Summary
Här presenterar vi en protokoll bild mänskliga bukspottkörteln avsnitten i tre dimensioner (3D) med optimerad passiv clearing metoder. Detta manuskript visar dessa förfaranden för passiva optiska clearing följt av flera immunofluorescens färgning för att identifiera viktiga delar av de autonoma och sensoriska neuronnät innervating mänskliga holmar.
Abstract
Med traditionella histologiska metoder, forskare hämmas i sin förmåga att bilden hela vävnader eller organ i storskaliga 3D. Histologiska sektioner är vanligen begränsade till < 20 µm som formalin fast paraffin avsnitt på glasskivor eller < 500 µm för fritt flytande fasta sektioner. Därför omfattande insatser krävs för seriell sektionering och storskaliga bild återuppbyggnad metoder för att återskapa 3D för prover > 500 µm med traditionella metoder. Dessutom lätta scatters från makromolekyler i vävnader, särskilt lipider, förhindrar imaging djup > 150 µm med mest confocal Mikroskop. Att minska ljusspridning och som möjliggör djup vävnad bildåtergivning med enkel konfokalmikroskopi, har det utvecklats olika optiska röjningmetoder att relevanta för gnagare och mänskliga vävnadsprover korrigeras genom nedsänkning. Flera metoder är relaterade och använda protein crosslinking med akrylamid och vävnad röjning med sodium dodecyl sulfate (SDS). Andra optiska clearing tekniker används olika lösningsmedel om varje ändring hade olika fördelar och nackdelar. Här, beskrivs en optimerad passiva optiska clearing-metoden för studier av den mänskliga bukspottkörtel innervationen och specifikt för förhör av innervationen av mänskliga holmar.
Introduction
Tills nyligen utfördes 3-dimensionell (3D) rekonstruktion av stora vävnader eller hela organ genom mödosamma seriell snittning, färgning och bildrekonstruktion av flera avsnitt. Dessa metoder hade flera nackdelar inklusive beroendet av ett stort antal seriella sektioner, dålig vävnad penetration med antikroppar och ljus spridning förebygga djupa imaging inom vävnader. För att möjliggöra större ljus och antikropp penetration har utvecklat forskare kemiska metoder för att bevara proteinantigener medan du tar bort majoriteten av ljus-scattering lipider. Flera relaterade metoder är Clear Lipid-Exchanged akrylamid-hybridiserad styv Imaging vävnad hYdrogel (klarhet), passiv tydlighet teknik (PACT) och Perfusion-assisted Agent Release i situ (PARS) (recenserade i 1,2 ,3,4,5,6). Metoden klarhet är baserad på stabilisering av proteiner med hjälp av en formaldehyd, akrylamid och bis hydrogel följt av lipid borttagning med hjälp av elektrofores i en SDS lösning2. Detta synsätt ändrades senare för passiv clearing och avancerad bildbehandling7. Ytterligare optimering ledde till avskaffandet av bis och varierande procentandelar av PARAFORMALDEHYD i hydrogel lösningen (1-4%) att erhålla optimala antigen stabilisering med kortast clearing tid för en teknik som kallas pakten 8. Tidiga försök att utveckla dessa optiska clearing tekniker inblandade organiska eller andra föreningar som var svåra att arbeta med och kylda endogena fluorescerande proteiner i transgena musmodeller. Dessa ytterligare metoder ingår skalor, obehindrad hjärnan/kroppen Cocktails och Computational analys (kubik), växel och Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organ (DISCO) metoder, alla med olika fördelar och nackdelar9, 10,11,12. Den ursprungliga tydlighet-metoden utvecklades i lipid-rika mus hjärnvävnad och optiska röjningmetoder hade begränsad testning i mänskliga vävnader7,8,11,13,14 .
