありません。使用後は、清掃し、70% のエタノールのヒントを拭いてください。 - 70% エタノールでチューブを浸漬し、滅菌の 0.9% でフラッシュ使用前に 100 U/mL と塩化ナトリウム。空気の泡システムに導入することを避けるために満たされた管を残します。
- ICP 測定用カテーテルをするポリエチレン (PE)-50 チューブの 20-30 cm の長さ部分をカットします。管は湿し水の圧力を減らすためにできるだけ短くを確認します。
- 針が途中で中断されるまで、滅菌 24 G 針サイドにサイドを曲げます。Cru を陰茎に挿入するため PE チューブの遠位端にベベル部分を接続します。他は半分圧トランスデューサーに接続するためのハブに挿入します。ヘパリン生食液 (100 U/mL) システムを入力します。
- バイポーラのテフロン被覆電極をするためには、カット 2 125 μ m 銀は同じ長さにワイヤーします。テーブルの端にワイヤーを接続し、それらをまとめてスレッドのテープの一部を使用します。その後、黒い板に電極を接続します。
- テフロンに小さな切開を行い、#5 マイクロ鉗子を使用する電極の先端をテフロン コーティングの 4-5 の mm 長さ。ヒントをも長さを達成して、メスの刃の鈍端のまわりの端を曲げ、フックを作成するメスで切った
- 上向きフックと黒のプレートの端に少し拡張エンドと電極をテープします。10 s とラップ接着剤バブル電極フックから 1-2 mm のプラスチック板にシリコン接着剤を混ぜます。
- (図 1) を使用する前に約 5 分間乾燥すること。刺激への接続を許可するもう一方の端の長いセクションからテフロンをストリップします。
注:再先端のフックをやって、電極を何回も使用できます。
2. 動物の準備
- 動物を麻酔した後、腹部、首、会陰の下半分を剃る。70% アルコール ポビドン ヨードが 3 回続くと動物をスクラブします。ラットを仰臥位で温水外科パッドに配置します。獣医眼軟膏を適用し、キャリアとして 2.5% イソフルランと 0.8 L/分の酸素と鼻の円錐形に麻酔を切り替えます。
注:イソフルラン麻酔の許容可能なレベルを達成するために酸素のレベルを調整します。
3. 術前準備
- 手術顕微鏡下で全体の手術の手順: 3.15 X から 20 X までの倍率で十分です。手袋を使用し、手術中のクリーンな環境を維持します。ドレープにラットを配置します。
4. 坐骨海綿体筋解離 ICP 測定用
- メス、ストレートのはさみを使用し、デュモン #7: マイクロ鉗子 1 cm を垂直にする陰茎のベースのレベルから開始して、下方 (図 2 a) を拡張する正中皮膚切開 5 mm 外側。Q ティップを使用し、陰嚢 (図 2 b) に横方向の筋膜を慎重に分離します。筋膜を切り裂く後、リトラクターを添付し、坐骨結節 (図 2) を見つけるに綿の先端-スワップで触診。
- 坐骨海綿体筋、可視化されるまでこのポイントの脂肪組織の内側を通して解剖 (図 3 a)。デュモン #7 曲線マイクロ鉗子のペアを使用し、縦筋を分離します。逃げずは、明るい白い構造 (図 3 b) として表示されます。マイクロ鉗子、マイクロはさみを使用して、適切にそのコース (図 3) を参照してくださいに逃げずを公開します。
- システム設定のキャリブレーション後陰茎 cru (図 4) に並列実行されるかどうかを確かめて、会陰部皮膚からチューブを挿入します。場所の行を残して、切開の生理食塩水で潤いを保ちます。
5 刺激に対する CN 郭清
- 2 cm 下げると、正中線、メス、ストレートのはさみおよびマイクロ ピンセットのペアを使用して最初、皮膚を通して腹部切開を確認します。一致する白線に沿って筋膜切開を作成するアルバと基になる筋肉組織、膀胱と前立腺を公開します。
- リトラクターを良い露出を達成するために使用します。綿棒を使用して主要な骨盤神経節 (MPG) 明確に可視化を取得する脂肪組織から前立腺と CN、前立腺 (図 5) の背側面に実行しています。
- Mpg ファイルと CN の可視化後、慎重に斜めマイクロはさみ (図 6 a)、2-5 mm、mpg ファイルに遠位神経を覆う筋膜を切開します。#5 マイクロ鉗子の使用、無料の 4 mm 長い部分 (図 6 b) にそれの下に神経の両側にテイッシュ、神経 (図 6 c) の下で 9-0 縫合糸をスライドさせます。
- バイポーラ電極 (図 7 b) 神経の周りのフックの配置を容易にする縫合 (図 7 a) の助けを借りて、少し神経を昇格させます。アシスタント混在させるインシュリンの先端で 2 液シリコン接着剤神経 5 s. ドライ用の針し、フックと神経 (図 7 c, d) の周辺に接着剤を適用しなさい乾燥して接着剤を許可する約 1 分の電極を少し引いて、神経を高く保ちます。
- 任意の引っ張るか、または電極のねじれを避けるために右側のリトラクターを除いて、リトラクターを削除します。切開を生理食塩水に浸漬と一般の生理食塩水ガーゼで露出した臓器を濡れています。
6. 海綿体 ICP 測定用穿刺
- リトラクターを使用して逃げずの可視化を復元します。Cru を歪めるだろう、坐骨海綿体筋に、リトラクターを接続ことを確認します。
- 針を添付し、逃げずにそれを導入する前にヘパリン生理食塩水でチューブをフラッシュします。保持引き伸ばされ、片方の手でデュモン #7 曲線マイクロ鉗子を使用して逃げず (非利き手)、逃げず、筋肉の残りの部分の挿入点の遠位。ストレート微細鉗子その他の支配的な手で針を保持し、それを導入する海綿体 (図 8) のコースと平行します。
