Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera effekten av peptider för migration av bronkial epitelceller. Denna metod möjliggör snabba och mycket reproducerbara obtainmenten av kvantitativa uppgifter om hastigheten på cell migration och såret stängning.
Abstract
Syftet med detta arbete är att visa en ny metod för att utvärdera förmågan hos vissa immunmodulerande molekyler, såsom antimikrobiella peptider (ampere), att stimulera cellmigration. Viktigt, är cellmigration en hastighetsbegränsning händelse under sårläkning processen att återupprätta integritet och normal funktion av vävnad skikt efter skada. Fördelen med denna metod jämfört med klassisk analysen, som är baserad på en manuellt gjorda repa i en cell enskiktslager, är användningen av speciella silikon kultur skär som ger två fack för att skapa ett cellfria pseudo sår fält med en väldefinierad bredd (500 μm ). På grund av en automatiserad bild analysplattform är det dessutom möjligt att snabbt få kvantitativa uppgifter om hastigheten på såret stängning och cell migration. Mer exakt, visas effekten av två groda-hud ampere på migration av bronkial epitelceller. Dessutom ger förbehandling av dessa celler med specifika hämmare information om de molekylära mekanismerna bakom sådana händelser.
Introduction
Det är i hög grad känt att sårläkning hos djur är en grundläggande process att återupprätta integritet och normal funktion av vävnad skikt efter skada1. Trots epitelial ytor som utsätts för den yttre miljön (t.ex. huden, andningsorganen, och mage och tarm) bildar en skyddande barriär från fysiska och kemiska förolämpningar, bildandet av sår kan lätt uppstå, särskilt efter kirurgi eller mikrobiella infektioner2. Som ett exempel leder koloniseringen av lungvävnad av opportunistiska bakterie patogenen Pseudomonas aeruginosa, särskilt i lider av cystisk fibros (CF), till skador i luftvägarna epitel med åtföljande andningssvikt3, 4. Sårläkning är en komplex värd reparation mekanism att återställa en skadad vävnad5normala arkitektur. Det kännetecknas av inledande inflammation, följt av en regenerering bemyndigades epithelialization, angiogenes och vävnad remodeling med produktionen av kollagen och cell differentiering6,7,8 . Att säkerställa epitelial integritet och för att kontrollera mikrobiell spridning, producera alla levande organismer försvar molekyler, inklusive antimikrobiella peptider (ampere)9,10. Sårläkningsprocessen är mycket svårt att simulera in vitro- på grund av cellfragment och komplexa samspel mellan olika celltyper. Dock i vitro förmåga en peptid att påskynda nedläggningen av ett pseudo sår genom att stimulera migration av epitelceller är ett tecken på dess förmåga att läka en komprometterad epitel. Faktiskt, cellmigration är en hastighetsbegränsning händelse i sårläkning och studerar faktorer som kan påverka cellmigration kommer att bidra till målet terapier för förbättrad sårläkning.
Här, tillhandahålls en mycket reproducerbara experimentell analys baserat på speciella silikon kultur skär att utvärdera cell migration in vitro. Den bygger på skapandet av en 500 μm gap (pseudo såret) på en konfluenta cell enskiktslager. Cellerna i kanten av fältet konstgjorda ”sårade” börjar migrera till området cellfria, bildar nya cell cell kontakter. Kultur skäret representerar ett nytt verktyg för snabb sårläkning experiment. Två reservoarer åtskilda av en 500 μm vägg tillhandahålls, och de kan placeras korrekt i en 3 cm maträtt tallrik eller i brunnen av en 12-bra platta. Fylla varje fack insatsen med en cellsuspension tillåter celler att växa i varje utsedda området tills confluence, medan avlägsnandet av skäret kommer att skapa en ren cellfria lucka på cirka 500 μm (samma bredd som den avskiljande väggen). En ordentlig cellodlingsmedium kompletteras med en test-förening kan sedan läggas in i skålen plattan per brunn. Efteråt, gap nedläggningen kan visualiseras vid olika tidpunkter under en inverterade Mikroskop, helst en utrustad med en videokamera för bild förvärv. Slutligen, mätning av förändringar i området cell-omfattas av programmet web-baserad automatiserad bild analys kan kvantifiering av hastigheten på såret stängning och cell migration. Sammantaget är denna metod ett steg framåt när det gäller klassiska analysen, där en repa görs manuellt av öppning konfluenta cell enskiktslager med en steril nål eller en pipett tips11. Faktiskt den sista proceduren kan förstöra plast botten av skålen plattan/brunn och ytbeläggningen, skapa rynkor. Dessutom har ”sårade” området inte en väldefinierad bredd längs hela längden av klyftan, eftersom det beror mycket på trycket tillämpas av forskare på nålspetsen /. Dessutom kan rubbas cellerna bilda klumpar av levande och döda celler på kanterna av scratch; Dessutom kan spridningen av levande celler i området ”sårade” påverka hastigheten av cellmigration, genererar icke-reproducerbara resultat12.
