Summary
Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, antimikrobiyal peptidler (Amper), hücre göç teşvik etmek gibi bazı immunomodulatory molekülleri yeteneği değerlendirmek için yeni bir yöntem göstermektir. Önemlisi, hücre geçiş bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma sonra yeniden kurmak için yara iyileşme sürecinde bir hızı sınırlaması olayı değil. Bu yöntemin avantajı üzerinden el ile yapılan bir çizik içinde bir hücre monolayer dayanır, klasik tahlil özel silikon kültür kullanımı iyi tanımlanmış genişlik (500 mikron ile bir boş hücre sözde yara alan oluşturmak için sağlayan iki bölmeleri ekler olduğunu ). Buna ek olarak, bir otomatik görüntü analiz platformu nedeniyle hızla yaranın kapanması ve hücre geçiş hızı üzerinde nicel verileri elde etmek mümkündür. Daha doğrusu, iki kurbağa-cilt amper etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş-ecek var olmak göstermek. Ayrıca, ön bu hücrelerin belirli inhibitörleri ile bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizmaları üzerinde bilgi sağlar.
Introduction
Büyük ölçüde hayvanlarda yara iyileşmesi bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma1sonra yeniden kurmak için temel bir süreç olduğu bilinmektedir. Epitel yüzeyleri dış ortama (Örneğin, deri, solunum sistemi ve gastrointestinal yolları) maruz rağmen fiziksel ve kimyasal hakaret üzerinden koruyucu bir bariyer oluşturmak, yara oluşumu kolayca, özellikle sonra oluşabilir cerrahi veya mikrobiyal enfeksiyonlar2. Örnek olarak, akciğer dokusu tarafından Kistik fibrozis (CF) olanlar, özellikle de fırsatçı bakteriyel pathogen Pseudomonas aeruginosa, kolonizasyon sonucu solunum yetmezliği3airways epitel, zarar yol açar, 4. Yara iyileşmesi bir yaralı doku5normal mimarisini geri yüklemek için bir karmaşık ana bilgisayar onarım mekanizmadır. Epithelialization, anjiogenez ve kolajen üretimini ve hücre farklılaşması6,7,8 ile doku remodeling kapsayan bir yenilenme dönemi ardından ilk inflamasyon ile karakterizedir . Epitel bütünlüğünü güvenceye almak için ve mikrobiyal nükleer silahların yayılmasına karşı denetlemek için tüm canlıların savunma molekülleri, antimikrobiyal peptidler (Amper)9,10dahil üretmek. İşlem şifa yara vitro hücre artıkları ve farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler eksikliği nedeniyle benzetimini yapmak çok zordur. Ancak, uyararak sözde bir yara kapatma hızlandırmak için bir peptid vitro yeteneğini epitel hücrelerinin geçiş güvenliği aşılan bir epitel iyileşmek için onun yetenek gösterge. Gerçekten de, hücre göç yara iyileşmesinde hızı sınırlaması olay ve hücre geçiş etkileyen faktörler eğitim geliştirilmiş yara iyileşmesi için hedef tedaviler için yardımcı olacaktır.
