Summary
כאן, אנו מציגים פסיבים פרוטוקול לסעיפים לבלב אנושי התמונה בתלת מימד (3D) באמצעות אופטימיזציה ניקוי שיטות. כתב יד זה מדגים אלו נהלי סליקה אופטי פסיבי ואחריו מספר immunofluorescence מכתים לזהות את המרכיבים העיקריים של אוטונומי, חושי רשתות עצביות innervating אנושי איונים.
Abstract
החוקרים בשיטות מסורתיות היסטולוגית, מונעים ביכולתם תמונה כל הרקמות או האיברים ב- 3D בקנה מידה גדול. סעיפים היסטולוגית מוגבלות בדרך כלל ל- < 20 מיקרומטר כמו פורמלין קבוע בסעיף פרפין בשקופיות זכוכית או < מיקרומטר 500 עבור מקטעים קבועים לתרשים. לכן, המאמצים הנדרשים עבור חלוקתה טורי ושיטות תמונה רחבת היקף שחזור כדי לשחזר 3D עבור דגימות > 500 מיקרומטר בשיטות מסורתיות. בנוסף, אור בסורקים של מקרומולקולות בתוך רקמות, במיוחד שומנים, מונע הדמיה לעומק > 150 מיקרומטר עם מיקרוסקופ קונפוקלי ביותר. כדי להפחית את פיזור האור וכדי לאפשר לדימות רקמות עמוק באמצעות קונפוקלית פשוטה, שיטות ניקוי אופטי שונות פותחו כי רלוונטי עבור דגימות רקמה מכרסמים ואנושי נפתרות על-ידי טבילה. מספר שיטות הקשורות ולהשתמש crosslinking חלבון עם אקרילאמיד ורקמות ניקוי עם נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות). טכניקות ניקוי אופטי אחרות להשתמש בממיסים שונים למרות כל שינוי היו יתרונות וחסרונות שונים. כאן, שיטת אופטימיזציה סליקה אופטי פסיבי מתואר ללימודים של העצבוב לבלב אנושי, במיוחד עבור חקירת העצבוב של האדם איונים.
Introduction
עד לאחרונה, תלת-ממדי (3D) שחזור של גדול לרקמות או לאיברים כל בוצעה באמצעות חלוקתה טורי מפרך, מכתים, תמונת שחזור של מקטעים מרובים. שיטות אלה היו מספר חסרונות כולל הסתמכות על מספר גדול של קטעים טורי, רקמות המסכן חדירה עם נוגדנים, פלקטואציות ופיזור אור מניעת הדמיה עמוק בתוך רקמות. כדי לאפשר חדירה נוגדן ואור גדול יותר, חוקרים פיתחו שיטות כימיות לשמר חלבונים אנטיגניים בעת הסרת הרוב המכריע של אור-פיזור שומנים. במספר קשורות. השיטות hybridized Clear Lipid-Exchanged אקרילאמיד רקמות הדמיה נוקשה הידרוג (בהירות), טכניקה בהירות פסיבי (ברית) ו זלוף בסיוע סוכן שחרור באתרו ב (PARS) (נבדקה 1,2 ,3,4,5,6). שיטת בהירות מבוסס על ייצוב חלבונים באמצעות של פורמלדהיד, אקרילאמיד הידרוג bis ואחריו הסרת השומנים באמצעות אלקטרופורזה מרחביות פתרון2. גישה זו היה מאוחר יותר שונה פסיבים ניקוי ומתקדם הדמיה7. נוספים מיטוב הוביל חיסול של bis אחוזים שונים של paraformaldehyde בפתרון הידרוג (1-4%) כדי לקבל ייצוב אנטיגן אופטימלית עם קרחת להשיק את טכניקה הנקראת ברית 8. נסיונות מוקדם כדי לפתח טכניקות ניקוי אופטי אלה מעורבים תרכובות אורגניות או אחרים הקשים בעבודה, מתרצה אנדוגני פלורסנט חלבונים במודלים של העכבר מהונדס. שיטות נוספות אלה כללו סולמות, קוקטיילים המוח/גוף בלא הפרעה וניתוח Computational (מעוקב), מתג ושיטות Dimensional Imaging of Solvent-Cleared האיברים (דיסקו), כולם עם מגוון יתרונות וחסרונות9, 10,11,12. השיטה בהירות המקורית פותחה ברקמת המוח עתירי שומנים בדם העכבר, שיטות ניקוי אופטי היה מוגבל בדיקות ברקמות אנושיות7,8,11,13,14 .