- 5-8 mm 針を海綿体に押し込みます。チューブをフラッシュおよび cru を押して回線 (図 9) をテストします。漏れがないことを確認します。偶発的な線を引いて避けるためテープでテーブルにチューブを固定します。リトラクターを削除します。
7. CN の刺激
- 録画プログラム (例えばスパイク 2) と海綿静脈洞部と平均動脈圧を連続記録を実行しています。
- CN 刺激の刺激 (例えばSD9 草楽器を参照テーブルの材料) の次のパラメーターを設定: 電流 1.5 mA、周波数 16 Hz、3 V で電圧とパルス幅の 1 分の刺激を最小限に抑えて 5 女史適用 50 s刺激間に残り。
注:最初の刺激は通常減少応答 (図 10) になります。
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Representative Results
使用推奨される刺激の設定でこのプロトコルのイソフルラン 2.0% 酸素吸入麻酔下で 0.8 L/分必要があります結果が図 11および図12に示すように、背中合わせに複数があります。75 〜 80 ミリメートル Hg。図 13間刺激応答を示しています同じ安定した応答に 20 分刺激に 73 〜 77 ミリメートル水銀テスト行 ICP 測定で安定してチューブをフラッシングと cru (図 9) で軽くたたくことによって。ベースラインに戻って急速な応答は、うまく配置されたラインの特徴です。逃げずの整合性が破損している (図 14) を刺激するとテストが低いピーク圧力と、フラッシュと、タッピング後ベースラインに戻って遅い応答および減少応答で発生します。また、ヘパリン生理食塩水フラッシュ刺激時の出血とのリークでしょう。
種類と麻酔のレベルだけでなく、酸素の使用は、ICP に大きな影響を与えた。図 15に示しますイソフルランのさまざまなレベルに及ぼす誘導、減らされた応答と少ない安定した高原。イソフルレンで 2%、複数 78 ミリメートル Hg。 3.5%、ただし、複数の 34 mm Hg に 50% の急激な減少で起因したイソフルランの濃度を増加させる刺激と ICP 測定で安定した応答があったそれに続く刺激。3.0% 2.0% からイソフルランを切り替え、19% が応答の減少を観察し、2.5% から 5%、さらに多くの高速が 70% の応答の減少見られたとき、同じ効果が認められました。血圧は、すべて刺激を通して安定していた。イソフルラン/酸素麻酔を使用して手術と、フェンタニル/ミダゾラム (一方、イソフルランが中止された) の推奨投与量の 25% を受けた初期の刺激の間に麻酔したラットでは同様に安定したレスポンスです。イソフルラン (図 16) に比べてフェンタニル/ミダゾラム麻酔中に 25% 増。
鼻の円錐形の中の酸素の管理 61 75% から約 20 の 99-100% の血液の酸素飽和度を増加した s。分血圧が安定して刺激、鼻の円錐形 (0.8 L/分) を介して酸素投与によってそれを減らす最大の ICP 測定に大きな影響を持っていた、同じ減少が約 1 以上見られた酸素が停止されたとき35-45% 連続刺激 (図 17)。
図 1.バイポーラ テフロン コーティング銀電極。(A) 接着剤塗工、非塗り工の電極間の移行帯にバブルします。(B) Distal 電極の 2 cm しっかりバラケません。(C) 並列コーティングされていないフック 1 mm 離れています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.海綿体の解剖 - ランドマーク。(A) 縦 1 cm 皮膚切開、陰茎のベースから開始 2 mm 外側を下方。(B) 陰嚢筋膜の外側は、綿棒を使用して分離します。リトラクターの配置後動作フィールドの (C) ビュー (pm: イボタマキビ筋肉それ: 坐骨結節に cru の挿入ポイント)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.公開逃げず。(A) 坐骨海綿体筋 (矢印)。(B) 逃げず (矢印)。(C) 低倍率拡大海綿体のコースを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.海綿静脈洞圧記録の線。針海綿体 (矢印) と平行して走り会陰の皮膚を通して紹介します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.矢印と前立腺の背側面に垂直実行する CN で mpg ファイルの露出マークします。主な骨盤神経節 (MPG) 海綿静脈洞神経 (CN) の矢印でマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.海綿状の神経の解剖します。(A) マイクロはさみで海綿状の神経を覆う筋膜を切るします。(B) マイクロ鉗子を使用して基になる組織から神経を分離します。(C) 神経の下に 9-0 合字を配置すること。主な骨盤神経節 (MPG) 海綿静脈洞神経 (CN) の矢印でマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7.神経のフックします。(A) 縫合を注意深く引いて神経を昇降します。(B) 神経電極のフックで休んでいます。