Burada, bir çok tekrarlanabilir deneysel tahlil hücre göç içinde vitrodeğerlendirmek için özel silikon kültür ekler göre sağlanır. Konfluent hücre monolayer üzerinde 500 mikron boşluk (sözde yara) oluşturulması dayanmaktadır. Hücreler yapay "yaralı" alanının kenarındaki boş hücre alanına geçiş, yeni hücre-hücre kişiler şekillendirme başlar. Kültür Ekle hızlı yara deneyler şifa için yeni bir araç temsil eder. 500 mikron duvar tarafından ayrılmış iki rezervuarlar sağlanır ve düzgün bir 3 cm tabak tabak içine veya iyi bir 12-şey plaka yerleştirilebilir. Her Bölmesi ekleme bir hücre süspansiyon ile doldurma hücreleri ekleme kaldırma yaklaşık 500 mikron (ayrılık duvar aynı genişlikte) bir temiz boş hücre boşluk doğurmak iken izdiham kadar belirlenmiş her alanda büyümeye sağlar. Bir uygun hücre kültür testi karışımla takıma orta sonra amacına eklenebilir plaka/iyi. Daha sonra boşluğu kapatma ters bir mikroskop, tercihen bir resim alma için bir video kamera ile donatılmış altında farklı zaman aralıklarında görüntülenir. Son olarak, ölçüm değişiklikleri web tabanlı otomatik görüntü analiz programı tarafından cep kaplı alanda yaranın kapanması ve hücre geçiş hızını miktar sağlayacaktır. Genel olarak, bu yöntem klasik tahlil, burada bir çizik bile el ile steril bir iğne ile Konfluent hücre monolayers incising tarafından yapılır veya bir pipet ipucu11ile ilgili bir adım olur. Nitekim, son işlem plastik alt yemeğin yok edebilir plaka/iyi ve kırışıklıkları oluşturma yüzey kaplama. Buna ek olarak, bu son derece iğne/ipucu için araştırmacılar tarafından uygulanan basınç bağlı olarak "yaralı" alan iyi tanımlanmış genişlik boşluğu, tüm uzunluğu boyunca sahip değil. Ayrıca, yerinden çıkar hücreleri çizik kenarları canlı ve ölü hücreleri kümeleri oluşturabilir; Ayrıca, canlı hücreler "yaralı" alanının Yayilim sigara tekrarlanabilir sonuçlar12üreten hücre geçiş hızı ile etkileyebilir.
Ayrıca, sıfırdan görüntü analiz platformu sayesinde kullanıcılar hızla (dakika içinde) ek yazılım edinme gerekliliği olmadan Seçili hücrelerin göç davranışı üzerinde Nicel veri alabilir. Bu platform faz kontrast mikroskobu görüntülerini düşük (~ 5 X), orta (~ 10 X) ve yüksek (~ 20 X) büyütme analiz yeteneğine sahiptir. Görüntülerin (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff biçimi) bir zip dosyası yükledikten sonra analiz otomatik olarak alan hücre örtülü ve Karalama alanı yüzdesini, hem de hücre hızını gösteren bir Özet dosyası oluşturmak için yapılır göç, farklı zaman aralıklarında.
Bu çalışmada, bir kurbağa-cilt AMP-Türev, Yani Esc(1-21) ve onun diastereomer Esc(1-21) - 1 c13ve fonksiyonel CF transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)14,15ifade bir bronş hücre satırı kullanarak, peptid indüklenen hücre göç tedavi edilmemiş (kontrol) örnekleri ile karşılaştırıldığında bir örnek sağlanmıştır. Hava yolu epitel ve CFTR akciğer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynamak unutmayın ve onarım16yara. Ayrıca, selektif inhibitörü (Örneğin, AG1478)17 epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) aracılığıyla, geçiş bronş hücre tarafından yukarıda belirtilen peptidler indüklenen kanıt EGFR12aktivasyonu içerir, 18 bildirilir.
Özet olarak, bu yordam nasıl böyle silikon kültür ekler kullanımı doğru göç yapışık hücreleri (Örneğin, bronş epitel hücreleri) ve moleküler belirlemek için hızlı ve kolayca erişilebilen bir tahlil temsil ettiğini göstermek için hedeftir Bu tür olayları kontrol mekanizmaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre hazırlık
- Tohum 2.5x106 hücre 10 ml, en az gerekli orta (2 mM glutamin (MEMg), ile desteklenmiş MEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), antibiyotik (penisilin ve streptomisin 0.1 mg/mL) ve puromisindir (0,5 µg/mL seçimi ve bakımı için hücre satırı) bir T75 şişesi içinde. 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye 2 gün kuluçkaya. Deneme başlamadan önce kesiştiği yerde ters bir mikroskop altında hücre kontrol.
Not: deneme için kullanılan ölümsüzleştirdi insan bronş epitel hücreleri puromisindir direnci veriyor lentiviral bir vektör ile transduced hücrelerdir. Stabil bir işlevsel CFTR14,15hızlı. - Hücre izdiham 90-%100 ulaşmıştır sonra şişeye ortamından Aspire edin ve biyolojik güvenlik kabin sınıfı II altında bir atık şişe içine atın. 6 mL tamponlanmış fosfat hücrelerle serum kalsiyum ve magnezyum (CMF-PBS) yıkayın. Yavaşça şişeye el ile kaya ve CMF-PBS atın.