שיטות ניקוי אופטי הינם אידיאליים עבור מעקב העצבים על פני מרחקים ארוכים כמו מערכת העצבים המרכזית העכבר ללא פגע. הלבלב הוא טוב innervated על ידי מערכת העצבים האוטונומית והן חושית. תא האנדוקרינית הלבלב, איי לנגרהנס, מהווים חלק קטן מאוד של האיבר כולו (1-2%) ואת איונים לדעת הטרוגניות (50-250 מיקרומטר), הפרופורציות תא האנדוקרינית, והגדלים צפיפות במיוחד בחולי סוכרת (שבתוך 15 ,16). פיתוח פרוטוקול, מספר שיטות ניקוי אופטי נבדקו עבור לבלב אנושי, הליך ברית נמצאה כדי לספק את האיזון הטוב ביותר של הזמן לנקות (~ 2 שבועות) מעולה לשימור מורפולוגי של העצבים ושל איונים. בהליך אופטימיזציה הסופי המתואר כאן התיחום של הרשת נוירו-סקסיסטית בקנה מידה גדול (מרחקים מילימטר), הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של לנגרהנס מרובים ללא פגע. הטכניקה היא מתאימה לבלב אנושי מיד לאחר את הקיבעון או לאחר אחסון, כמו גם דגימות קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, נעוץ פרפין. הדגימות מתאימים עבור הדמיה על ידי קונאפוקלית או מיקרוסקופ lightsheet.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם הועד המוסדי אוניברסיטת פלורידה והנחיות הפדרלי.
התראה: Paraformaldehyde אקרילאמיד הינם רעילים המגרים. להתמודד עם ריאגנטים בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (חלוק, כפפות, הגנה העין).
1. deparaffinization של רקמות פורמלדהיד-קבוע (אם עובדים עם רקמות טריים, דלג לשלב 2)
- השתמש גילוח חדש או אזמל שנחתוך את הפרפין בניצב למשטח של הרקמה. חותכים הפרפין בקצה של הרקמה לסיים ויסירו את זה. להשתמש מלקחיים או מרית לשחרר בעדינות ולהסיר את הרקמה שינוקו שטיחות. לגרד בעדינות פרפין עודף מרקמות בעזרת מרית (איור 1 א').
- למלא את מיכל הזכוכית עם קסילן (בערך 30 מ"ל עבור 3 x 3 x 3 מ מ סעיף של רקמות), דגירה הרקמה בפתרון זה עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
- למלא אחר מיכל הזכוכית עם קסילן טריים באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT.
- במקום 100% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT.
- מקום 95% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT.
- במקום 70% אתנול לתוך צינור חרוטי באותו אמצעי אחסון כמו 1.2.1. העברה, דגירה הרקמה בפתרון זה במשך 24 שעות ביממה ב- RT.
- יש לשטוף הרקמה ב 0.01 M פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ומקום ב- PBS 0.01 M צינור חרוטי כדי equilibrate במשך 24 שעות ביממה במלון RT. ודא כי הרקמה הינה ללא פרפין (איור 1B, לוח נכון).
2. מכינים 4% Paraformaldehyde (PFA) מקבע
- פיפטה 10 מ ל-16% PFA לתוך צינור חרוטי 50-mL, להוסיף 4 מ ל 0.1 M PBS, ולהוסיף 26 mL לגלידה יונים (ddH2O). סוגרים את הפקק ומערבבים בקצרה.
- אחסון גדולים יותר של 4% PFA יכול להתבצע, אבל קפוא ב- aliquots. Aliquots הינם טובים ליום 1 בטמפרטורת החדר (RT), שבוע אחד ב 4 ° C, 1 חודש ב-20 ° C.
