Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.
Abstract
Das Ziel dieser Arbeit soll eine neuartige Methode, um die Fähigkeit von einigen immunmodulatorischen Molekülen wie antimikrobielle Peptide (AMPs), Förderung der Zellwanderung bewerten zu zeigen. Wichtiger ist die Zellwanderung eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Heilung von Wunden, die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung wieder herzustellen. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der klassischen Test, basiert auf einen manuell gemacht Kratzer in einer Zelle monomolekularen Film, ist, dass die Verwendung von speziellen Silikon Kultur fügt mit zwei Fächern um eine zellfreie Pseudo-Wunde Feld mit einer klar definierten Breite (500 μm zu erstellen ). Durch eine automatisierte Analyseplattform ist es darüber hinaus möglich, quantitative Daten über die Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration schnell zu erhalten. Genauer gesagt, wird die Wirkung von zwei Frosch-Haut-AMPs auf die Migration der bronchialen Epithelzellen angezeigt. Darüber hinaus wird Vorbehandlung dieser Zellen mit spezifischen Inhibitoren auf die molekularen Mechanismen, die solche Ereignisse informieren.
Introduction
Es ist weitgehend bekannt, dass die Wundheilung bei Tieren ist ein fundamentaler Prozess die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung1wieder herzustellen. Trotz epithelialen Oberflächen der äußeren Umgebung (z. B. der Atemwege, Haut und Magen-Darm-Trakte) bilden eine schützende Barriere von physikalischen und chemischen Beleidigungen, die Bildung von Wunden kann leicht auftreten, vor allem nach Chirurgie oder mikrobielle Infektionen2. Wie beispielsweise Besiedlung des Lungengewebes durch opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas Aeruginosa, vor allem bei zystischer Fibrose (CF) erkrankten führt um zu Schädigungen der Atemwege Epithel mit daraus resultierenden Atemstillstand3, 4. Wundheilung ist eine komplexe Host-Repair-Mechanismus zur Wiederherstellung der normalen Architektur von einem verletzten Gewebe5. Es zeichnet sich durch eine anfängliche Entzündung, gefolgt von einer Regenerierung umfasst Epithelisierung, Angiogenese und Gewebe Umbau mit Produktion von Kollagen und Zelle Differenzierung6,7,8 . Epitheliale Integrität sicherzustellen und mikrobieller Vermehrung kontrollieren, produzieren alle lebenden Organismen Verteidigung Moleküle, einschließlich antimikrobielle Peptide (AMPs)9,10. Die Wundheilung ist sehr schwierig, in-vitro- aufgrund des Fehlens von Zellenrückstand und komplexen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen zu simulieren. Aber die in-vitro- Fähigkeit eines Peptids durch die Stimulierung die Schließung einer Pseudo-Wunde beschleunigen Migration von Epithelzellen ist bezeichnend für seine Fähigkeit zu heilen eine kompromittierte Epithel. In der Tat Zellwanderung ist eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Wundheilung, und Studium der Faktoren, die Zellwanderung beeinflussen können Ziel Therapien für eine verbesserte Wundheilung hilft.
Hierbei ist ein hoch reproduzierbarer experimentelle Assay vorgesehen, basierend auf Spezialsilikon Kultur Einsätze, Zelle Migration in Vitrozu bewerten. Es basiert auf der Schaffung einer 500 μm Lücke (Pseudo-Wunde) auf einer Monoschicht konfluierende Zelle. Die Zellen am Rand des Feldes künstliche "verletzten" startet in den zellfreien Bereich Migration, bilden neue Zell-Zell-Kontakte. Die Kultur einfügen stellt ein neues Tool für schnelle Wundheilung Experimente. Zwei Stauseen, die durch eine 500 μm Wand getrennt werden, und sie können richtig platziert werden, in einem 3 cm Schüssel Teller oder in den Brunnen von einem 12-Well-Platte. Jedes Fach des Einsatzes mit einer Zellsuspension füllen kann Zellen wachsen in jedem ausgewiesenen Bereich bis zum Zusammenfluss, während Entfernung des Einsatzes eine saubere zellfreie Lücke von etwa 500 μm (die gleiche Breite wie die Trennmauer) zu erzeugen. Eine ordnungsgemäße Zellkulturmedium, ergänzt mit einer Testverbindung können dann hinzugefügt werden, in die Schüssel Teller/gut. Danach kann der Lückenschluss in unterschiedlichen Zeitabständen unter einem inversen Mikroskop, vorzugsweise eine, die mit einer Videokamera ausgestattet, für die Bildaufnahme visualisiert werden. Schließlich ermöglicht die Messung von Veränderungen im Bereich Zelle abgedeckt durch die Web-basierte automatische Bild-Analyse-Programm die Quantifizierung der Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration. Insgesamt ist diese Methode ein Schritt nach vorn in Bezug auf die klassische Assay, wo ein Kratzer erfolgt manuell durch Eingrabung konfluierende Zelle Monolagen mit einer sterilen Nadel oder eine Pipette Tipp11. In der Tat das letzte Verfahren zu zerstören die Kunststoff Boden der Schale Platte/gut und die Oberflächenbeschichtung, Falten zu schaffen. Darüber hinaus muss die "Verletzte" Bereich keine klar definierte Breite über die gesamte Länge der Lücke, da dies stark von den Forschern auf die Nadelspitze ausgeübte Druck abhängig. Darüber hinaus können die verdrängt Zellen an den Rändern des Kratzers Klumpen von lebenden und toten Zellen bilden; Darüber hinaus kann die Verbreitung von lebenden Zellen in den "verletzten" Bereich mit einer Geschwindigkeit von Zellwanderung, Generierung von nicht reproduzierbaren Ergebnisse12stören.