Not: pipet ile hücre monolayer dokunmamaya dikkat et. - CMF-PBS 10 mL ekleyin ve 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.
- CMF-PBS Aspire edin ve o atın. Sonra tripsin/EDTA 2 mL şişe için ekleyin.
- Yavaşça tamamen hücreleri ceket ve hücreleri gözle görülür bir mikroskop altında müstakil kadar 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya çözüm sağlayan şişesi, rock.
Not: kuluçka süresi sonunda, yuvarlak ve değil bağlı plastik yüzey hücreleri görünmelidir. Hücreleri de müstakil değilseniz, manuel ajitasyon gerekli olabilir. - MEMg artı % 10 10 mL ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakın ve şişeye alt yıkayarak hücreleri toplamak için. Birimin bir konik 50 mL tüp içine aktarın.
- Tüp 80 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve MEMg artı % 10 6 mL hücrelerde yeniden askıya FBS. Tekrar tekrar herhangi bir kümeleri kadar kırmaya pipet.
- Bir micropipette ile hücre süspansiyon 10 µL çıkar ve birimin kapak daha önce Burker veya Neubauer odası üzerinde koymak cam altında enjekte.
- Hücre sayısı.
2. hücre kültüründe tohum ekler
- 12-şey plaka her kuyuya, kültür Ekle steril cımbızla (şekil 1) aktarın. Plaka yüzeyine düzeltmek için ekler kenarları boyunca basın için cımbız kullanın.
Not: Yapışma sağlar bir yapışkan alt ekler var.
Resim 1 : Düzgün bir 12-şey plaka kuyu koymak silikon kültür ekler, şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Düzgün hücre süspansiyon MEMg artı % 10 oranında seyreltin FBS. Her Bölmesi ekleme hücre süspansiyon (yaklaşık 3.5x104 hücreleri/odası), 70 µL ile doldurun.
Not: Her kompartımanda uygulanan hücre yoğunluğu hücre türüne göre değişir. Bu izdiham 24 h içinde tamamlamak için yol açar bir hücre yoğunluğu kullanmak için tavsiye edilir. - Mikroskop altında Hücre Ekle bölmeleri sızıntı değil ve 37 ° C ve % 5 CO224 h 12-şey plaka kuluçkaya kontrol edin.
3. sözde yara iyileşme tahlil
- Kuluçka sonra hücreleri Konfluent hücre monolayers oluşmuş doğrulamak için ters mikroskop altında görselleştirin.
- Test bileşikler (Örneğin, amper) 1 mL MEMg yeniden askıya alma.
Not:-20 ° C'de depolanan stok çözüm başlayarak taze amper dilutions hazırlamak - Yavaşça ekler tarafından steril cımbız kaldırmak. Hücre monolayers kırmamaya dikkat et. Ekler emici kağıt üzerine aktarın.
Not: aynı ekler yeniden kullanmak için onlara en az 3 h için % 70 etanol içinde sterilize. Bu daha sonra çöpe önerilir. - Yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için iyi bir micropipette kullanarak başına MEMg 1 mL ekleyin. Plaka kapatın ve yavaşça salla.
Not: Orta kendi kesintileri önlemek için doğrudan hücre monolayers üstüne eklemeyin. - Orta Aspire edin ve MEMg 1 mL de başı ile değiştirin. Plaka kapatın ve bir video kamera ile donatılmış 4 X büyütme, ters mikroskop altında (ekler tarafından oluşturulan) boş hücre boşlukları görselleştirmek. Görüntüleri (T0) zaman sıfır ve bir .jpg biçiminde kaydedebilirsiniz.
- Orta kuyulardan kaldırmak, PBS ile 1 mL yıkar ve o atın.
- (3.2 noktada hazır) test bileşikler wells için ekleyin. Tedavi edilmemiş kontrol örnekleri için MEMg 1 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
- 15, 20 ve 24 h tedavi sonra 4 X büyütme, mikroskop altında hücre göç gözlemlemek ve görüntüleri.
