Summary
Hier presenteren we een protocol bij afbeelding menselijke alvleesklier secties in drie dimensies (3D) met behulp van geoptimaliseerde passieve methoden wissen. Dit manuscript toont deze procedures voor de passieve optische clearing gevolgd door meerdere immunofluorescentie kleuring ter identificatie van de belangrijkste elementen van de autonome en zintuiglijke neurale netwerken innervating menselijke eilandjes.
Abstract
Met behulp van traditionele histologische methoden onderzoekers worden belemmerd in hun vermogen om de hele afbeelding weefsels of organen in grootschalige 3D. Histologische secties zijn over het algemeen beperkt tot < 20 µm als formaline vaste paraffine sectie op glas dia's of < 500 µm voor vrij zwevende vaste secties. Dus uitgebreide inspanningen zijn vereist voor seriële segmenteren en grootschalige spiegelbeeld wederopbouw werkwijze te herscheppen van 3D voor monsters > 500 µm met behulp van traditionele methoden. Daarnaast licht verstrooit van macromoleculen in weefsels, met name lipiden, voorkomt imaging tot een diepte > 150 µm met meest confocal microscopen. Om lichte scatter en diepe weefsel geschikt zijn met behulp van eenvoudige confocale microscopie, hebben verschillende optische clearing methoden ontwikkeld dat relevant voor knaagdieren en menselijke weefselsteekproeven door onderdompeling verholpen zijn. Verschillende methoden zijn gerelateerd en gebruik van eiwit crosslinking met acrylamide en weefsel clearing met natrium dodecyl sulfaat (SDS). Andere optische clearing technieken gebruikt verschillende oplosmiddelen, hoewel elke wijziging had verschillende voor- en nadelen. Een geoptimaliseerde passieve optische clearing methode wordt hier beschreven voor studies van de menselijke alvleesklier innervatie arm en specifiek voor de ondervraging van de innervatie van menselijke eilandjes arm.
Introduction
Tot voor kort werd 3-dimensionale (3D) reconstructie van grote weefsels of hele organen uitgevoerd door moeizame seriële afdelen, kleuring en afbeelding wederopbouw van meerdere secties. Deze methoden had verscheidene nadelen met inbegrip van de afhankelijkheid van een groot aantal seriële secties, arme weefsel penetratie met antilichamen en licht verstrooiing preventie diepe imaging in weefsels. Als u wilt toestaan voor meer licht en antilichaam penetratie, ontwikkeld onderzoekers chemische methodes voor het behoud van eiwit antigenen tijdens het verwijderen van de meerderheid van de licht-verstrooiing lipiden. Verschillende gerelateerde methoden zijn Clear Lipid-Exchanged Acrylamide-gekruist rigide Imaging weefsel hYdrogel (helderheid), passieve duidelijkheid techniek (PACT) en perfusie-bijgewoonde Agent Release in situ (PARS) (herzien in 1,2 ,3,,4,,5,6). De duidelijkheid-methode is gebaseerd op de stabilisatie van de eiwitten met een formaldehyde, acrylamide en BIB hydrogel gevolgd door verwijdering van de lipide elektroforese met SDS oplossing2. Deze aanpak werd later aangepast voor passief clearing en geavanceerde imaging7. Verdere optimalisatie leidde tot de afschaffing van de BIB en verschillende percentages van paraformaldehyde in de hydrogel oplossing (1-4%) voor optimale antigeen stabilisatie met de kortste clearing tijd voor een techniek genaamd PACT 8. Vroege pogingen om deze optische clearing-technieken te ontwikkelen betrokken biologische of andere verbindingen die moeilijk te werken met en gehard endogene fluorescente proteïnen in transgene muismodellen waren. Deze extra methoden opgenomen schalen, onbelemmerd hersenen/Body Cocktails en rekentijd analyse (CUBIC), methoden van de SWITCH en Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organen (DISCO), allen met verschillende voor- en nadelen9, 10,11,12. De originele duidelijkheid-methode werd ontwikkeld in hersenweefsel van lipide-rijke muis en optische clearing methoden had beperkte testen in menselijke weefsels7,8,11,13,14 .