Optiska röjningmetoder är idealiska för spårning nerver över långa avstånd som intakt mus centrala nervsystemet. Bukspottkörteln är väl innerveras av både sensorisk och autonom nervsystem. Pankreas endokrina facket, Langerhanska öar, utgör en mycket liten del av hela orgeln (1-2%) och holmar har känt heterogenitet i storlekar (50-250 µm), endokrina cellen proportioner och densitet särskilt vid diabetes (recenserade i 15 ,16). Utveckla ett protokoll, flera optiska röjningmetoder testades för mänskliga bukspottkörteln och en pakt förfarande konstaterades för att tillhandahålla den bästa balansen mellan tid att rensa (~ 2 veckor) med utmärkta morfologiska bevarandet av nerver och holmar. Den slutliga optimerad beskrivs här i avgränsningen av neuro-trångsynt nätverket för storskaliga (millimeters avstånd) och högupplösta 3D imaging av flera intakt Langerhanska. Tekniken är lämplig för mänskliga bukspottkörteln direkt efter upptagning eller efter lagring samt prover fast i neutral buffrad formalin och inbäddade i paraffin vax. Proven är lämplig för avbildning av confocal eller lightsheet mikroskopi.
Protocol
Alla experiment genomfördes i enlighet med University of Florida institutionella Review Board och federala riktlinjer.
Varning: PARAFORMALDEHYD och akrylamid är giftiga irriterande. Hantera reagenser i dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar, skyddsglasögon).
1. avparaffinering av formaldehyd-fasta vävnader (om arbetar med friska vävnader, hoppa över till steg 2)
- Använd en nya rakblad eller skalpell skära genom paraffinet vinkelrätt mot ytan av vävnad. Skär paraffinet vid kanten av vävnaden till slut lossnar det. Använd tång eller en spatel försiktigt lossa och ta bort vävnaden rensas optiskt. Försiktigt skrapa överskott paraffin från vävnaden med hjälp av en spatel (figur 1A).
- Fyll en glasbehållare med xylen (ca 30 mL för en 3 x 3 x 3 mm avsnitt vävnad) och inkubera vävnaden i denna lösning under 24 timmar vid rumstemperatur (RT).
- Fyll en annan glasbehållare med färska xylen med samma volym som 1.2.1. Överföra och inkubera vävnaden i denna lösning för 24 h vid RT.
- Placera 100% etanol i ett koniskt rör med samma volym som 1.2.1. Överföra och inkubera vävnaden i denna lösning för 24 h vid RT.
- Placera 95% etanol i ett koniskt rör med samma volym som 1.2.1. Överföra och inkubera vävnaden i denna lösning för 24 h vid RT.
- Placera 70% etanol i ett koniskt rör med samma volym som 1.2.1. Överföra och inkubera vävnaden i denna lösning för 24 h vid RT.
- Skölj vävnaden i 0,01 M fosfatbuffert buffrad saltlösning (PBS) och plats i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning i ett koniskt rör temperera för 24 h vid RT. se till att vävnaden är fri från paraffin (figur 1B, högra panelen).
2. Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fixativ
- Överför med pipett 10 mL 16% PFA till en 50 mL konisk rör, lägga till 4 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning och 26 mL destillerat avjoniserat vatten (ddH2O). Stäng locket och blanda kort.
- Större volymer av 4% PFA kan göras före och frysta i alikvoter. Alikvoter är bra för 1 dygn i rumstemperatur (RT), en vecka vid 4 ° C och 1 månad vid-20 ° C.
3. bukspottkörteln fixering
- Fixa bukspottkörteln provet (≤ 1 x 1 x 2 cm) i nylagade 4% PFA vid 4 ° C för 48 h. Om provet är större än 1 x 1 x 2 cm, använda en skalpell eller rakblad för att dissekera in mindre bitar inte mer än 1 cm tjock. Tvätta vävnadsprov tre förändringar av 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning för minst 15 min varje tvätt och lagra i 15 mL centrifugrör i 0,01% PFA/0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning eller 0,5% natrium natriumazid/0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning fram till användning.
- Efter fixering, avsnitt vävnaden i 1-2 mm tjocka sektioner för vidare bearbetning. Använd en vibratome för att hjälpa även snittning.
Obs: Det slutliga antalet sektioner kommer att bero på storleken på Start provet.