3. לבלב קיבוע
- לתקן את המדגם הלבלב (≤ 1 x 1 x 2 ס"מ) המוכנים באופן טרי 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. אם המדגם הוא גדול יותר מאשר 1 x 1 x 2 ס"מ, להשתמש באזמל או גילוח כדי מחלקים קטנים יותר חתיכות לא יותר מ 1 ס מ עבה. לשטוף לדגימות שלושה שינויים ל- PBS 0.01 M למשך לפחות 15 דקות כל כביסה ולאחסן בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ב- 0.01% מחברים/0.01 M PBS או 0.5% נתרן אזיד/0.01 M PBS עד השימוש.
- לאחר קיבוע, סעיף הרקמה למקטעים בעובי 1-2 מ מ, לצורך המשך עיבוד. השתמש vibratome כדי לסייע אפילו חלוקתה.
הערה: המספר הסופי של מקטעים תיקבע בהתאם לגודל המדגם ההתחלתי.
4. להטביע את רקמת ב הידרוג
- להכין 200 מ של הפתרון מונומר 4% הידרוג paraformaldehyde (A4P1) אקרילאמיד/1% כדלקמן:
- במקום בקבוקון על הקרח בדלי על צלחת מערבבים מגנטי. ודא שהבקבוקון יושב במול ולאחר להוסיף פס מגנטי מערבבים.
- להוסיף את הפעולות הבאות לפי סדר: 147.8 mL ddH2O (4-8 ° C) קר, 20 מ ל 0.1 M PBS, פתרון אקרילאמיד של 40% (4-8 ° C) של 20 מ"ל קר, 12.2 mL 16% מחברים פתרון ו- 250 מ"ג VA-044 יוזם. לערבב את הפתרון הידרוג כולו עם פס מגנטי מערבבים לפחות 10 דקות ולהשאיר את הפתרון קרח לשלב הבא.
- הצב צינור חרוטי 15-mL בקרח ליד הבקבוק המכיל את הפתרון הידרוג. פיפטה 14 מ של מונומר פתרון לתוך הצינור, והוסף חתיכה אחת של דגימת הרקמות קבוע בעובי 1-2 מ מ. ואז קאפ ברכבת התחתית.
- תקופת דגירה המדגם בפתרון מונומר של 3 ימים 4 ° C, להגן מפני אור. Aliquot כל מונומר הפתרון הנותרים, חנות ב-20 ° C לשימוש עתידי.
5. דגה הפתרון מונומר, פולימריזציה של הידרוג
- הסר את החמצן של הפתרון מונומר הידרוג באמצעות גז N28.
- להכין דלי קרח ומניחים את הדגימה בפתרון מונומר הידרוג על קרח.
- לאסוף 2-3, אל תדאגי hypodermic מחטים לכל דגימה פרפין ו טיימר. להתחבר לאורך צינור למיכל חנקן כך החנקן יכולה לזרום. תוך שמירה על המדגם על קרח, בזהירות לנקב את הכובע של צינור חרוטי המכיל את הדגימה בצד אחד ולחץ על אחד מחט hypodermic דרך עד שהוא נמצא מתחת לפני השטח של הפתרון מונומר נוזלי.
- להשתמש במזרק נוסף ניקוב הנגדי של הכיפה, אך לא לאפשר לו להיות מתחת למים.
הערה: המחט השני לפרוק את הצינור. - לחבר את הצנרור ממיכל חנקן במזרק שקוע מתחת הידרוג והפעל לאט את החנקן עד זה מבעבע בהתמדה העובר בנוזל.
- לאפשר את החנקן בועה דרך הנוזל למשך 10 דקות.
- ברגע החמצן מוסר, במהירות להסיר שתי מחטים ולכסות את הכובע עם סרט פרפין כדי למנוע כל עוד חילופי גזים בין הצינור לסביבה. מקם את הדגימה degassed בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 h כדי פולימריזציה של הידרוג.
6. רקמות סליקה
- הכנת 500 מ"ל ניקוי פתרון (4% מרחביות ב- pH 8.5). ~ 300 מ של ddH2O, להוסיף 50 מ ל 0.1 M PBS ו- 20 גרם מרחביות אבקת תוך כדי ערבוב עם פס מגנטי מערבבים. להתאים את הפתרון באמצעות סודיום הידרוקסיד. וחומצת ל pH 8.5. הוסף ddH2O עד שאמצעי האחסון הסופי 500 מ"ל.