Darüber hinaus durch ein Rubbellos Bild-Analyse-Plattform erhalten schnell (innerhalb von Minuten) quantitative Daten über das Wanderungsverhalten der markierten Zellen ohne die Notwendigkeit, zusätzlichen Software zu erwerben Anwender. Diese Plattform ist geeignet zur Analyse von Kontrast Mikroskopie Phasenbilder niedrig (~ 5 X), Medium (~ 10 X) und hoch (~ 20 X) Vergrößerung. Nach dem Hochladen einer Zip-Datei von Bildern (in *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.GIF, *.tiff Format) wird automatisch die Analyse durchgeführt, um eine Übersichtsdatei zu generieren, die den Prozentsatz der Zelle bedeckten Gebiete und Kratzer Gebiete sowie die Geschwindigkeit der Zelle zeigt Migration, in unterschiedlichen Zeitabständen.
In dieser Arbeit mithilfe ein Frosch-Haut AMP-Derivat, d. h. Esc(1-21) und seine Diastereomer Esc(1-21) - 1 c-13und eine bronchiale Zell-Linie mit dem Ausdruck der funktionalen CF transmembranen Leitwert Regulator (CFTR)14,15, ein Beispiel für Peptid-induzierte Zellwanderung im Vergleich zu unbehandelten (Kontrollproben) wird zur Verfügung gestellt. Beachten Sie, dass die Atemwege Epithel und CFTR eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der Lungenfunktion und Wunde Reparatur16. Darüber hinaus beinhaltet ein Beweis, dass die vorgenannten Peptide Migration bronchiale Zellen verursacht durch selektive Inhibitoren (z. B. AG1478)17 der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), Aktivierung des EGFR12, 18 berichtet.
Zusammenfassend lässt sich sagen soll das Ziel dieses Verfahrens zeigen, wie die Verwendung von solchen Silikon-Kultur-Einsätze stellt eine schnelle und leicht erreichbare-Assay, Migration von adhärenten Zellen (z. B. bronchialen Epithelzellen) und der molekularen genau zu bestimmen Mechanismen, die solche Ereignisse zu kontrollieren.
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Protocol
1. Zelle-Vorbereitung
- Samen 2.5x106 Zellen in 10 mL von Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 2 mM Glutamin (MEMg), plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Antibiotika (0,1 mg/mL Penicillin und Streptomycin) und Puromycin (0,5 µg/mL für die Auswahl und Pflege der Zelllinie) in einem Kolben T75. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO2 , für 2 Tage. Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments, Zusammenfluss von Zellen unter einem inversen Mikroskop.
Hinweis: Für das Experiment verwendeten Zellen sind unsterblich menschlichen bronchialen Epithelzellen mit einem Lentivirale Vektor verleiht Resistenz gegen Puromycin ausgestrahlt. Sie drücken stabil eine funktionelle CFTR-14,15. - Sobald die Zellen Zusammenfluss 90-100 % erreicht hat, aspirieren Sie das Medium aus der Flasche und entsorgen Sie es in einer Abfallflasche unter eine biologische Kabinett Schutzklasse II. Waschen Sie die Zellen mit 6 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (CMF-PBS). Sanft den Kolben manuell rock und CMF-PBS zu verwerfen.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht die Zelle monomolekularen Film mit der Pipette zu berühren. - 10 mL der CMF-PBS und inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C und 5 % CO2 für 10 min.