4. bädda in vävnaden i Hydrogel
- Förbereda 200 mL 4% akrylamid/1% PARAFORMALDEHYD (A4P1) hydrogel monomeren lösningen enligt följande:
- Placera en kolv på isen i en hink på toppen av en magnetisk uppståndelse tallrik. Kontrollera att kolven sitter platt och lägga till en magnetisk uppståndelse.
- Lägg till följande i ordning: 147,8 mL kall (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, 20 mL kall (4-8 ° C) 40% akrylamid lösning, 12,2 mL 16% PFA lösning och 250 mg VA-044 initieraren. Blanda hela hydrogel lösningen med magnetiska rör bar i minst 10 min och låt lösningen på is för nästa steg.
- Placera en 15 mL koniska rör i isen intill den kolv som innehåller hydrogel lösningen. Pipettera 14 mL av monomeren lösningen i röret och Lägg en bit av den 1-2 mm tjock fast vävnadsprov. Sedan cap röret.
- Inkubera provet i monomeren lösningen i 3 dagar vid 4 ° C och skyddas från ljus. Alikvotens eventuella återstående monomeren lösningen och förvaras vid-20 ° C för framtida bruk.
5. degas monomeren lösningen och polymerisera av Hydrogel
- Ta bort syret från hydrogel monomeren lösningen med gasformiga N28.
- Förbereda en hink med is och placera provet i hydrogel monomeren lösningen på is.
- Samla 2-3, 18 gauge-kanyler per prov, paraffin filma och en timer. Anslut slangen till kväve tank så att kvävet kan flöda. Samtidigt hålla provet på is, noggrant hål locket på ett koniskt rör som innehåller provet på ena sidan och tryck på en hypodermic needle igenom tills det är under ytan av den flytande monomer lösningen.
- Använda en annan injektionsnål punktera den motsatta sidan av den gemensamma jordbrukspolitiken, men låt inte det bli nersänkt.
Obs: Den andra nålen kommer att ventilera röret. - Anslut slangen från kväve tanken till den injektionsnål nedsänkt under hydrogel och Vrid långsamt på kvävgasen tills det bubblar stadigt genom vätskan.
- Att kvävet bubbla genom vätskan i 10 min.
- När syret tas bort, snabbt ta bort båda nålar och täcka den gemensamma jordbrukspolitiken med en paraffin film att hindra varje ytterligare utbyte av gaser mellan röret och miljö. Placera avgasade provet i en inkubator vid 37 ° C för 3 h att polymerisera av hydrogel.
6. vävnaderna Clearing
- Förbereda 500 mL clearing lösning (4% SDS vid pH 8,5). ~ 300 mL av ddH2O, tillsätt 50 mL 0,1 M PBS och 20 g SDS pulver under omrörning med magnetiska rör bar. Justera om lösningen med natriumhydroxid och saltsyra till pH 8,5. Lägg till ddH2O tills den slutliga volymen är 500 mL.
- Efter polymerisation, häll bort överflödigt hydrogel och kassera den kemiska avfall behållare. Använda en pappershandduk för att försiktigt torka bort hydrogel från provet och släng i en kemisk avfall behållare.
- Tvätta provet i 3-5 utbyte av 0,01 M PBS (kassera tvättvätskan i det kemiska avfallet) för 15 min varje tvättningen. Över provet till en 50 mL konisk slang med 40 mL rensa bufferten.
- Inkubera provet i clearing bufferten vid 37 ° C och ändra prov till färska clearing buffert varannan dag.
- Lämna provet i clearing bufferten för 2-8 veckor beroende på urvalets storlek (~ 8 veckor för en 3 x 3 mm 3 mm prov) för att säkerställa korrekt clearing.
- Övervaka vävnad clearing och stoppa när du är klar. Säkerställa att provet är tillräckligt transparent av håller upp ljuset att kontrollera för korrekt röjning (vanligtvis några tan färg förblir i exokrina regioner).
Obs: Ett alltför rensas prov visas nött på kanterna och textur kommer att vara mycket mjukt när plockade upp med pincett. Det är vanligt att provet att rensa ojämnt. Vävnaden blir också inte helt öppet tills placeras i montering media (Infoga, figur 1 c).