Dessutom, tack vare en scratch bild analysplattform, kan användare snabbt få (inom minuter) kvantitativa uppgifter om flyttande beteendet för de markerade cellerna utan nödvändigheten av att förvärva ytterligare programvara. Denna plattform är kapabel att analysera fas kontrast mikroskopi bilder av låg (~ 5 X), medium (~ 10 X) och hög (~ 20 X) förstoring. Efter uppladdning en zip-fil av bilder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) sker analysen automatiskt för att generera en summary fil som visar procentandelen av både cell-täckt och scratch områden, liksom hastigheten på cell migration, vid olika tidsintervaller.
I detta arbete, med hjälp av en groda-hud AMP-derivat, dvs Esc(1-21) och dess diastereomer Esc(1-21) - 1 c13och en bronkial cellinje som uttrycker den funktionella CF transmembrane conductance regulator (CFTR)14,15, ett exempel på peptid-inducerad cellmigration jämfört med obehandlade (kontrollproven) tillhandahålls. Observera att de luftvägarna epitel och CFTR spela en avgörande roll för att upprätthålla lungfunktion och såret reparation16. Dessutom genom selektiv hämmare (t.ex. AG1478)17 av epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR), bevis att migreringen av bronkial celler induceras av ovannämnda peptiderna innebär aktivering av EGFR12, 18 redovisas.
Sammanfattningsvis är målet med detta förfarande att visa hur användningen av sådana silikon kultur skär representerar en snabb och lättillgänglig analysen att exakt fastställa migration av vidhäftande celler (t.ex., bronkial epitelceller) och molekylära mekanismer för kontroll av sådana händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell förberedelse
- Frö 2.5x106 celler i 10 mL av minst viktigt Medium (MEM) kompletteras med 2 mM glutamin (MEMg), plus 10% fetalt bovint serum (FBS), antibiotika (0,1 mg/mL av penicillin och streptomycin) och puromycin (0,5 µg/mL för urval och underhåll av den cellinje) i en T75 kolv. Inkubera kolven vid 37 ° C och 5% CO2 i 2 dagar. Innan du börjar experimentet, kontrollera sammanflödet av celler under ett inverterat Mikroskop.
Obs: De celler som används för experiment är förevigade människa bronkial epitelceller sensorik med en lentiviral vektor som ger resistens mot puromycin. De uttrycker stabilt en funktionell CFTR14,15. - När cellernas sammanflödet har nått 90-100%, aspirera på medellång från kolven och kasta det in en avfallsflaskan under en biologisk säkerhet skåp klass II. Tvätta cellerna med 6 mL fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (CMF-PBS). Försiktigt rock kolven manuellt och kassera CMF-PBS.
Obs: Var noga med att inte röra den cell enskiktslager med pipetten. - Tillsätt 10 mL av CMF-PBS och inkubera kolven vid 37 ° C och 5% CO2 för 10 min.
- Aspirera CMF-PBS och kassera den. Sedan Tillsätt 2 mL av trypsin/EDTA till kolven.
- Skaka försiktigt kolven, så att lösningen helt coat cellerna, och inkubera kolven vid 37 ° C och 5% CO2 för 10 min tills cellerna är synbart fristående under ett mikroskop.
Obs: I slutet av inkubationstiden, cellerna bör visas rundade och inte knutna till plastytan. Om cellerna inte är väl fristående, kan manuell agitation vara nödvändigt. - Tillsätt 10 mL av MEMg plus 10% FBS att inaktivera trypsin och samla cellerna genom att tvätta botten av kolven. Över volymen till en konisk 50 mL tub.
- Centrifugera röret för 5 min vid 80 x g.
- Aspirera supernatanten och Slamma upp cellerna i 6 mL MEMg plus 10% FBS. Pipett upprepade gånger för att bryta upp eventuella klumpar.
- Ta ut 10 µL cellsuspension med en mikropipett och injicera volymen under täckglaset tidigare sätta över en Burker eller Neubauer kammare.