(C) 神経と電極の複雑な生体シリコン接着剤で分離されました。(D) その他接着剤バブル神経電極複合体を完全に隔離する追加。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8.逃げずのカニューレ装着。23 G 針は逃げずに挿入される PE 50 管に接続します。カーソルの矢印でマークのポイント。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9.海綿静脈洞部のラインをテストします。正確な行の配置を見ての応答。線とタップ cru に応答のフラッシュに注意してください。また、ベースラインに戻って簡単な圧力降下に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10.海綿神経刺激に対する応答の初期します。減少の最初の応答。 50 mm Hg の最初の刺激および変動高原。66 mm Hg の 2 番目と 3 番目の刺激。以下の測定値は 73 mm hg で通常レベルで記録されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11.繰り返される海綿状神経刺激、海綿静脈洞部圧記録します。このプロトコルを使用して結果の安定性を示します。75-78 mm hg の間 10 連続刺激この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 12.海綿神経刺激と圧記録します。< 6 mm Hg 変動圧力の約 30 の連続刺激。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 13.継続的な刺激の持続 20 分あと 1 分で終わりではなく後続刺激増加変動生産安定な応答です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 14.漏れ逃げず。フラッシュ、タッピング後ベースラインに戻って長期応答。刺激後減らされた応答は。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 15.海綿静脈洞部の圧に及ぼす麻酔投与。減少し、イソフルランの増加により変動応答に比べて最初の 2% の安定な応答、2 つと最後の 3 つの刺激。上の定数を示す青のトレースは、動脈圧を意味します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 16.海綿静脈洞部の圧に及ぼす麻酔の種類。80 mmhg の圧力増加のイソフルラン麻酔の下で行われる初期の刺激、110 mm hg への応答の増加があったフェンタニル/ミダゾラム投与後この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 17.鼻の円錐形を介して酸素投与の効果。海綿神経刺激と海綿静脈洞圧増加を大幅に削減で起因した鼻の円錐形を介して酸素投与を中止します。平均動脈圧に及ぼす影響は認められない (トレース上青)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 18.圧刺激に対する反応に及ぼす電圧。1.5 6 V 間の電圧は、同一圧力応答を作り出した。応答低下対 1.5 以下この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究の第一の目標は、ICP 録音のため陰茎 cru カニュレーションの簡略化された手術手技と電気刺激の CN の分離を記述するためだった。紹介した手術を簡素化し、CN の刺激で ICP の上昇の再現可能な録音を提供する海綿体の解剖に変更。1 cm 縦切開で指導として明白な坐骨結節を使用して、陰茎のベースの外側を実現坐骨海綿体筋や精巣白膜の良好な露出。この手順より速く (15 分未満) 文学と原因最小限の組織混乱2,3,4に記載しました。
現在使われている CN 刺激法は、フック、リフティング、含まれています、応用10各電気前に CN の乾燥です。この手法では、それぞれの刺激のための同じである条件は限りません。また、神経のリフティング マイクロマニピュレーターの使用を必要とし、ストレッチと neuropraxia につながる神経の解放を繰り返します。神経電極複合体を分離するための生体適合性のシリコン接着剤の使用電流の CN 刺激法と比較して、2 つのインスタンスに伸びる神経の頻度が減少します。一度、神経の周りのバイポーラ電極を配置して神経および接着剤を用いた電極を分離します。その後、複数の neurostimulations は、神経操作を必要とせず実行でした。
圧記録の海綿体に、針の挿入は、重要なステップを構成します。この技術の新しいユーザーは、実験を開始する前にこの部分を練習する必要があります。Cru は拡大され、針が展開されていることが重要です針を cru に展開すると、そのコースに平行。他の重要なステップは、神経が周囲の組織との下に電極の配置からその郭清中の処理です。郭清自体は困難な作業が、ストレッチや神経のクラッシュを損傷の可能性があります。この手順の変更を加えるマイクロマニピュレーターの必要性が不要になります、神経処理を簡素化します。神経を分離でき、安定性と信頼性の高い接点電極と神経生体シリコン接着剤の使用は、必要な操作を軽減されます。シリコーン接着剤は、体内の神経が適用される他の動物モデルにおける使用可能性があります。