- Aspirieren Sie CMF-PBS und entsorgen. Fügen Sie 2 mL Trypsin/EDTA in den Kolben.
- Schütteln Sie die Flasche, so dass die Lösung komplett Beschichten der Zellen, und den Kolben bei 37 ° C und 5 % CO2 für 10 min inkubieren, bis die Zellen unter dem Mikroskop sichtbar gelöst werden.
Hinweis: Am Ende der Inkubationszeit sollte die Zellen abgerundet und nicht an der Kunststoffoberfläche angezeigt. Wenn die Zellen nicht gut gelöst sind, kann die manuelle Erregung notwendig sein. - Fügen Sie 10 mL MEMg zuzüglich 10 % FBS Trypsin zu inaktivieren und die Zellen durch Waschen der Unterseite des Kolbens zu sammeln. Übertragen Sie die Lautstärke in einem konischen 50 mL-Tube.
- Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 80 X g.
- Den Überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zellen in 6 mL MEMg zuzüglich 10 % FBS. Pipette wiederholt, bis Klumpen zu brechen.
- Nehmen Sie 10 µL Zellsuspension mit einer Mikropipette und injizieren Sie die Lautstärke unter dem Deckglas zuvor über eine Burker oder Neubauer Kammer gestellt.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen.
(2) Zellen in der Kultur Aussaat fügt
- Übertragen Sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte die Kultur-Einlage mit einer sterilen Pinzette (Abbildung 1). Benutzen Sie eine Pinzette, um an den Rändern der Einsätze zu drücken, um sie an die Oberfläche der Platte zu beheben.
Hinweis: Einsätze haben eine klebrige Unterseite, die Adhäsion ermöglicht.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Silikon Kultur Einsätze, in Vertiefungen einer 12-Well-Platte richtig setzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Richtig verdünnen die Zellsuspension in MEMg zuzüglich 10 % FBS. Jedes Fach des Einsatzes mit 70 µL Zellsuspension (ca. 3.5x104 Zellen/Kammer) füllen.
Hinweis: Die Dichte der Zellen in jedem Fach Angewandte richtet sich nach der Art der Zellen. Es wird empfohlen, eine Zelldichte verwenden, das führt zum Zusammenfluss innerhalb von 24 h zu vervollständigen. - Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass Zellen nicht von der einfügen-Fächer undicht sind und inkubieren Sie die 12-Well-Platte für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
(3) Pseudo-Wunde heilende Assay
- Visualisieren Sie nach der Inkubation die Zellen unter der inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass konfluierende Zelle Monolagen gebildet haben.
- Wieder aussetzen Sie Testverbindungen (z. B. Ampere) in 1 mL MEMg.
Hinweis: Bereiten Sie frische AMPs Verdünnungen ab der Stammlösung bei-20 ° c gelagert - Entfernen Sie vorsichtig die Einsätze von sterilen Pinzette. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zelle Monolagen zu brechen. Die Einsätze auf saugfähigem Papier zu übertragen.
Hinweis: Um die gleichen Einsätze wiederzuverwenden, Sterilisieren sie in 70 % igem Ethanol für mindestens 3 h. Es wird empfohlen, anschließend wegwerfen. - Um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL MEMg pro nun mit einer Mikropipette. Schließen Sie die Platte und schütteln Sie es.
Hinweis: Fügen Sie Medium direkt auf Zelle Monolagen um ihre Störung zu vermeiden. - Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es mit 1 mL MEMg pro Bohrloch. Schließen Sie die Platte und visualisieren Sie die zellfreie Lücken (erstellt durch die Einsätze) unter den inversen Mikroskop bei 4 X Vergrößerung mit einer Videokamera ausgestattet. Bilder zum Zeitpunkt Null (T0) zu erwerben und in ein JPG-Format abspeichern.
- Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen, mit 1 mL PBS waschen und entsorgen.
- Die Brunnen fügen Sie der Testverbindungen (vorbereitet in Punkt 3.2 hinzu). Hinzugeben Sie für unbehandelten Kontrollproben 1 mL MEMg. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Nach 15, 20 und 24 h Behandlung beobachten die Zellwanderung unter dem Mikroskop bei 4 X Vergrößerung und Abrufen von Bildern.