Optische clearing methoden zijn ideaal voor tracering zenuwen over lange afstanden zoals in het centrale zenuwstelsel van intact muis. De alvleesklier is goed geïnnerveerd door zowel sensorische als autonome zenuwstelsel. De alvleesklier endocriene compartiment, eilandjes van Langerhans, bestaan uit een zeer klein gedeelte van het gehele orgaan (1-2%) en eilandjes hebben gekend heterogeniteit in de maten (50-250 µm), endocriene cell verhoudingen en dichtheid met name bij diabetes (herzien in 15 ,16). Bij de ontwikkeling van een protocol, verschillende optische clearing methoden werden getest op menselijke alvleesklier en een PACT-procedure bleek om de beste balans van tijd om duidelijk (~ 2 weken) met uitstekende morfologische behoud van zenuwen en eilandjes. De definitieve geoptimaliseerde procedure wordt hier beschreven in de afbakening van de neuro-insulaire netwerk voor grootschalige (millimeter afstanden) en hoge resolutie 3D beeldvorming van meerdere intact alvleesklier eilandjes. De techniek is geschikt voor menselijke alvleesklier onmiddellijk na de fixatie of na opslag, alsmede monsters in neutraal gebufferde formaline vast en ingebed in paraffine. De monsters zijn geschikt voor beeldvorming door confocal of lightsheet microscopie.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Florida institutionele Review Board en federale richtlijnen.
Let op: Paraformaldehyde en acrylamide zijn giftig irriterende stoffen. Omgaan met reagentia in een zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen, oogbescherming).
1. deparaffinization van Formaldehyde-vaste weefsels (als met verse weefsels werkt, gaat u verder met stap 2)
- Gebruik een nieuwe scheermesje of scalpel te snijden door de paraffine loodrecht op het oppervlak van het weefsel. Snijd de paraffine aan de rand van het weefsel tot finish het losraken. Gebruik pincet of een spatel voorzichtig los en verwijderen het weefsel optisch worden vrijgemaakt. Voorzichtig schrapen overtollige paraffine van het weefsel met behulp van een spatel (figuur 1A).
- Vul een glazen container met xyleen (ongeveer 30 mL voor een 3 x 3 x 3 mm sectie van weefsel) en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Vul een andere glazen container met verse xyleen met hetzelfde volume als 1.2.1. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT.
- 100% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT.
- 95% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT.
- 70% ethanol in een conische buis met hetzelfde volume als 1.2.1 plaatsen. Overdracht en Incubeer het weefsel in deze oplossing gedurende 24 uur op RT.
- Spoelen het weefsel in 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en plaats in 0,01 M PBS in een conische buis aan equilibreer gedurende 24u op RT. Zorg ervoor dat het weefsel vrij is van paraffine (figuur 1B, rechter paneel).
2. voorbereiding van de 4% Paraformaldehyde (PFA) fixatief
- Pipetteer 10 mL 16% PFA in een conische buis van 50 mL, Voeg 4 mL 0,1 M PBS en voeg 26 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O). Sluit het GLB en mix kort.
- Grotere volumes van 4% PFA vooruit en bevroren in aliquots gemaakt kan worden. Aliquots zijn goed voor 1 dag bij kamertemperatuur (RT), één week bij 4 ° C en 1 maand bij-20 ° C.
3. de alvleesklier fixatie
- Repareren van het monster van de alvleesklier (≤ 1 x 1 x 2 cm) in vers bereide 4% PFA bij 4 ° C gedurende 48 uur. Als het monster groter is dan 1 x 1 x 2 cm, een scalpel of scheermesje gebruiken om te ontleden in kleinere stukken niet meer dan 1 cm dik. Wassen weefsel monster in drie wijzigingen van 0,01 M PBS gedurende ten minste 15 minuten elk wassen en bewaren in de centrifugebuis 15 mL in 0.01% PFA/0,01 M PBS of 0,5% natrium azide/0,01 M PBS tot gebruik.