数多くの研究で示した刺激パラメーターは、14 〜 20 Hz と 1.5 12 V11,13,14によって異なります。この手法は、1.5 を使用してその刺激を示した mA、16 Hz、3 V と 5 ms のパルスが完全な応答を生成します。刺激パラメーターを増加、ICP は (図 18) を増加しません。動脈 (海綿体動脈)、細動脈、および正弦波の滑らかな筋肉弛緩をトリガーのしきい値を超えている任意のパラメーターを使用して刺激反射をトリガーするのに十分で、完全な生理になることが示唆されました。応答。強い生理学的な応答に周波数、振幅、パルス幅のそれに続く増加はつながらないと神経伝達物質を枯渇させるかも神経損傷を引き起こします。上記のパラメーターを持つ限り短く 30 残りの期間で再現可能な応答を達成するためにことができました s 行の以上 40 倍。
麻酔の深さは明らかに生理的反応を影響します。吸入麻酔とそれ制御できることも、しかしピーク応答は約 25% 低く、フェンタニル/ミダゾラム麻酔注射によって投与と比較した場合。イソフルランの線量でしたつま先ピンチ応答を排除するために必要な最小のイソフルラン濃度によって決定されるレベルで維持されることがわかった。ほとんどの研究者は、ペントバルビ タール ナトリウム、ミダゾラム/フェンタニル、ケタミン ・ キシラジン、ケタミン/ミダゾラム15に注射麻酔を使用します。
パブリッシュされたアーティクルのどれも制御された酸素の使用に言及しませんでした。本研究の結果は、ICP に大きな影響を与えたこのことを示します。したがって、使用される麻酔の種類に関係なく動物が鼻の円錐形によって酸素を受け取る、ことが重要です。
ラットの使用は、その大きさと弾力性のため有利です。以前に発表された研究で、本研究で確認、スプレイグ ラットは生後 6-12 週間の範囲で CN の刺激にそのまま応答に示されている、200-550 g. 使用マウスの重量を量るために有益なより困難、トランスジェニック技術12の可用性。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson forceps | Fine Science Tool | 11006-12 | |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tool | 11271-30 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tool | 11273-20 | |
| ToughCut Mayo scissor | Fine Science Tool | 14110-15 | |
| Miniature Vannas Spring scissor | Fine Science Tool | 15006-09 | |
| Ultra Fine Hemostat | Fine Science Tool | 13020-12 | |
| Crile Hemostat | Fine Science Tool | 13004-14 | |
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| Teflon coated silver wire 0.125 mm | World Precision Instruments | AGT0510 | |
| Elastic wire retractors | Custom made | ||
| Scalpel blade | Fine Science Tool | 10023-00 | |
| PE-50 tubing | Warner Instruments | 64-0753 | |
| 23 G Needle | Kruuse | 121272 | |
| SD-9 Square Pulse Stimulator | Somatco | 1077/183 | |
| Blood pressure transducer and cable | World Precision Instruments | BLPR2 | |
| Raucotupf Cotton-tipped Applicators | Lohmann-Raucher | 11966 | |
| Pro-ophta Ocular Sticks | Lohmann-Raucher | 16515 | |
| NaCl 0,9 % 100 mL | Local pharmacy | ||
| Heparin | Local pharmacy | ||
| 25 mL Syringe | Odense University Hospital | ||
| Vet eye ointment - Viscotears | Local pharmacy | ||
| silver wires | Science Products GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Silicon Glue | Kwik-Sil, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA |
References
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