Hinweis: Bei diesem Schritt versuchen Sie, Bilder in den gleichen Bereichen wie für T0 zu erfassen. Die Wahl von Zeitintervallen die Aufnahmen hängt von der Zelle Migration Geschwindigkeit. - Um die Wirkung von einigen selektive Inhibitoren zu untersuchen, Aspirieren d. h. AG1478, auf Zellwanderung, des Mediums aus jedem Einsatz Fach vor dem Entfernen Einsätze.
- Waschen Sie jedes Fach mit frischen MEMg und füllen Sie ihn mit 70 µL MEMg AG1478 ¤ nzt.
- Nach 30 min Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2wie ab Punkt 3.3 beschrieben vorgehen.
Hinweis: Während der Waschschritt und Vorbehandlung der Zelle Monolagen mit spezifischen Inhibitoren, achten Sie nicht auf die Einsätze zu entfernen.
(4) Bildanalyse
- Wählen Sie nach Abschluss des Experiments Bilder der repräsentativsten Beispiele der verschiedenen experimentellen Gruppen aus, und erstellen Sie eine Zip-Datei enthält einzelne Bilder bei T0, T15, T20 und T24 h.
Hinweis: Einzelne Bilder sind in den ausgewählten Zeitabständen für alle Proben genommen. Führen Sie Triplicates für jedes Experiment, die mindestens drei Mal wiederholt wird. Am Ende, für alle experimentellen Gruppen, mindestens 3 Bilder ("a", "b", "C", etc., aus jedem unabhängigen Experiment) zu jedem Zeitpunkt werden analysiert. - Laden Sie die Zip-Datei in der Bildanalyse-Software sorgt automatisch per E-mail eine Tabellenkalkulationsdatei Zusammenfassung mit den experimentellen Daten der Zelle abgedeckt und Kratzer (in Prozent) zu den ausgewählten Zeitpunkten.
Hinweis: Die Anerkennung von der Vorderkante und den Spaltbereich basiert weitgehend auf Kante Nachweisverfahren (zur Ermittlung der Punkte, an denen die Bildhelligkeit stark ändert). - Sichern Sie Ihre Daten und sammeln sie. Alle Daten in Bezug auf den Mittelwert zum Zeitpunkt Null zu normalisieren. Berechnen Sie den Mittelwert der normalisierten Daten von allen Wiederholungen auf jeden Zeitpunkt und der relative Standardfehler (SEM). Führen Sie mithilfe von zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) statistische Analyse mit einem richtigen Statistik-Software. Unterschiede zwischen Peptid-behandelten Gruppen und Kontrollgruppen in unterschiedlichen Zeitabständen gelten als statistisch bedeutenden für ein p< 0,05.
- Plotten Sie die gewonnenen Daten in einem Diagramm als ein Histogramm, das dem Prozentsatz der Zelle bedeckten Fläche von allen Probe Gruppen im Vergleich zu die ausgewählten Zeitabständen zeigt.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die heilende Wirkung von Esc(1-21) und Esc(1-21) - 1 c in Bezug auf die Zellaktivität Migration induzierten auf bronchialen Epithelzellen, die mit dem Ausdruck der funktionellen CFTR Wunde zu bestimmen. In diesem Test wurden Kultur Einsätze in Vertiefungen der 12-Well-Platte gegeben und jedes Fach war ausgesät mit 35.000 Zellen in MEMg ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen erreicht komplette Zusammenfluss innerhalb 24 Std. danach, eine 500 μm Lücke wurde generiert und jeweils war gut gefüllt mit MEMg, enthält das Peptid in verschiedenen Konzentrationen. Das Experiment wurde viermal wiederholt. Wie in Abbildung 2gezeigt, war die fast vollständige Schließung des Feldes Pseudo-Wunde in der Zelle monomolekularen Film produziert bzw. durch die zwei Peptide innerhalb von ~ 20 h, bei optimalen Konzentrationen von 1 μM und 10 μM für Esc(1-21) - 1 c und Esc(1-21), induziert. Dies bedeutet, dass Esc(1-21) - 1 c effizienter ist bei der Förderung der Re Epithelisierung einer Pseudo-Wunde in den Bronchien Zellen.