Not: Bu adım sırasında esir alma imge T0 gelince aynı alanlarda çalışın. Hangi imge esir alma zaman aralıkları seçim hücre geçiş hızına bağlıdır. - Bazı seçmeli inhibitörleri, Yani AG1478, hücre göç, etkisini incelemek için ekler kaldırmadan önce her INSERT bölmesi ortamından Aspire edin.
- Her bölmesi taze MEMg ile yıkayın ve MEMg AG1478 ile desteklenmiş 70 µL ile doldurun.
- 3.3 noktasından açıklandığı gibi kuluçka 37 ° C ve %5 CO230 dk sonra devam.
Not: çamaşır adım ve hücre monolayers belirli inhibitörleri ile ön sırasında ekler kaldırmak değil dikkatli olun.
4. görüntü analizi
- Üzerinde ikmal-in deneme, görüntüleri çeşitli deneysel grupları en iyi temsil eden örnekleri seçin ve T0, T15, T20 ve T24 h tek görüntüleri içeren bir ZIP dosyası oluşturun.
Not: Tek görüntüleri tüm örnekleri için seçilen zaman aralıklarında alınır. Triplicates en az üç kez tekrarlanan her deneme için çalıştırın. Sonunda, tüm deneysel grupları, en az 3 fotoğraf ("a", "b", "c", her bağımsız deneyden türetme vb,) için her zaman noktası analiz edilir. - Belgili tanımlık fermuar eğe içine otomatik olarak seçilen zaman noktalarda (yüzde) olarak cep kaplı ve kazı bölgelerinden deneysel verileri içeren bir elektronik tablo Özet dosya e-posta yoluyla sağlayan görüntü analiz yazılımı yükleyin.
Not: Öncü ve gap alanının tanınması büyük ölçüde kenar algılama yöntemi (hangi keskin görüntü parlaklığını değiştirir noktaları belirlenmesi amaçlı) temel alır. - Verileri kaydetmek ve onları toplamak. Ortalama değer açısından tüm verilerin zaman sıfır normalleştirmek. Her zaman noktası ve göreli standart hata (SEM) tüm çoğaltır normalleştirilmiş veri ortalama değerini hesaplamak. İki yönlü Varyans analizi (ANOVA) kullanarak, uygun istatistik yazılımı ile istatistiksel analiz yapmak. Peptid tedavi grupları ve farklı zaman aralıklarında kontrol grubu arasında farklılıklar istatistiksel olarak significant bir piçin olmak olarak kabul edilir < 0,05.
- Elde edilen verileri seçili zaman aralıkları tüm örnek gruplar karşı hücre bölgeyi yüzdesini gösteren bir çubuk grafik, bir grafik çizmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı etkisi Esc(1-21) ve Esc(1-21) - 1 c fonksiyonel CFTR ifade bronş epitel hücreleri indüklenen hücre göç etkinlik açısından şifa yara belirlemek için kullanıldı. Bu tahlil, kültür ekler bir 12-şey plaka wells yerleştirildi ve her bölmesi MEMg % 10 ile desteklenmiş 35.000 hücreleri ile seribaşı FBS. Hücreleri 24 h içinde tam izdiham sonra ulaştı, bir 500 mikron boşluk oluşturulur ve her şey peptid farklı konsantrasyonlarda içeren MEMg doluydu. Deneme dört kez tekrarlandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi hücre monolayer üretilen sözde yara alan neredeyse tamamen kapanmayla sırasıyla ~ 20 h, Esc(1-21) - 1 c ve Esc(1-21), 1 mikron ve 10 mikron en uygun konsantrasyonlarda içinde iki peptidler tarafından akımıdır. Bu Esc(1-21) - 1 c bronş hücrelerdeki sözde bir yara yeniden epithelialization teşvik daha verimli olduğunu gösterir.