- Afdeling na fixatie, het weefsel in 1-2 mm dik secties voor verdere verwerking. Gebruik een vibratome om te helpen in zelfs segmenteren.
Opmerking: Het definitieve aantal secties zal afhangen van de grootte van het eerste monster.
4. het insluiten van weefsel in Hydrogel
- 200 mL van de 4% acrylamide/1% paraformaldehyde (A4P1) hydrogel monomeer oplossing als volgt voorbereiden:
- Plaats een kolf op het ijs in een emmer op de bovenkant van een magnetische roer plaat. Zorg ervoor dat de kolf is plat zit en voeg een magnetische roer bar.
- Voeg de volgende in volgorde: 147.8 mL koud (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M PBS, 20 mL koud (4-8 ° C) 40% acrylamide oplossing, 12.2 mL 16% PFA oplossing en 250 mg VA-044 initiatiefnemer. Meng de hele hydrogel-oplossing met een magnetische roer bar gedurende ten minste 10 minuten en laat de oplossing op het ijs voor de volgende stap.
- Plaats een conische buis 15 mL in het ijs naast de kolf met de hydrogel-oplossing. Pipetteer 14 mL monomeer-oplossing in de buis en een stuk van het 1-2 mm dikke vaste weefsel monster toe te voegen. Vervolgens de buis van het GLB.
- Incubeer het monster in oplossing van het monomeer gedurende 3 dagen bij 4 ° C en beschermen tegen licht. Aliquot eventuele resterende monomeer oplossing en opslag bij-20 ° C voor toekomstig gebruik.
5. ontgas de oplossing van het monomeer en polymeriseren de Hydrogel
- Verwijderen zuurstof uit de hydrogel monomeer oplossing met behulp van gasvormige N28.
- Een emmer ijs bereiden en leg het monster in de hydrogel monomeer oplossing op ijs.
- Verzamelen van 2-3, 18-gauge injectienaalden per monster, paraffine film en een timer. Sluit de slang aan de stikstof tank zodat de stikstof kan stromen. Terwijl het monster op ijs, zorgvuldig doorboren het GLB van een conische buis met het monster aan de ene kant en druk op een hypodermic naald door totdat het is onder het oppervlak van de vloeibare monomeer-oplossing.
- Een ander hypodermische naald gebruiken om het doorprikken van de overkant van het GLB, maar niet toestaan om te worden ondergedompeld.
Opmerking: De tweede naald zal de buis vent. - Sluit de slang van de stikstof tank aan de hypodermische naald ondergedompeld onder de hydrogel en langzaam draai op de stikstof totdat het kolkt gestaag door middel van de vloeistof.
- Toestaan dat de stikstof bubble via de vloeistof gedurende 10 minuten.
- Zodra de zuurstof is verwijderd, snel verwijderen van beide naalden en dekking van het GLB met een paraffine-film om te voorkomen dat elke verdere uitwisseling van gassen tussen buis en het milieu. Leg het ontgaste monster in een incubator bij 37 ° C gedurende 3 uur te polymeriseren de hydrogel.
6. de weefsels Clearing
- Het bereiden van 500 mL oplossing (4% SDS bij pH 8,5) wissen. Voeg 50 mL 0,1 M PBS en 20 g SDS poeder al roerend met een magnetische roer bar ~ 300 ml ddH2O. De oplossing met behulp van natriumhydroxide en zoutzuur aan pH 8,5 aanpassen. Voeg ddH2O totdat het eindvolume 500 mL is.
- Na polymerisatie, giet weg overtollige hydrogel en gooi het in een chemisch afval container. Gebruik een papieren handdoek om voorzichtig vegen weg hydrogel uit het monster en gooi deze weg in een chemisch afval container.