- לאחר הפילמור, תשפכו הידרוג עודף וזורקים אותו לתוך מיכל פסולת כימית. השתמש מגבת נייר כדי למחוק משם הידרוג מדגם ולמחוק בעדינות לתוך מיכל פסולת כימית.
- רחץ לדוגמה בחילופי 3-5 מ' 0.01 PBS (נוזל שטיפת להשליך לתוך. פסולת כימית) למשך 15 דקות כל שלב שטיפה. להעביר את הדגימה לתוך צינור חרוטי 50-mL עם 40 מ של ניקוי מאגר.
- דגירה המדגם במאגר סליקה ב 37 מעלות צלזיוס ושנה מדגם למאגר סליקה טריים בכל יום אחר.
- יוצאים המדגם במאגר סליקה של 2-8 שבועות, בהתאם לגודל המדגם (~ 8 שבועות 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ מ לדוגמה) להבטחת פינוי תקין.
- לפקח על ניקוי רקמות, לעצור בסיום. ודא כי המדגם שלמאחה שקוף על-ידי החזקת אותו מול האור כדי לבדוק אם ניקוי נאות (בדרך כלל יישאר קצת שיזוף צביעה באזורים אקסוקרינית).
הערה: דוגמה יתר שנוקה יופיע בלויים בקצוות, המרקם יהיה רך מאוד כאשר הרים עם מלקחיים. זה נפוץ עבור הדגימה לנקות לצר. כמו כן, הרקמה לא יהיה שקוף לחלוטין עד להציב הרכבה מדיה (להוסיף, איור 1C).
7. מספר Immunofluorescence
- לשטוף את הדוגמאות על מטרף-סל ד 60 ב RT ליום אחד עם 40 מ ל 0.01 M PBS שינוי למאגר טריים לעיתים קרובות (4-5 מאגר לשינויים, סה כ 40 מ"ל כל כביסה, שינוי כל h עד למכונה הסופי). תני לשטוף סופית את המשך בן לילה RT.
- להכין הסכם מכתים מאגר. כדי 500 מ"ל 0.01 M PBS, להוסיף אזיד הנתרן 50 מ"ג ו- 0.5 מ ל TritonX-100. מערבבים היטב.
- דגירה הדגימה עם נוגדנים העיקרי.
- להוסיף 2% נורמלי סרום (מאותו המין כמו הנוגדן המשני) להסכם הבסיסי מכתים המאגר בצינור בתחתית שטוח 2-mL (הנפח הכולל לפחות 1 mL מומלץ למחזור/המדגם).
- מוסיפים נוגדן ראשוני 2% הסרום/ההסכם מכתים מאגר. השתמש כ 5 x כמות נוגדנים העיקרי עבור ברית מכתים ישמש עבור תקן אימונוהיסטוכימיה (כלומר אם נוגדן היא שבערך מדולל עבור אימונוהיסטוכימיה רגיל, שימוש בטחונות עבור ברית מכתים).
- השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מתוך המאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם פתרון נוגדן ראשוני.
- דגירה 2-4 ימים במלון RT-מטרף-60 סל ד. לשטוף ביסודיות דגימות ב RT-מטרף-60 סל ד ב- PBS 0.01 M שינוי למאגר טרי 4 - 5 פעמים, עוזב את השטיפה הסופית על לילה כמו שלב 7.1.
- דגירה בדגימות עם נוגדנים משניים.
- להוסיף 2% נורמלי סרום (מאותו המין כמו הנוגדן המשני) להסכם הבסיסי מכתים המאגר בצינור בתחתית שטוח 2-mL (הנפח הכולל של 1 מ"ל מומלץ למחזור/המדגם).
- להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1:200 (5 µl במאגר 1 מ"ל).
הערה: תבנית קטנה הם מועדף, כמו גם מאוד קרוס-הספוחה נוגדנים אם משתמש אחד או יותר נוגדן ראשוני. - השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מהמאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם פתרון נוגדנים משניים.
- דגירה ב RT-מטרף-סל ד 60 2 ימים ולהגן המדגם מהאור.