7. flera immunofluorescens
- Tvätta proverna på en shaker vid 60 rpm på RT för en dag med 40 mL 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning ändra till färska buffert ofta (4-5 buffert förändringar i totala, 40 mL varje tvätt, ändra varje h tills den sista tvättningen). Låt den sista tvättningen fortsätta natten på RT.
- Förbereda pakten färgning buffert. Lägga till 50 mg natriumazid och 0,5 mL TritonX-100 till 500 mL 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. Blanda väl.
- Inkubera provet med primära antikroppar.
- Lägga till 2% normala serum (samma art som den sekundära antikroppen) i bas pakten färgning buffert i en 2 mL platt botten tube (minst 1 mL totalvolym rekommenderas per prov/rör).
- Lägg till primär antikropp till 2% serum/pakten färgning buffert. Använd ca 5 x mängden primär antikropp för pakten färgning som skulle användas för standard immunohistokemi (dvs. om en antikropp är utspädd 1: 500 för standard immunohistokemi, användning 1: 100 för pakten färgning).
- Använd en spatel för att ta bort provet från tvättbufferten och badda överskott bufferten på en pappershandduk och placera i röret med en primär antikropp-lösning.
- Inkubera 2-4 dagar på RT på en shaker vid 60 rpm. Tvätta prover på RT på en shaker på 60 rpm i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning förändras till färska buffert 4 - 5 gånger och lämnar den sista tvätten på natten som i steg 7,1.
- Inkubera prover med sekundära antikroppar.
- Lägga till 2% normala serum (samma art som den sekundära antikroppen) i bas pakten färgning buffert i en 2 mL platt botten tube (1 mL totalvolym rekommenderas per prov/rör).
- Lägg till sekundära antikroppar vid en koncentration på 1: 200 (5 µl i 1 mL buffert).
Obs: Litet format antikroppar är rekommenderad samt mycket cross-adsorberat antikroppar om du använder fler än en primär antikropp. - Använd en spatel för att ta bort provet från tvättbuffert och badda överskott bufferten på en pappershandduk och placera i röret med en sekundär antikropp-lösning.
- Inkubera vid RT på en shaker vid 60 rpm i 2 dagar och ljuskänsligt provet.
- Tvätta proverna, som i steg 7,1, på RT på en shaker på 60 rpm i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning förändras till färska bufferten 4 - 5 gånger och lämnar finalen tvätta på övernattning, skyddas från ljus under tvättar.
8. Montera prover för avbildning
- Förbereda brytningsindex matchade lösning (fälgar) bufferten.
- Väg in 11 g icke-jonisk täthet lutning medium (t.ex. Histodenz) och noggrant överföra till en 50 mL konisk slang.
- Lägg till ~ 5 mL 0,02 M fosfat buffert (PB)8 med hjälp av en spatel för att släppa luft från pulver nonjoniska täthet lutning medlet.
Obs: Lösningen kommer att vara mycket viscous, blanda väl. - Ta volymen till 10 mL med fler PB, blanda med en spatel och skrapa överskottet av spateln i röret.
- Inkubera fälgar vid 37 ° C tills upplöst, Invertera och blanda försiktigt efter behov.
- Över prover till fälgar. Pipettera 1 mL fälgar i en 2 mL platt-botten tube gör så. Använd en spatel för att ta bort provet från tvättbuffert och badda överskott bufferten på en pappershandduk och placera i röret med fälgar lösning.
- Knacka försiktigt på röret för att dränka provet i fälgar. Placera prover i fälgar på bänken skyddas från ljus på RT för 2-4 dagar innan imaging.
- För att bilden, placera en liten mängd av fälgar i en 8-väl täckglas botten kammare bild. Bara Lägg precis tillräckligt för att belägga botten, mer kommer att orsaka provet att flyta vilket gör det svårare att bilden på en inverterad omfattning. Lägg provet till brunnen och mössa i bilden för avbildning.