- Wassen van het monster in 3-5 uitwisseling van 0,01 M PBS (discard wassen vloeistof in de chemische afvalstoffen) gedurende 15 minuten elke stap wassen. Breng het monster in een conische buis van 50 mL met 40 mL buffer clearing.
- Incubeer het monster in de buffer clearing bij 37 ° C en omzetten in monster verse clearing buffer om de andere dag.
- Laat het monster in de buffer clearing voor 2-8 weken afhankelijk van de grootte van de steekproef (~ 8 weken voor een 3 x 3 mm x 3 mm monster) om ervoor te zorgen de juiste clearing.
- Controleert van weefsel clearing en stopt wanneer voltooid. Zorgen dat de steekproef voldoende transparant door het bedrijf tegen het licht om te controleren voor de juiste clearing (meestal enkele bruin kleuren blijft in de exocrine regio's).
Opmerking: Een overdreven gewiste monster zal verschijnen versleten op de randen en de textuur zullen zeer zacht toen pakte met een tang. Het is gebruikelijk dat het monster, tot duidelijk ongelijk. Ook zal het weefsel niet volledig transparant totdat geplaatst in montage media (invoegen, Figuur 1 c).
7. meerdere immunofluorescentie
- Wassen van de monsters op een shaker op 60 rpm op RT voor één dag met 40 mL 0,01 M PBS omzetten in verse buffer vaak (4-5 buffer veranderingen in totaal, 40 mL elke wassen, elke h veranderen tot het uiteindelijke wassen). Laat de laatste wasbeurt blijven 's nachts op RT.
- PACT kleuring buffer voor te bereiden. Toevoegen aan 500 mL 0,01 M PBS, natriumazide 50 mg en 0,5 mL TritonX-100. Meng goed.
- Incubeer het monster met primaire antilichamen.
- 2% normale serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam) toevoegen aan de basis PACT kleuring buffer in een 2-mL vlakke onderkant-buis (ten minste 1 mL totale volume wordt aanbevolen per monster/buis).
- Primair antilichaam aan de 2% serum/PACT kleuring buffer toevoegen. Gebruik ongeveer 5 x de hoeveelheid primair antilichaam voor het PACT kleuring zoals zou worden gebruikt voor standaard immunohistochemistry (dat wil zeggen als een antilichaam verdunde 1:500 voor standaard immunohistochemistry, gebruik 1:100 voor het PACT kleuring).
- Gebruik een spatel om het monster te verwijderen uit de buffer wassen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met een primair antilichaam-oplossing.
- 2-4 dagen bij RT op een shaker op 60 rpm uit te broeden. Monsters grondig wassen op RT op een shaker op 60 rpm in 0,01 M PBS omzetten in verse buffer 4 - 5 keer en het verlaten van de definitieve wassen op overnachten zoals in stap 7.1.
- Incubeer monsters met secundaire antilichamen.
- 2% normale serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam) toevoegen aan de basis PACT kleuring buffer in een 2-mL vlakke onderkant-buis (1 mL totale volume wordt aanbevolen per monster/buis).
- Voeg de secundaire antilichamen bij een concentratie van 1:200 (5 µl in 1 mL buffer).
Opmerking: Klein formaat antilichamen zijn voorkeur, evenals zeer cross-geadsorbeerde antilichamen als meer dan één primaire antilichaam gebruikt. - Gebruik een spatel om het monster uit was buffer verwijderen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met een secundair antilichaam-oplossing.
- Incubeer bij RT op een shaker op 60 rpm voor 2 dagen en het monster te beschermen tegen licht.
- De monsters grondig wassen, zoals in stap 7.1, op RT op een shaker op 60 rpm in 0,01 M PBS wijzigen aan de verse buffer 4 - 5 keer en het verlaten van de finale was 's nachts, beschermen tegen licht tijdens wasbeurten.
8. montage monsters voor Imaging
- Bereiden de brekingsindex gecompenseerde oplossing (velgen) buffer.