Resim 2 : Esculentin-1a etkisini elde edilen amper bronş epitel hücreleri monolayer içinde oluşturulan sözde bir yara kapatılması üzerine. Hücreleri silikon kültür Ekle her kompartımanda tohumlari ve onun kaldırıldıktan sonra hücre için hücre göç 15, 20 ve 24 s kanıt peptidler eklenmesinden sonra çekildi. Hücre bölgeyi noktası hesaplanmıştır her zaman yüzdesi tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Ctrl) karşılaştırıldığında ve y ekseni üzerinde bildirilir. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bir önceki çalışmada14alınır. Kontrol ve tedavi örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ve ***p< 0,0001. Her peptid, 1 mikron, Denetim ile karşılaştırıldığında konsantrasyonu içeren hücrelerin tedavisinden sonra (T0) önce temsilcisi sonuçları ve 20 h gösterilen filmler de raporlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
EGFR aktivasyonu Esc kaynaklı yara kapatma bir rol oynadı olup olmadığını doğrulamak için bronş hücreleri AG1478, EGFR, selektif inhibitörü ekleme kaldırma önce 30 dakika 5 mikron ile preincubated. Hücre bölgeyi yüzdesi önemli ölçüde peptid indüklenen otelde hücreleri inhibitörü önceki peptid yönetimiyle (şekil 3), bu işaret ön işleme değil bulundu sonuçları için karşılaştırıldığında tüm zaman aralıklarında düşürülmüştür bu yana hücre göç EGFR aktivasyonu içerir. Ancak, daha fazla çalışmaları Esc peptidler (Örneğin, doğrudan EGFR etkinleştirme veya trans-harekete geçirmek membran bağlantılı EGFR ligandlar ayırmak için gösterilen metalloproteases tarafından aracılı tarafından tetiklenen moleküler olayları açıklamak için gerekli olacak 19).
Şekil 3 : Bronş epitel hücrelerinin peptid kaynaklı geçiş AG1478 önleyici etkisi. Hücreleri ekleme kaldırma önce 5 ile önceden inkübe mikron AG1478 30 dk için ve daha sonra aynı konsantrasyonu tek başına peptid ile tedavi. Tüm veriler üzerinden dört bağımsız deneyler ± SEM anlamına gelir ve bizim önceki iş14alınır. Belirtilen grup örnekleri arasında testleri için istatistiksel anlamlılık düzeyleri şunlardır: *p< 0,05; p< 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre göç yara iyileşmesi, embriyonik gelişim ve kanser metastaz dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli bir süreçtir. Hücre göç vitro çalışma temel yordamı içerir: (i) bir hücre monolayer, (ii) hücreleri, Konfluent tabakası sözde bir yarada üretimi oluşturulması (III) yara kadar farklı zaman aralıklarında görüntüleri yakalama kapatma ulaştı , (iv) seçilen hücreleri geçiş hızını ölçmek için görüntü sırası analizi.
Sonuçlarımız kültür ekler uygulanması objektif ve hücre geçiş özellikleri kantitatif değerlendirilmesi için güvenilir deneysel teknik olduğunu göstermiştir. Bu tahlil temel laboratuvar ekipmanları ile herhangi bir araştırma grubu tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, bazı kritik adımlar Protokolü'nün tekrarlanabilirlik ulaşmak için düşünülmelidir. Örneğin, pilot deneyler, tohum izdiham tüm bireysel örneklerde aynı ölçüde almak için her yerde hücrelere tam sayısını tarafından tanımlamak önemlidir. Bu amaç için bir eşitlenmiş döngüsü aşama hücrelerle olan ve tohum önce hücre kümeleri kaçınmak önemlidir. Topaklanma en aza indirmek için mümkün bir şekilde hücre süspansiyon bir şırınga iğnesi ile nazik bir geçiştir. Ancak, örnekleri boyutunu artırarak önemli ölçüde değişkenlik hücreleri arasında düşmesine katkıda bulunacaktır.
Buna ek olarak, tüm örnekleri iyi tanımlanmış bir genişliğe sahip bir boşluk oluşturulması çok önemlidir. Bu amaçla, silikon ekler iki kat daha fazla yeniden kullanılmamalıdır. Ayrıca, silikon ayrılık duvar altında hücrelerinin büyümesini kaçınılmalıdır. Bu sorunları önlemenin, yumuşak basınç INSERT, üstüne bir kez yerleştirilen amacına plaka/iyi, el ile eklemek için plastik yapışma artırmak için steril cımbız vasıtasıyla uygulanabilir. Dikkatli eklemek kaldırılması da boş hücre yüzey genişleme hücre monolayer bozulma ile engel olacaktır.