- Räkna antalet cell.
2. cellen sådd i kulturen skär
- I varje brunn 12-well platta, överföra kultur skäret med steril pincett (figur 1). Använd pincett för att trycka längs skär kanterna för att fixa dem till ytan av plattan.
Obs: Skär har en klibbig undersida som möjliggör vidhäftning.
Figur 1 : Schematisk framställning av silikon kultur skären, ordentligt sätta i brunnar 12-well platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Korrekt späd cellsuspensionen i MEMg plus 10% FBS. Fyll varje fack av skäret med 70 µL cellsuspension (om avdelningen/3.5x104 celler).
Obs: Tätheten av celler som tillämpas i varje fack beror på vilken typ av celler. Det är rekommenderat att använda en cell densiteten som leder till komplett sammanflödet inom 24 h. - Under mikroskopet, kontrollera att celler inte som läcker från de infoga fack och inkubera 12-väl plattan för 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
3. pseudo-sår helande Assay
- Efter inkubation, visualisera cellerna under det inverterade mikroskopet för att kontrollera att konfluenta cell enskiktslager har bildats.
- Återsuspendering test föreningar (t.ex. förstärkare) i 1 mL MEMg.
Obs: Bered färskt ampere utspädningar start från stamlösning förvaras vid-20 ° C. - Ta försiktigt bort skären av steril pincett. Var noga med att inte bryta de cell enskiktslager. Överföra skären på absorberande papper.
Obs: För att återanvända samma skären, sterilisera dem i 70% etanol för minst 3 h. Det rekommenderas att slänga dem efteråt. - Ta bort icke-anhängare celler, tillsätt 1 mL MEMg per brunn med hjälp av en mikropipett. Stäng av plattan och skaka den.
Obs: Lägg inte till medium direkt ovanpå cell enskiktslager att undvika deras störningar. - Aspirera på medellång och ersätta det med 1 mL MEMg per brunn. Stäng plattan och visualisera cellfria luckorna (skapad av skären) under det inverterade mikroskopet med 4 X förstoring, utrustad med en videokamera. Skaffa bilder på tiden noll (T0) och spara dem i en .jpg-format.
- Ta bort mediet från brunnarna, tvätta dem med 1 mL PBS och kassera den.
- Lägg till de test föreningar (förberedd vid punkt 3.2) till brunnarna. För obehandlad kontrollodling proverna, tillsätt 1 mL MEMg. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 15, 20 och 24 h behandling, Observera cellmigration under mikroskopet på 4 X förstoring och förvärva bilder.
Obs: Under detta steg, prova att ta bilder i samma områden när det gäller T0. Valet av tidsintervall där bilderna fångas beror på cell migration hastighet. - För att studera effekten av vissa selektiva hämmare, aspirera dvs AG1478, cell migration, på medellång från varje infoga facket innan du tar bort skär.
- Tvätta varje fack med färska MEMg och fyll den med 70 µL av MEMg kompletterat med AG1478.
- Efter 30 min av inkubation vid 37 ° C och 5% CO2, fortsätta som beskrivs i punkt 3.3.
Obs: Under tvätt steg och förbehandling av cell enskiktslager med de specifika hämmare, vara noga med att inte ta bort skären.
4. bildanalys
- Efter avslutad experimentet, Välj bilder av de mest representativa proverna av olika experimentella grupper och skapa en zip-fil som innehåller enstaka bilder på T0, T15, T20 och T24 h.
Obs: Enskilda bilder är tagna vid valda tidsintervall för alla prover. Kör tripletter för varje experiment, som upprepas minst tre gånger. I slutet, för alla experimentella grupper, minst 3 bilder (”a”, ”b”, ”c”, etc., som härrör från varje oberoende experiment) vid varje tidpunkt analyseras. - Ladda upp zip-filen i bild analys programvara som automatiskt ger via e-post en sammanfattning kalkylbladsfil som innehåller experimentella data av cell-täckt och scratch områden (i procent) vid valda tidpunkter.
Obs: Erkännande av framkant och området gap är till stor del baserad på kanten detektionsmetod (syftar till att identifiera punkter som ändrar bildens ljusstyrka kraftigt). - Spara data och samla dem. Normalisera alla data med avseende på medelvärdet på tiden noll. Beräkna medelvärdet för de normaliserade data för alla replikat vid varje tidpunkt och den relativa standardavvikelsen (SEM). Med hjälp av tvåvägs variansanalys (ANOVA), utföra statistiska analyser med en ordentlig statistik-program. Skillnader mellan peptid-behandlade grupperna och kontrollgrupperna vid olika tidpunkter anses vara statistiskt betydande för en p< 0,05.