- Weeg 11 g niet-ionogene dichtheid kleurovergang medium (bijvoorbeeld Histodenz) en zorgvuldig overbrengen in een conische buis van 50 mL.
- Voeg ~ 5 mL 0,02 M fosfaat buffer (PB)8 met behulp van een spatel om lucht uit het poeder niet-ionogene dichtheid kleurovergang medium vrij te geven.
Opmerking: De oplossing zal zeer viskeuze, meng goed. - Breng het volume tot 10 mL met behulp van meer PB, meng met een spatel en schrapen de overschrijding van de spatel in de buis.
- VELGEN Incubeer bij 37 ° C tot het is opgelost, omkeren en meng voorzichtig zo nodig.
- Pipetteer monsters in velgen. Pipetteer 1 mL velgen in een 2-mL flat-onderkant-buis om dit te doen. Gebruik een spatel om het monster uit was buffer verwijderen en schar de overtollige buffer af naar een papieren handdoek, dan plaatst u in de buis met velgen oplossing.
- Tik zachtjes op de buis om te dompelen van het monster in de velgen. Leg monsters in velgen op de bank beschermd tegen licht op RT voor 2-4 dagen vóór de beeldvorming.
- Plaats een kleine hoeveelheid van de velgen in een 8-well dekglaasje aan onderste kamer dia naar image. Alleen het toevoegen van net genoeg om jas van de bodem, meer zal leiden tot het monster te zweven, waardoor het moeilijker om het imago op een omgekeerde scope. Voeg het monster naar de waterput en de dia voor beeldvorming van het GLB.
9. imaging
- Confocal Microscopie en beeldbewerkingssoftware
- Selecteer de passende lasers voor de excitatie en emissie spectra van de fluorophores gebruikt om het PACT monsters vlek. Pas de instellingen van de acquisitie software zodat overlappingen tussen kanalen wordt geëlimineerd. Gebruik afzonderlijke tracks indien nodig (wanneer twee fluorophores soortgelijke excitatie spectra hebben).
- Instellen van de Beeldacquisitie
- Kiezen van de verwerving van de maximale snelheid, 16-bits, 4 of meer gemiddelden en resolutie 1024 x 1024 of beter.
- Inzoomen op het object dat moet worden beeld.
Opmerking: Dit zal dalen Acquisitietijd te verminderen foto-bleken en ook verkleinen van bestandsgrootte en downstream bewerken.
- Instellen van de z-stack.
- Selecteer de optimale segmenteren voor het doel wordt gebruikt. Als deconvolutie later gewenst is, gebruikt u een z-stap kleiner dan optimale zoals 1 µm.
- Gebruik de z-stack-correctie.
- Dichtst bij het oppervlak van het weefsel begint en verhoging van de winst als de doelstelling richt zich door middel van het z-vlak en correcties toevoegen. Wijzig niet de instellingen van de laser voor de correctie!
- Verwerven van een stapel van de test met een gemiddelde resolutie van 512 x 512 en verwerving van de maximale snelheid. Controleer het beeld in 3D om ervoor te zorgen dat er gelijke helderheid in de stack voor elke kleur is alvorens de definitieve hoge resolutie z-stack te verkrijgen.
- Lightsheet Imaging
- Ervoor zorgen dat de monsters hebben zijn geëquilibreerd in velgen voor imaging voor ten minste 24 h. ideaal, overbrengen van de monsters naar verse velgen in de beeldvorming zaal en laat in de zaal equilibreer gedurende ten minste een dag.
- Monteren van het monster voor imaging
- Selecteer de kleinste (zwart) capillair te monteren van het monster
- Gebruik putty of een schotel te houden van het monster tijdens het toepassen van superlijm aan het einde van het capillair. Lijm het weefsel naar het capillair aan een oppervlak van het weefsel mogelijk zo weinig te raken.
- Voeg het monster voor imaging.