9. imaging
- Konfokalmikroskopi och bildhanteringsprogram
- Välj lämplig lasrar för magnetisering och utsläpp spektra av den fluorophores som används för att färga pakten proverna. Justera inställningarna för programvaran förvärvet så att någon överlappning mellan kanalerna elimineras. Använd separata spår vid behov (när två fluorophores har liknande excitation spectra).
- Ställa in bild förvärv
- Välja maximal förvärv hastighet, 16 bit, 4 eller fler medelvärden och 1024 x 1024 upplösning eller bättre.
- Zooma in objektet som ska avbildas.
Obs: Detta kommer minska förvärv tid att minska foto-blekning och också minska filstorlek och nedströms redigering.
- Setup z-stacken.
- Välj den optimalt sektionering för målet som används. Om deconvolution önskas senare, använda en z-steg mindre än optimal såsom 1 µm.
- Använd z-stack korrigeringen.
- Påbörja närmaste ytan av vävnaden och öka vinsten eftersom målet fokuserar genom z-planet och lägga till korrigeringar. Ändra inte inställningarna för laser för korrigering!
- Förvärva en test stack med en genomsnitt, 512 x 512 upplösning och högsta förvärv hastighet. Kolla på bilden i 3D för att kontrollera att det är lika ljusstyrka under hela stacken för varje färg innan den slutliga högupplösta z-stacken.
- Lightsheet Imaging
- Säkerställa att proverna har varit jämviktas i fälgar för avbildning för minst 24 h. idealiskt, överföra proverna till färska fälgar i imaging kammaren och temperera i kammaren för minst en dag.
- Montera provet för avbildning
- Välj den minsta (svart) kapillären att montera provet
- Använd spackel eller en maträtt för att hålla provet samtidigt tillämpa superlim till slutet av kapillären. Limma vävnaden som kapillären röra så lite en yta av vävnad som möjligt.
- Infoga provet för avbildning.
- Bild med 5 X eller 25 X mål lämplig för optiskt rensas prov använder pivot Skanna alternativet. Om skuggning eller oskärpa uppstår, rotera provet och försök igen, eller låt provet fortsätta temperera i fälgar.
Obs: En 1 mm bunt kan vanligtvis förvärvas på mindre än fem minuter, beroende på inställningarna. - Visa och redigera de bildstaplar med hjälp av bild analys programvara.
Representative Results
Dessa färgning förfaranden har utvecklats för att ge en storskalig undersökning av mänskliga bukspottkörteln att undersöka holmar och associerade autonoma och sensoriska nätverk. Flera tillvägagångssätt testades inklusive tydlighet7, iDISCO17, och pakten8 med metoden pakten funnit bäst lämpad för mänskliga bukspottkörteln och confocal imaging.
Primära antikroppar testades först på fast mänskliga bukspottkörteln prover med lämpliga positiva och negativa kontrollprover (mus hjärnan, andra). Den primära antikroppar och föreslagna utspädningar listas i Tabell av material, även om varje laboratorium kan räkna med att optimera antikropp utspädningar beroende på hel antal och vävnad källa. Primär antikropp parti-för-parti variationen kan påverka färgning intensiteten och specificitet och kräver verifiering att uppnå samma grad av fläcken intensitet som med tidigare reagenser.
I mänskliga bukspottkörteln, var holmar avgränsad av insulin, glukagon och secretogranin 3 (figur 2). Schwann celler var avgränsad använder glial fibrillary acid protein (Fredsgenomförande, figur 2 och figur 3A). Nerver som färgas med antikroppar mot den parasympatiska markör vasoaktiv intestinal peptiden (VIP) var avbildad på Lightsheet (figur 3B). Sympatiska nerver kan ses med färgning för tyrosin hydroxylas (visas inte).