Abbildung 2 : Wirkung der Esculentin-1a abgeleitet AMPs auf die Schließung einer Pseudo-Wunde in einer Monoschicht der bronchialen Epithelzellen erstellt. Zellen wurden in jedem Fach des Silikon-Kultur-Einsatzes ausgesät und nach der Entnahme Zellen wurden auf Anzeichen von Zellwanderung 15, 20 und 24 Stunden nach der Zugabe von Peptiden fotografiert. Der Anteil der Zelle bedeckten Bereich zu jeder Zeit Punkt berechnet wurde im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Ctrl) und wird auf der y-Achse berichtet. Alle Daten sind die Mittel von vier unabhängigen Experimenten ± SEM und stammen aus einer früheren Studie14. Die statistische Signifikanz für Tests zwischen Kontrolle und behandelten Proben sind: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001 und ***p< 0,0001. Mikrographen zeigen repräsentative Ergebnisse vor (T0) und 20 h nach Behandlung der Zellen mit jedem Peptid in der Konzentration von 1 μM, im Vergleich zur Kontrolle werden auch gemeldet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Überprüfen Sie, ob die Aktivierung des EGFR bei der Esc-induzierte Wundverschluss eine Rolle gespielt, waren bronchiale Zellen für 30 min mit 5 μM von AG1478, ein selektiver Hemmstoff des EGFR, vor dem Einfügen entfernen preincubated. Da der Anteil der Zelle bedeckten Bereich deutlich werden in allen zeitlichen Intervallen im Vergleich zu den Ergebnissen gefunden reduziert konnte, wenn die Zellen nicht mit der Inhibitor vorherige Peptid Verwaltung (Abbildung 3), vorbehandelt waren dies weist darauf hin, das Peptid-induzierte Zellwanderung beinhaltet Aktivierung des EGFR. Allerdings werden weitere Studien erforderlich sein, die molekularen Ereignisse ausgelöst durch die Esc-Peptide (z. B. direkte EGFR-Aktivierung oder Trans-Aktivierung vermittelt durch Metalloproteasen, die erwiesenermaßen Membran verankerte EGFR-Liganden Spalten zu klären 19).
Abbildung 3 : Wirkung der AG1478-Inhibitor die Peptid-induzierte Migration der bronchialen Epithelzellen. Vor dem Einfügen entfernen, Zellen wurden vorab inkubierten mit 5 μM AG1478 für 30 min und anschließend mit das Peptid allein bei der gleichen Konzentration behandelt. Alle Daten sind das Mittel von vier unabhängigen Experimenten ± SEM und stammen aus unserer bisherigen Arbeit14. Die statistische Signifikanz für Tests zwischen den angegebenen Gruppe Proben sind: *p< 0,05; p< 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Zellmigration ist ein wesentlicher Prozess in vielen physiologischen und pathologischen Veranstaltungen einschließlich der Wundheilung, Embryonalentwicklung und Krebsmetastasen. Das grundlegende Verfahren zur Zelle Migration in-vitro- Studie beinhaltet: (i) die Schaffung einer Zelle Monolage, (Ii) die Produktion einer Pseudo-Wunde in der konfluierende Schicht von Zellen, (Iii) die Erfassung der Bilder in unterschiedlichen Zeitabständen bis Wunde Schließung erreicht ist , und (iv) die Analyse der Bildfolge um die Migration Geschwindigkeit der ausgewählten Zellen zu quantifizieren.
Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Anwendung der Kultur fügt eine objektive und zuverlässige experimentelle Technik für quantitative Auswertung der Zelleigenschaften Migration. Dieser Test kann jeder Forschungsgruppe mit grundlegenden Laborausrüstung durchgeführt werden. Jedoch sollten einige wichtige Schritte des Protokolls gelten Reproduzierbarkeit zu erreichen. Beispielsweise ist es wichtig zu definieren, durch Pilotprojekte, die genaue Anzahl der Zellen, die Samen in jedem Fach um im gleichen Maße von Confluence in allen einzelnen Proben zu erhalten. Zu diesem Zweck ist, die Zellen mit einer synchronisierten Zyklus-Phase und die Vermeidung von Zelle Klumpen vor der Aussaat entscheidend. Ein möglicher Weg, um Klumpenbildung zu minimieren ist eine sanfte Passage der Zellsuspension durch eine Spritzennadel. Allerdings wird die Erhöhung der Größe der Proben wesentlich um Variabilität zwischen den Zellen zu verringern beitragen.
Darüber hinaus ist die Schaffung einer Lücke mit einer klar definierten Breite in allen Proben entscheidend. Zu diesem Zweck sollte Silikon-Einsätze nicht mehr als zweimal wiederverwendet werden. Darüber hinaus sollte das Wachstum von Zellen unter der Silikon-Trennmauer vermieden werden. Um dieses Problem zu vermeiden, sanften Druck auf die Einlage einmal gelegt in die Schüssel Teller/gut, kann manuell mittels sterilen Pinzette zur Erhöhung der Haftung des Einsatzes auf den Kunststoff angewendet werden. Vorsichtige Entfernung des Einsatzes wird auch Erweiterung der zellfreien Oberfläche mit Störung der Zelle Monolage behindern.