- Beeld met behulp van 5 X of 25 X doelstellingen geschikt voor optisch gewiste monsters met behulp van het scharnierpunt scan optie. Als schaduwen of vervagen optreedt, roteren van het monster en probeer het opnieuw of laat het monster blijven equilibreer in velgen.
Opmerking: Een stapel 1 mm kan over het algemeen worden verworven in minder dan vijf minuten, afhankelijk van de instellingen. - Bekijken en bewerken van de afbeeldingsstapels met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.
Representative Results
Deze kleuring procedures werden ontwikkeld om een grootschalig onderzoek van de menselijke alvleesklier eilandjes en bijbehorende autonome en zintuiglijke netwerken te onderzoeken. Verscheidene procedures werden getest met inbegrip van duidelijkheid7, iDISCO17, en PACT8 met de PACT-methode gevonden beste geschikt voor menselijke alvleesklier en confocal beeldvorming.
Primaire antilichamen werden in eerste instantie getest op vaste menselijke alvleesklier monsters met passende positieve en negatieve controlemonsters (muis hersenen, andere). De primaire antilichamen en de aanbevolen verdunningen staan in Tabel van materialen, hoewel elk laboratorium voor het optimaliseren van antilichaam verdunningen afhankelijk van veel nummer en weefsel bron kunt verwachten. Primair antilichaam veel-op-veel variatie kan gevolgen voor de kleuring van de intensiteit en de specificiteit, en vereist validatie te bereiken van dezelfde mate van intensiteit van de vlek als met voormalige reagentia.
In de menselijke alvleesklier, werden eilandjes afgebakend door insuline, glucagon en secretogranin 3 (Figuur 2). Cellen van Schwann werden afgebakend met behulp van gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP, Figuur 2 en figuur 3A). Zenuwen gekleurd met antilichamen tegen het parasympathische marker vasoactieve intestinale peptide (VIP) zijn beeld op de Lightsheet (figuur 3B). Sympathische zenuwen kunnen worden gezien met de kleuring voor tyrosine hydroxylase (niet afgebeeld).
Figuur 1. Menselijke alvleesklier optische clearing. (A) een scheermesje wordt gebruikt om te knippen en Los een deel van paraffine-ingebedde weefsel (bovenste panelen) voordat het verwijderen van de weefselsectie en schrapen weg overtollige paraffine van het weefsel (onderste panelen). Representatieve weefselmonsters worden weergegeven vóór (B links, C boven) en na (juiste B, C-midden) optische clearing van paraffine-ingebedde weefsel, zoals beschreven in de sectie protocol. Het gewiste, vaste weefsel is niet volledig transparant na verrekening van B gelijk, C boven en vaak weefsel zwelling kan worden gewaardeerd (C, middelste deelvenster). Het gewiste weefsel wordt volledig transparant na evenwichtsinstelling in velgen (C, lagere paneel). Schaal bars: 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Menselijke neuro-insulaire netwerk. Menselijke alvleesklier monsters zijn gewist, zoals beschreven vanuit nPOD orgaandonoren of archiveringsdoeleinden paraffine-ingebedde weefsels. (A-D) De cellen van Schwann (GFAP +, wit) en endocriene cellen door insuline (rood) en glucagon (groen) gekleurd worden weergegeven. (A) Confocal Microscopie en maximale intensiteit projectie (MIP) toont tracering van cellen van Schwann (GFAP +) op de zenuwen dwars naast de bloedvaten aan de rand van de eilandje en uit te breiden in de eilandjes. De inzet toont hoge resolutie verkregen en contact tussen de cellen van Schwann GFAP + en endocriene cellen bevat. (B) een 3D-beeld van paneel (schaal: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. Een paraffine-PACT monster blijkt verbeelde via confocale microscopie en gepresenteerd als een projectie van maximale intensiteit (C) en in 3D (D), schalen: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Schaal bars A, C: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. 