Ancak, bir kez eklemek doğru yerinden ve sahte bir yara mükemmel üretilen, bazı hücre hatları özellikle serum veya Takviyeler Vitaminler, amino asitler ve büyüme faktörleri gibi olmadan ortamda inkübe Eğer plastik yüzeyden bağlantısını kesin. Hücre kültürü ortamında bu faktörler yokluğu onlar yara iyileşmesi teşvik faaliyetle test bileşiklerin engelleyebilir gerçeği tarafından dikte. Bu sorunu aşmak için kültür orta kompozisyon rasyonel seçim önerilir.
Bir kritik adım yordam Şifa Bu yarayı ayarlamadan önce düşünün için farklı hücre türleri arasında bulunan farklı geçiş hızıdır. Ayrıca bu durumda, ön deneyler görüntüleri yakalanması gerekiyor doğru zaman aralıkları belirlemek amacı ile planlanmış olması gerekir. Bu yöntem ile ilişkili bir sınırlama böyle kültür ekler geçiş süspansiyon (örneğin polimorfonükleer lökositler) yetişen hücre eğitimi için istihdam olamaz düşünün gereklidir.
Yara iyileşmesi deneyleri gerçekleştirilen rağmen silikon kültürü ile ekler daha klasik kazı kazan tahlil daha pahalıdır, onlar hücre göç faaliyete veri hızlı ve doğru üreme sağlar. Sistem Kurulum olduğunda, önemlisi, bu etkinlik endojen veya eksojen faktörler tarafından uyarılan şifa yara temel moleküler mekanizması üzerinde genişletmek için kullanılabilir. Bu amaçla, hücre monolayers belirli molekülleri (Örneğin, inhibitörleri) ile Önarıtma sözde yara oluşturmadan önce yapılabilir. Bir örnek Önarıtma amper tarafından indüklenen "yaralı" alan kapatılması doğrulamak için hücre bölünmesi oranı20 veya (ii) metalloprotease inhibitörleri tarafından etkilenir olup olmadığını keşfetmek için (i Hücre proliferasyonu engelleyici mitomycin C içeren hücrelerin şöyle verilir: katkısını metalloproteases içinde harekete geçirmek EGFR aracılı sinyalleşme yolu12.
Önemlisi, yara kapatma işlemi sırasında örnekleri olabilir sabit ve sitoiskeleti ve çekirdekleri algılama için uygun lekeleri ile tedavi (phalloidin ve DAPI, sırasıyla) değişiklikleri hücre morfolojik açıdan görselleştirmek için (Örneğin, lamellipodia ön kenarında oluşumu) floresan/confocal mikroskobu tarafından. Ayrıca, tedavi floresan etiketli AMP ile hücre hücresel dağılımı (membran yüzey veya hücre içi/intranuclear Yerelleştirme), farklı zamanlarda hücre göç Etkinlik başlangıcından bu yana görselleştirme sağlayabilir. Ayrıca, bu uçlar yara iyileşme faaliyete polarize ve farklılaştırılmış epitel hücreleri (örneğin, birincil bronş hücreleri hava-sıvı arayüzü muhafaza), onlara uygun transwell yerleştirilen sonra analiz etmek için istismar geçirgen destekler.
Sonuç olarak, açıklanan yöntemi yapisan hayvan hücreleri/epitel doku farklı türde göçmendir özellikleri yanı sıra en umut verici yara iyileşmesi yelpazesi anlayış belirgin şekilde artırmak için önemli potansiyele sahip Organizatör ve/veya inhibitörleri, kısa bir süre içinde ve yüksek doğruluk ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bu eser Sapienza Roma Üniversitesi ve İtalyan Kistik fibrozis araştırma Vakfı (proje Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny ve Pavia FFC heyetleri tarafından benimsenen FFC #11/2014) fon tarafından desteklenmiştir. Bu eser parçası da FILAS Grant Prot FILAS-RU-2014-1020 tarafından desteklenmiştir.
Bronş epitel hücreleri sağlamak için Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, İtalya) için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