- Rita de erhållna uppgifterna i ett diagram som ett histogram, som visar procentandelen av cell-täckt område med alla prov grupper jämfört med valda tidsintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll användes för att bestämma de sårläkning effekt av Esc(1-21) och Esc(1-21) - 1 c när det gäller cell migration aktivitet inducerad på bronkiell epitelceller som uttrycker den funktionella CFTR. I denna analys, kultur skär placerades i brunnar 12-well platta, och varje fack var seedad med 35.000 celler i MEMg kompletteras med 10% FBS. Cellerna nått fullständig sammanflödet inom 24 h. efteråt, en 500 μm lucka genererades och var väl var fylld med MEMg som innehåller peptiden vid olika koncentrationer. Experimentet upprepades fyra gånger. Som anges i figur 2, förmåddes nästan fullständig nedläggning av fältet pseudo sår produceras i den cellen enskiktslager av två peptiderna inom ~ 20 h, vid optimala koncentrationer av 1 μM och 10 μM för Esc(1-21) - 1 c och Esc(1-21), respektive. Detta indikerar att Esc(1-21) - 1 c är mer effektivt att främja återepitelisation av ett pseudo sår i bronkial celler.
Figur 2 : Effekt av esculentin-1a härrör ampere om nedläggning av ett pseudo sår som skapats i en enskiktslager av bronkial epitelceller. Cellerna var seedad i varje fack av silikon kultur skäret och, efter dess avlägsnande, celler fotograferades för bevis av cellmigration 15, 20 och 24 h efter tillsats av peptider. Procentandelen av cell-täckt område vid varje tidpunkt punkt beräknades jämfört med obehandlad kontroll cellerna (Ctrl) och rapporteras på y-axeln. Alla data är medel från fyra oberoende experiment ± SEM och tas från en tidigare studie14. Nivåerna av statistisk signifikans för tester mellan kontroll och behandlade prover är: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, och ***p< 0,0001. Micrographs visar representativa resultat innan (T0) och 20 h efter behandling av celler med varje peptid vid koncentration av 1 μM, jämfört med kontroll, redovisas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kontrollera om aktivering av EGFR spelade en roll i den Esc-inducerad sårslutning, var bronkial celler teststamman för 30 min med 5 μM av AG1478, en selektiv hämmare av EGFR, före infogning borttagning. Eftersom andelen cell-täckt område reducerades signifikant vid alla tidpunkter jämfört med de resultat som hittades när cellerna var inte förbehandlats med hämmare tidigare peptid administration (figur 3), detta påpekar som peptid-inducerad cellmigration innebär aktivering av EGFR. Dock ytterligare behövs studier för att klarlägga de molekylära händelser som utlösts av Esc-peptiderna (t.ex. direkta EGFR aktivering eller trans-aktiveringen medieras av metalloproteaser, som har visat att klyva membran-förankrade EGFR ligander 19).
Figur 3 : Effekten av AG1478-hämmare för peptid-inducerad migration av bronkial epitelceller. Före infogning borttagning, celler var pre ruvade med 5 μM AG1478 för 30 min och därefter behandlats med peptiden ensam vid samma koncentration. Alla data är medel från fyra oberoende experiment ± SEM och är tagna från våra tidigare arbete14. Nivåerna av statistisk signifikans för tester mellan de angivna grupp proverna är: *p< 0,05; p< 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellmigration är en viktig process i många fysiologiska och patologiska händelser inklusive sårläkning, embryonal utveckling och cancer metastaser. Den grundläggande proceduren att studera cell migration i vitro innebär: (i) skapandet av en cell enskiktslager, (ii) produktionen av en pseudo såret i konfluenta lagret av celler, (iii) att fånga bilder vid olika tidpunkter tills såret stängning nås , och (iv) analys av den bildsekvens för att kvantifiera flyttning hastigheten av valda celler.