3D-visualisatie en binddraad. Drie gestikte afbeeldingsstapels overgenomen van cellen van Schwann gekleurd met behulp van GFAP en confocale microscopie en opgespoord met behulp van een neurite tracer plugin in de software van de analyse van de afbeelding. (A) de 3D opvulling van het spoor wordt weergegeven (schaal bars: x = 150 µm, y = 200 µm (0.2 mm), z = 120 µm) (B) A PACT monster was gekleurd met VIP antilichaam en beeld met behulp van een microscoop met lightsheet. De stack is > 1 mm in diepte en zenuwvezels zijn duidelijk te zien in hoge resolutie. Vezels verpakking een buis (D, voorgrond) en een ganglion (G, achtergrond) kunnen worden gezien (groot raster: x, y, z = 200 µm; maatstreepjes: x, y, z = 40 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Beschikbaarheid van nieuwe optische clearing methoden heeft ongekende grootschalige onderzoeken van de centrale en perifere zenuwstelsel toegestaan in diermodellen. De algehele innervatie arm patronen van de menselijke alvleesklier zijn grotendeels onontgonnen als gevolg van de dichtheid van het weefsel en moeilijkheden bij het verwerven van hoogwaardige biospecimens. Dit protocol biedt een geoptimaliseerde weefsel clearing protocol voor menselijke alvleesklier weefsel van vaste of paraffine-ingebedde archivering monsters.
Clearing tijd hangt af van de grootte van steekproef, kleefpoeders type, duur, duur van de opslag en wellicht 1-8 weken, dus de volgende overwegingen zijn van cruciaal belang. Het is het beste om te ontruimen weefsels kort na de vastlegging van de PFA 4% indien mogelijk omdat langdurige opslag clearing tijd verhoogt. U wilt minimaliseren clearing tijd, was het bedrag van de PFA in het monomeer hydrogel daalde van 4% zoals gebruikt in de fixatie stap tot 1% voor de menselijke alvleesklier. Voor andere weefsels, met name muis weefsels, moet het bedrag van de PFA nodig om voldoende hydrogel stijfheid te behouden antigenen empirisch worden bepaald. Voldoende clearing is eveneens essentieel, aangezien antilichaam penetratie wordt verminderd in slecht gewiste weefsels en oppervlak vlekken door secundaire antilichamen is verhoogd. Wijzigen van de clearing-oplossing is elke andere dag (of zelfs dagelijks) het beste de pH constant en afwasmiddel om vers te houden. Daarentegen overdreven clearing negatief gevolgen van cellulaire morfologie en weefsel brosheid verhoogt. Aangezien sommige monsters van de alvleesklier duidelijk ongelijk als gevolg van de inherente ziektebeelden zoals regio's van fibrose van chronische pancreatitis of andere pathologieën, is het belangrijk om regelmatig toezicht op dit proces. Gebruik van vibratome dikke secties kan ook worden gebruikt voor het maken van uniforme diktes maar niet vereist. Toezicht op het clearing-proces, dus monsters uit wasmiddel worden verwijderd zodra gaat gemakkelijk door middel van het monster, het licht zorgt ervoor dat de steekproef voldoende is uitgeschakeld.
Antilichaam penetratie en oppervlak vlekken zijn belangrijke kwesties om te overwegen met PACT monsters. Om te zorgen voor een goede antilichaam penetratie, is het cruciaal voor de monsters met de primaire antilichamen Incubeer gedurende ten minste 2 dagen. Verschillende antilichamen hebben verschillende diffusie tarieven en individueel moeten worden geoptimaliseerd, maar voor de meeste antilichamen, 4 dagen was voldoende duur voor volledige penetratie in eenmonstervan3 1 mm. Als oppervlakte kleuring een probleem is, vooral voor Lightsheet imaging, het monster kan worden gesneden in de helft, of het oppervlak ontleed weg na kleuring. Kleinformaat antilichamen indien beschikbaar zou worden verwacht om te helpen met weefsel penetratie8. Preconjugated antilichamen lijken niet te werken evenals de dezelfde unconjugated kloon en hogere achtergrond van niet-specifieke binding en armere weefsel penetratie kan worden waargenomen als ze helemaal niet werken. Verhogen voor betere succes met preconjugated antilichamen, serum en TritonX-100 concentraties in de kleuring buffer en langere incubations gebruiken (> 4 dagen). Na kleuring, is incubatie van het monster in velgen voor meerdere dagen van cruciaal belang. Gewiste weefsels zwellen in PBS en velgen incubatie oorzaken daarvan te krimpen terug naar de oorspronkelijke grootte. Vooral met lightsheet imaging, moet het monster volledig worden geëquilibreerd voor imaging.