- רחץ את הדגימות בשלמות, כמו צעד RT-מטרף-60 סל ד ב- PBS 0.01 M שינוי למאגר טרי 4 - 5 פעמים ולהשאיר את הגמר 7.1, לרחוץ ב לילה, להגן מפני אור במהלך שוטף.
8. הרכבה את דגימות עבור הדמיה
- הכנת המאגר מתאימים פתרון (חישוקים) מקדם שבירה.
- שוקלים לצאת 11 גרם של צפיפות ללא יונית הדרגתיות בינונית (למשל, Histodenz) ולהעביר בזהירות ל צינור חרוטי 50-mL.
- הוסף ~ 5 מ ל ז 0.02 נקודות פוספט מאגר (PB)8 באמצעות מרית לשחרור אוויר מן המדיום הדרגתי של צפיפות ללא יונית אבקה.
הערה: הפתרון יהיו מאוד צמיגה, מערבבים היטב. - להביא את אמצעי האחסון 10 מ"ל באמצעות PB יותר, לערבב עם מרית, לגרד את עודף את המרית לתוך הצינור.
- דגירה טסות ב 37 ° C עד התפרקה, היפוך ולערבב בעדינות לפי הצורך.
- העברת דגימות לתוך חישוקים. כדי לעשות זאת, פיפטה 1 מ"ל חישוקים לתוך צינור שטוח התחתונה 2-mL. השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה מהמאגר לשטוף, כי אמחה קלות את מאגר עודף חופש על גבי מגבת נייר ולאחר מכן למקם את הצינור עם חישוקים פתרון.
- טפח בעדינות את הצינור כדי להטביע את הדגימה ב חישוקים. מקום דגימות חישוקים על הספסל מוגן מפני אור ב RT עבור 2-4 ימים לפני הדמיה.
- תמונה, מקם כמות קטנה של המכון לתוך שקופיות הקאמרית 8-ובכן coverslip התחתון. רק להוסיף רק מספיק בשביל המעיל התחתון, יגרום יותר לדוגמה כדי לצוף מקשה על תמונה על טווח הפוכה. הוסף את הדגימה אל הבאר ' קאפ השקופית עבור הדמיה.
9. הדמיה
- מיקרוסקופיה קונפוקלית והדמיה תוכנה
- בחר לייזרים המתאימים עירור, ספקטרום הפליטה של fluorophores להשתמש כדי להכתים את הדגימות ברית. להתאים את ההגדרות של התוכנה רכישת כך כל חפיפה בין ערוצי חוסלה. השתמש מסלולים נפרדים במידת הצורך (כשיש fluorophores שני ספקטרה עירור דומה).
- להגדיר את רכישת התמונה
- בחר מהירות הרכישה המרבי, 16 סיביות, ממוצעים 4 או יותר, 1024 x 1024 החלטה ואף טוב יותר.
- זום לתוך העצם ליצירת תמונה.
הערה: יפחת רכישת זמן כדי להפחית את הלבנת-צילום, גם להקטין את גודל הקובץ ועריכה במורד הזרם.
- הגדרת הערימה-z.
- בחר את חלוקתה אופטימלית עבור המטרה בשימוש. אם deconvolution רצוי מאוחר יותר, השתמש z-שלב קטן יותר אופטימלית כגון 1 מיקרומטר.
- השתמש את התיקון z-מחסנית.
- להתחיל הקרוב פני השטח של הרקמה, להגדיל את הרווח כמו המטרה מתמקדת דרך המישור z ולהוסיף תיקונים. אל תשנה את הגדרות לייזר על התיקון!
- רוכשים ערימה מבחן עם ממוצע אחד, 512 x 512 ברזולוציה של מהירות הרכישה המרבי. בדוק את התמונה ב- 3D כדי לוודא כי יש בהירות שווה לאורך כל הערימה לכל צבע לפני רכישת הסופי ברזולוציה גבוהה z-הערימה.
- הדמיה Lightsheet
- ודא כי הדגימות equilibrated ב חישוקים הדמיה לפחות 24 ח' אידיאלי, להעביר את הדגימות חישוקים טריים בבית הבליעה הדמיה, מאפשרים equilibrate בבית הבליעה לפחות ליום.