Figur 1. Mänskliga bukspottkörteln optiska clearing. (A) ett rakblad används för att skära och lossa ett avsnitt av paraffin-inbäddat vävnad (översta paneler) innan du tar bort avsnittet vävnad och skrapa bort överflödig paraffin från vävnaden (bottenpaneler). Representativa vävnadsprover visas före (B vänster, C överst) och efter (B rätt, C mitten) optisk clearing av paraffin-inbäddat vävnad, som beskrivs i avsnittet protokoll. Avmarkerad, fasta vävnaden inte är helt transparent efter röjning (B rätt, C top) och ofta vävnad svullnad kan vara uppskattat (C, mellersta panelen). Rensas vävnaden blir helt transparent efter Jämviktstiden i fälgar (C, nedre panelen). Skala barer: 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Neuro-trångsynt personalnätverk. Mänskliga bukspottkörteln prover rensades som beskrivs från nPOD organdonatorer eller från arkivens paraffin-inbäddat vävnader. (A-D) Schwann celler (Fredsgenomförande +, vita) och endokrina celler visas missfärgade av insulin (röd) och glukagon (grön). (A) Confocal mikroskopi och maximal intensitet projektion (MIP) visar spårning av Schwann celler (Fredsgenomförande +) på nerverna coursing bredvid blodkärlen holme periferi och utvidga till kobbar och skär. Infällt visar hög upplösning erhålls och visar kontakt mellan Fredsgenomförande + Schwann celler och endokrina celler. (B) en 3D-bild av panelen (skala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. Ett paraffin-pakten prov visas avbildas via konfokalmikroskopi och presenteras som en max intensitet projektion (C) och i 3D (D), skala: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Skala barer A, C: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. 3D-visualisering och bindningstråd. Tre sydda bildstaplar förvärvades av Schwann celler färgas med Fredsgenomförande och konfokalmikroskopi och spåras med hjälp av en neurite tracer plugin i bild analys programvara. (A) 3D fyllningen av spårningen visas (skala barer: x = 150 µm, y = 200 µm (0.2 mm), z = 120 µm) (B) A pakten provet var fläckade av VIP antikropp och avbildas med lightsheet Mikroskop. Stacken är > 1 mm i djup och nervfibrer ses tydligt i hög upplösning. Fibrer som inslagning en kanal (förgrunden, D) och en ganglion (G, bakgrund) kan ses (stort rutnät: x, y, z = 200 µm; Markera märken: x, y, z = 40 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Tillgången på nya optiska röjningmetoder har tillåtit exempellösa storskaliga undersökningar av centrala och perifera nervsystemet i djurmodeller. Den övergripande innervation mönstren av mänskliga bukspottkörteln är till stora delar outforskat på grund av vävnad densitet och svårigheter att förvärva hög kvalitet biospecimens. Detta protokoll erbjuder en optimerad vävnad clearing protokoll för mänskliga bukspottkörteln vävnad från antingen fasta eller paraffin-inbäddat arkivens prover.
Klarnande tid beror på stickprovsstorleken, fixativ typ, längd, lagring varaktighet och kan kräva 1-8 veckor, så följande överväganden är kritiska. Det är bäst att rensa vävnader snart efter 4% PFA fixering om möjligt eftersom långsiktig lagring ökar avfärgningstiden. För att minimera avfärgningstiden, minskade mängden PFA i hydrogel monomeren från 4% som används i fixering steg 1% för mänskliga bukspottkörteln. För andra vävnader, särskilt mus vävnader, bestämmas mängden PFA nödvändigt att tillhandahålla tillräcklig hydrogel styvhet att bevara antigenerna empiriskt. Adekvat clearing är också viktigt eftersom antikropp penetration reduceras i dåligt rensade vävnader och ytan färgning av sekundära antikroppar ökas. Ändra den röjning lösningen är varannan dag (eller, även dagligen) bäst att hålla pH konstant och rengöringsmedel färska. Omvänt över clearing negativt påverkar cellernas morfologi och ökar vävnad sprödhet. Eftersom vissa bukspottkörteln prover rensa ojämnt på grund av inneboende patologier såsom regionerna fibros från kronisk pankreatit eller andra sjukdomar, är det viktigt att ofta övervaka denna process. Användning av vibratome tjocka sektioner kan också användas för att göra enhetliga tjocklekar men krävs inte. Övervakning clearingen, så prover tas bort från tvättmedel så snart ljuset passerar enkelt genom provet, garanterar att provet tillräckligt är avmarkerad.