Wanneer imaging monsters op de confocal microscoop, moet de correctie worden ingesteld telkens wanneer die een nieuwe positie wordt gekozen. Verschillende diepten van de verwerving en variatie in de kleuring van de intensiteit in het weefsel vergt aanpassingen voor elk gebied van het weefsel te worden optimaal beeld. De secundaire antilichamen gebruikt moeten ook zorgvuldig worden overwogen. Spectrale randverwijdering is een uitdaging in monsters van het PACT, zodat fluorophores op passende wijze moet worden gekozen voor een lage excitatie of emissie overlapping om een helder signaal bij het filteren van emissies op de confocal microscoop. Voor elke toepassing, moet een evenwicht worden gevonden tussen resolutie, imaging snelheid en ruisonderdrukking zodat de beste kwaliteit beeld kan worden verkregen zonder foto-bleken. Resolutie groter dan 1024 x 1024 is niet aantoonbaar met het menselijk oog maar nodig kan zijn voor bepaalde toepassingen als kwantificering van een vlek nodig is.
Er zijn veel dingen te overwegen bij het kiezen van een optische clearing-techniek en bij het kiezen van optische clearing boven andere meer traditionele methoden. Lage overvloed antigenen mogelijk niet aantoonbaar met behulp van de methode van de PACT dus er gelden beperkingen voor de opsporing van antigeen. Bepaalde antigenen zoals immunologische antigenen (CD3 CD4, CD8, etc.) worden vernietigd door de methode van het PACT en zijn niet detecteerbaar ondanks hoge kwaliteit antilichamen beschikbaar om hen te ontdekken. Een andere beperking van deze methode is de inherente variabiliteit tussen de donor pancreases die moeilijk te onderscheiden tot na het wissen van de vlekken. Elke donorweefsel neigt om te wissen en de vlek ook tussen procedures, maar verschillende donor weefsels hebben uiteenlopende clearing times en weefsel morfologie kwaliteit na verrekening. De mogelijkheid om gebruik van archivering weefsel kan deze beperking verminderen als een adequate toegang tot een groot aantal patiënten alvleesklier monsters hebben kan, hoewel dit niet is grondig onderzocht. Het PACT protocol gemeld hierin bleek te zijn goedkoop en gemakkelijk uitgevoerd met gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden. Gewiste monsters waren geschikt voor imaging via traditionele confocale microscopie, evenals 2-foton en Lightsheet technologieën en beschikbaar in hoge resolutie 3D-beelden van de zenuwen en eilandjes in grote delen van de menselijke alvleesklier. Toekomstige toepassingen van deze procedure omvatten studies betreffende de ontwikkeling van de foetus alvleesklier voor zowel exocrine en endocriene compartimenten en islet studies in type 1 en type 2 diabetes.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Ann Fu en Joseph Canzano voor technische bijstand, Dr. Jennifer Treweek voor waardevol advies en Dr. Kristin Overton en Dr. Karl Deisseroth MCT opleiding door middel van de Stanford University duidelijkheid workshop. JDRF nPOD en het orgel aanbestedingen organisaties geboden weefselmonsters. Dit werk werd gefinancierd door JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) en NIDDK 1OT2 TR001773 aan MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