- הר המדגם עבור הדמיה
- בחר את נימי (שחור) הקטן ביותר כדי לטעון את הדגימה
- השתמש מרק או תבשיל להחזיק את הדגימה תוך יישום דבק סופר לסוף נימי. הדבק את הרקמה נימי לגעת מעט משטח של הרקמה ככל האפשר.
- הכנס את הדגימה עבור הדמיה.
- התמונה באמצעות 5 X או מטרות X 25 מתאימים עבור דגימות שטיחות שנוקה באמצעות הציר סריקה אפשרות. אם הוספת צל או טשטוש מתרחשת, לסובב את הדגימה, לנסות שוב, או לתת את הדגימה להמשיך equilibrate ב חישוקים.
הערה: ערימה 1 מ מ ניתן בדרך כלל לרכוש תוך פחות מחמש דקות, בהתאם להגדרות. - הצגה ועריכה של אוספי תמונות באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה.
Representative Results
הליכים אלה מכתימים פותחו כדי לספק בדיקה בקנה מידה גדול של הלבלב האדם לבחון איונים ורשתות אוטונומי, חושי המשויך. מספר הליכים נבדקו כולל בהירות7, iDISCO17, ברית8 עם השיטה ברית נמצאו הכי מתאים לבלב אנושי והדמיה קונפוקלי.
נוגדנים ראשי בתחילה נבדקו קבוע לבלב אנושי דגימות עם מתאימים בקרה חיובית ושלילית דוגמאות (עכבר המוח, אחרים). נוגדנים העיקרי של דילולים המוצע מפורטים בטבלה של חומרים, למרות כל מעבדה ניתן לצפות למטב נוגדן דילולים בהתאם רבים ומספר רקמת המקור. נוגדן ראשוני מאוד-אל-הרבה וריאציה יכול להשפיע על עוצמת מכתימים וספציפיות, דורשים אימות כדי להשיג את אותה מידת האינטנסיביות הכתם כמו עם ריאגנטים לשעבר.
בלבלב האנושי, איים קטנים היו המותווית על ידי אינסולין, גלוקגון, secretogranin 3 (איור 2). תאי שוואן היו מאפשרת שימוש גליה חלבון חומצה fibrillary (GFAP, איור 2 ו- 3 א איור). העצבים צבעונית עם נוגדנים נגד סמן הפארא-סימפתטי פפטיד מעיים vasoactive (VIP) היו עם תמונה-Lightsheet (איור 3B). העצבים הסימפתטית ניתן לראות עם צביעת עבור hydroxylase טירוזין (לא מוצג).
איור 1. לבלב אנושי סליקה אופטי. (א) תער משמש כדי לחתוך והרפו מקטע של פרפין-מוטבע רקמה (לוחות העליון) לפני הסרת סעיף הרקמה ולשרוט משם פרפין עודף של הרקמה (לוחות התחתון). דגימות רקמה נציג מוצגים לפני (B שמאלה, C למעלה) ואחרי (נכון B, C האמצעי) אופטי קרחת היער של רקמות פרפין-מוטבע, כפי שמתואר בסעיף פרוטוקול. הרקמה שנוקה, קבועה אינה שקופה לחלוטין לאחר ניקוי (B צודק, C העליון) , לעיתים קרובות רקמת נפיחות ניתן להערכה (C, בחלונית האמצעית). הרקמה שנוקה הופך שקוף לחלוטין לאחר equilibration חישוקים (C, החלונית התחתונה). גודל ברים: 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. רשת נוירו-סקסיסטית אנושי. לבלב אנושי דגימות נוקתה כמתואר nPOD תורמי איברים או רקמות פרפין-מוטבע ארכיוני. (A-D) תאי שוואן (GFAP +, לבן), תאים אנדוקריני מוצגים מוכתם על ידי אינסולין (אדום) ו גלוקגון (ירוק). (א) Confocal הטלה בעוצמה מיקרוסקופ ומקסימום (MIP) מראה העקיבה של תאי שוואן (GFAP +) על העצבים זורם ליד כלי הדם בפריפריה איון והארכת לתוך ע. שיבוץ מדגים ברזולוציה גבוהה שהושג ומציג קשר בין תאי שוואן GFAP + תאים אנדוקריני. (B) תמונת