Jedoch können sobald der Einsatz richtig verdrängt und eine Pseudo-Wunde perfekt produziert, einigen Zelllinien von der Kunststoffoberfläche zu lösen vor allem, wenn sie in den Medien ohne Serum oder Nahrungsergänzungsmittel wie Vitamine, Aminosäuren und Wachstumsfaktoren ausgebrütet werden. Das Fehlen dieser Faktoren in ein Zellkulturmedium kann dadurch diktiert werden, dass sie die Wundheilung fördern Aktivität der Testverbindungen beeinträchtigen können. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt die rational-Choice Kulturmedium Komposition.
Ein weiterer wichtiger Schritt zu prüfen, bevor Sie dieses Verfahren der Wundheilung einrichten ist die unterschiedliche Migration-Geschwindigkeit, die unter verschiedenen Zelltypen vorhanden ist. Auch in diesem Fall müssen Vorversuchen geplant werden, mit dem Ziel der Bestimmung der richtigen Zeitintervallen die Bilder erfasst werden müssen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass eine Einschränkung dieser Methode zugeordnet ist, dass diese Kultur-Einsätze nicht beschäftigt werden können, für das Studium der Migration von Zellen, die in der Schwebe (z. B. polymorphkernige Leukozyten) wachsen.
Trotz Wundheilung Tests durchgeführt mit der Silikon-Kultur Einsätze sind teurer als der klassische Scratch-Test, sie ermöglichen eine schnelle und genaue Wiedergabe von Daten auf Migration-Zell-Aktivität. Wichtig ist, sobald das System Set-up ist, es lässt sich Wissen über die molekularen Mechanismen der Wundheilung Aktivität angeregt durch endogene oder exogene Faktoren zugrunde zu erweitern. Zu diesem Zweck kann Vorbehandlung Zelle Monoschichten mit bestimmten Molekülen (z. B. Inhibitoren) vor dem Erstellen der Pseudo-Wunde durchgeführt werden. Ein Beispiel ist gegeben durch Vorbehandlung der Zellen mit (i) die Zelle Verbreitung Blocker Mitomycin C zu untersuchen, ob die Schließung der "verletzten" Feld induziert durch AMPs durch Zellteilung Rate20 oder (Ii) Metalloprotease Hemmer überprüfen beeinflusst wird die Beitrag von Metalloproteasen bei der Aktivierung des EGFR-vermittelten Signalisierung Weg12.
Wichtig ist, bei der Schließung der Wunde Proben können fixiert und werden mit entsprechenden Flecken Zytoskelett und Kerne Nachweis behandelt (Phalloidin und DAPI, beziehungsweise), Änderungen in der morphologischen Aspekt der Zellen zu visualisieren (z. B. die Bildung von Lamellipodia an der Vorderkante) von Leuchtstofflampen/konfokalen Mikroskopie. Behandlung der Zellen mit einem fluoreszierenden beschriftet AMP kann darüber hinaus die Visualisierung ihrer zelluläre Verteilung (Membranoberfläche oder intrazellulären/intranuclear Lokalisierung) zu unterschiedlichen Zeiten, seit Jahresbeginn die wandernden Zellaktivität ermöglichen. Darüber hinaus können diese Einsätze genutzt werden, für die Analyse der Wunde Heiltätigkeit auf polarisiert und differenzierten Epithelzellen (z.B. primäre Bronchien Zellen gepflegt an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit), nachdem sie auf geeignete Transwell platziert durchlässige unterstützt.
Zusammenfassend hat das beschriebene Verfahren erhebliches Potenzial erheblich verbessern das Verständnis über die wandernden Funktionen der verschiedenen Arten von anhaftenden tierischen Zellen/epithelialen Geweben, sowie bei der Auswahl der vielversprechendsten Wundheilung Promotoren und/oder Inhibitoren, innerhalb kurzer Zeit und mit hoher Genauigkeit.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von der Universität La Sapienza und der italienischen Mukoviszidose Research Foundation (Projekt FFC #11/2014 verabschiedeten FFC Delegationen aus Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny und Pavia). Teil dieser Arbeit wurde auch von FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020 unterstützt.
Wir sind dankbar, dass Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genua, Italien) für die Bereitstellung der bronchialen Epithelzellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
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