Antikropp penetration och ytan färgning är viktiga frågor att överväga med pakten prover. För att säkerställa bra antikropp penetration, är det viktigt att Inkubera prover med de primära antikropparna i minst 2 dagar. Olika antikroppar har olika diffusion priser och bör optimeras individuellt, men för de flesta antikroppar, 4 dagar var tillräcklig varaktighet för full genomträngning i ett 1 mm3 prov. Om surface färgning är ett problem, särskilt för Lightsheet imaging, provet kan skäras i hälften eller ytan dissekeras bort efter färgning. Litet format antikroppar när tillgängliga skulle förväntas bistå med vävnad penetration8. Preconjugated antikroppar verkar inte fungerar samt samma okonjugerat klonen och högre bakgrund från ospecifik bindning och fattigare vävnad penetration kan observeras om de fungerar alls. För förbättrad framgång med preconjugated antikroppar, öka serum och TritonX-100 koncentrationer i färgningen buffert och använda längre inkubationer (> 4 dagar). Efter färgning, är inkubation av provet i fälgar i flera dagar kritisk. Rensas vävnader svälla i PBS och fälgar inkubation orsakar dem att krympa tillbaka till den ursprungliga storleken. Speciellt med lightsheet imaging, bör provet vara fullt jämviktas innan imaging.
När imaging prover på confocal mikroskopet, måste korrigeringen ställas in varje gång en ny position väljs. Olika förvärv djup och variation i färgning intensitet under hela vävnaden kräver justeringar för varje område av vävnad att avbildas optimalt. Likaså måste de sekundära antikroppar används övervägas noggrant. Spektral minoriteter är utmanande i pakten prover, så fluorophores måste väljas på lämpligt sätt för en låg excitation eller utsläpp överlappning för en ljus signal när du filtrerar på mikroskopet confocal utsläppen. För varje ansökan, måste en balans uppnås mellan upplösning, bildbehandling hastighet och brusreducering så att den bästa bildkvalitet kan förvärvas utan foto-blekning. Högre upplösning än 1024 x 1024 är inte upptäckas av det mänskliga ögat, men kan vara nödvändigt för vissa applikationer om kvantifiering av en fläck behövs.
I området i närheten finns det många saker att tänka på när du väljer en optisk clearing teknik och när du väljer optisk clearing över andra mer traditionella metoder. Antigener som låg överflöd kan inte upptäckas med metoden pakten således finns det begränsningar på antigen detection. Vissa antigener såsom immunologiska antigener (CD3, CD4, CD8, etc.) förstörs av metoden pakten och är påvisas trots hög kvalitet antikroppar tillgängliga att upptäcka dem. En annan begränsning med denna metod är det inneboende variabilitet mellan givare bukspottkörtlar som är svåra att urskilja förrän efter clearing färgning. Varje givare vävnad tenderar att rensa och fläcken likaså mellan förfaranden, men olika givare vävnader har mycket varierande röjning gånger och vävnad morfologi kvalitet efter röjningen. Förmågan att använda arkivbeständigt vävnad kan mildra denna begränsning om man kan ha tillräcklig tillgång till ett stort antal patientens bukspottkörtel prover även om detta inte har undersökts grundligt. PAKTEN protokollet rapporteras häri konstaterades vara billig och lätt genomförs med vanlig laboratorieutrustning. Rensas prover var lämpliga för imaging via traditionella konfokalmikroskopi, samt 2-photon och Lightsheet teknik och förutsatt högupplösta 3D-bilder av nerver och skär i stora delar av mänskliga bukspottkörteln. Framtida tillämpningar av detta förfarande omfattar studier om utvecklingen av fostrets bukspottkörteln för både exokrina och endokrina fack och holme studier i typ 1 och typ 2-diabetes.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Ann Fu och Joseph Canzano för tekniskt bistånd, Dr. Jennifer Treweek för ovärderliga råd och Dr. Kristin Overton och Dr. Karl Deisseroth för utbildning för MCT: er via Stanford University tydlighet verkstaden. JDRF nPOD och orgel upphandling organisationer också vävnadsprover. Detta arbete finansierades av JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) och NIDDK 1OT2 TR001773 för MCT: er.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