Våra resultat har visat att tillämpningen av kultur skär är ett objektivt och tillförlitligt experimentell teknik för kvantitativa utvärderingen av cell migration egenskaper. Denna analys kan utföras av någon forskargrupp med grundläggande laboratorieutrustning. Vissa kritiska steg i protokollet bör dock anses uppnå reproducerbarhet. Det är exempelvis viktigt att, genom pilotförsök, det exakta antalet celler till utsäde i varje fack för att få i samma utsträckning av sammanflödet i alla enskilda prover. I detta syfte är att ha celler med en synkroniserad cykel fas och undvika cell klumpar innan sådd kritisk. Ett möjligt sätt att minimera klumpar är en skonsam passage av cellsuspensionen genom en sprutans nål. Öka storleken på prover bidrar dock avsevärt minska variationsrikedomen bland cellerna.
Skapandet av en lucka med en väldefinierad bredd i alla prover är dessutom avgörande. För detta ändamål användas silikon skär åter mer än två gånger. Dessutom bör tillväxten av celler under silikon avskiljande väggen undvikas. För att förhindra detta problem, mjuka tryck ovanpå skäret, en gång placerade i skålen plattan/brunn, kan appliceras manuellt med hjälp av steril pincett för att öka vidhäftningen av skäret till plast. Försiktig borttagning av skäret kommer också hindra utvidgningen av cellfria ytan med störningar av den cell enskiktslager.
Men när insatsen är korrekt rubbas och ett pseudo sår är perfekt producerad, kan vissa cellinjer lossna från plastytan, särskilt om de inkuberas i media utan serum eller kosttillskott såsom vitaminer, aminosyror och tillväxtfaktorer. Avsaknad av dessa faktorer i en cellodlingsmedium kan dikteras av det faktum att de kan störa test föreningar sårläkning främjande verksamhet. För att kringgå problemet, rekommenderas rationella val av odlingsmedium sammansättning.
Ett annat viktigt steg att överväga innan du ställer in detta sårläkning förfarande är olika migration hastigheten som finns bland olika celltyper. Även i detta fall, behöver preliminära experiment schemaläggas med syfte att fastställa de korrekta tiden tidsintervaller där bilder måste fångas. Det är också nödvändigt att beakta att en begränsning som är associerad med den här metoden är att sådan kultur skär inte kan användas för att studera migration av celler som växer i suspension (t.ex. polymorfonukleära leukocyter).
Trots sårläkning analyser utförs med silikon kulturen skär är dyrare än den klassiska scratch test, de tillåter en snabb och korrekt återgivning av data på cell migration aktivitet. Ännu viktigare, när systemet är set-up, kan det användas att utvidga kunskap på den molekylära mekanismen bakom de sårläkning aktivitet stimuleras av antingen endogena eller exogena faktorer. I detta syfte kan förbehandling av cell enskiktslager med specifika molekyler (t.ex. hämmare) utföras innan du skapar pseudo såret. Ett exempel ges av förbehandling av celler med a cell spridning blockerare mitomycin C att undersöka om stängningen av fältet ”sårade” inducerad av AMPs påverkas av celldelning kurs20 eller (ii) metalloprotease hämmare att verifiera de bidrag av metalloproteaser i aktiveringen av EGFR-medierad signalering väg12.
Allt under processen för avslutande av såret, prover kan fastställas och behandlas med lämpliga fläckar för identifiering av cytoskelettet och atomkärnor (phalloidin och DAPI, respektive) att visualisera förändringar i den morfologiska aspekten av celler (t.ex. den bildandet av lamellipodia i framkant) av fluorescerande/konfokalmikroskopi. Behandling av celler med en fluorescerande-märkt AMP kan dessutom göra det möjligt för visualisering av dess cellulära distribution (membran yta eller intracellulära/intranuclear lokalisering) vid olika tidpunkter, sedan början av den flyttande cellaktivitet. Dessutom kan dessa skär utnyttjas för att analysera såret helande aktivitet på polariserat och differentierade epitelceller (t.ex., primära bronkial celler upprätthålls på gränssnittet luft-vätska), efter att ha placerat dem på lämplig transwell genomsläppliga stöder.
Sammanfattningsvis, har den beskrivna metoden betydande potential att avsevärt förbättra förståelsen på flyttande funktioner i olika typer av fastsittande djur celler/epitelial vävnad samt val av de mest lovande sårläkning initiativtagare och/eller hämmare, inom en kort tid och med hög noggrannhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av finansiering från Sapienza University of Rome och italienska cystisk fibros Research Foundation (projektet FFC nr 11/2014 antogs av FFC delegationer från Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny och Pavia). En del av detta arbete fick också stöd av FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi är tacksamma att Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italien) för att tillhandahålla bronkial epitelceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