תלת-ממד של החלונית (קנה מידה: x = 50 מיקרומטר, y = 20 מיקרומטר, z = 25 מיקרומטר) א מדגם פרפין-ההסכם מוצג הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הציג כמו הקרנה בעוצמה מקסימלית (ג) ו 3D (D), קנה מידה: x, y = 50 מיקרומטר, z = מיקרומטר 25). גודל ברים A, C: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. לוויזואליזציה תלת-ממדית, תפרים. שלושה אוספי תמונות התפר נרכשו של תאי שוואן צבעונית באמצעות GFAP ומיקרוסקופיה קונפוקלית ועקב באמצעות שימוש בתוסף מעקב neurite בתוכנה ניתוח התמונה. (א) המילוי 3D של המעקב מוצג (גודל ברים: x = 150 מיקרומטר, y = 200 מיקרומטר (0.2 מ מ), z = 120 מיקרומטר) (B) A ברית מדגם הוכתם נוגדן VIP, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ lightsheet. המחסנית > 1 מ מ עומק, סיבי עצב נראים בבירור ברזולוציה גבוהה. סיבי גלישת צינור אוורור (יח, קידמה) ולא על גנגליון (G, רקע) ניתן לראות (רשת גדולה: x, y, z = מיקרומטר 200; סימוני שנתות: x, y, z = 40 µm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הזמינות של שיטות ניקוי אופטי חדשות התירה חסר תקדים בקנה מידה גדול לבדיקות של סנטראל ומערכות העצבים ההיקפית במודלים של בעלי חיים. הדפוסים העצבוב הכוללת בלבלב האנושי הם נחקרו במידה רבה בשל צפיפות רקמת וקשיים ברכישת biospecimens באיכות גבוהה. פרוטוקול זה מציע של רקמות ממוטבת ניקוי הפרוטוקולים של רקמת לבלב אנושי מדגימות ארכיוני קבוע או פרפין-מוטבע.
ניקוי הזמן תלוי גודל המדגם, מקבע סוג, משך, משך האחסון, עשוי לדרוש 1-8 שבועות, אז השיקולים הבאים הם קריטיים. זה הכי טוב לנקות רקמות זמן קצר לאחר מכן הקיבעון PFA 4% במידת האפשר כי אחסון לטווח ארוך מגדילה זמן ניקוי. כדי לצמצם את זמן ניקוי, הסכום של מחברים ב מונומר הידרוג היה ירד מ 4% משמש שלב קיבוע 1% בלבלב האנושי. בשביל לרקמות אחרות, במיוחד העכבר רקמות, הכמות של כדורגלן הכרחי כדי לספק קשיחות הידרוג מספיק כדי לשמר אנטיגנים להיקבע מדעית. סליקה נאותה חיונית גם מאז נוגדן חדירה מצטמצם ברקמות שנוקה לקוי, משטח מכתים באמצעות נוגדנים משניים הוא גדל. שינוי הפתרון ניקוי כל יום (או אחרים, אפילו מדי יום) הטובה ביותר היא לשמור על pH קבוע דטרגנט טריים. לעומת זאת, יתר ניקוי באופן שלילי משפיע על מורפולוגיה הסלולר ומגביר רקמות friability. מאז דגימות הלבלב לנקות לצר הגלום פתולוגיות כגון אזורים של פיברוזיס של דלקת לבלב כרונית או פתולוגיות אחרות, חשוב לעקוב אחר תהליך זה לעיתים קרובות. שימוש סעיפים עבה vibratome יכול לשמש גם כדי להפוך עוביים אחיד עדיין אינם נדרשים. פיקוח על תהליך ניקוי, אז דגימות יוסרו דטרגנט ברגע אור עובר בקלות הדגימה, מבטיח כי המדגם מנוקה מספיק.
נוגדן חדירה צביעת משטח הם נושאים חשובים שיש לקחת בחשבון עם דגימות ברית. כדי להבטיח חדירה נוגדן טוב, חיוני תקופת דגירה דגימות עם נוגדנים העיקרי לפחות 2 ימים. נוגדנים שונים במחירים שונים דיפוזיה, צריך להיות מותאם באופן אינדיבידואלי, אבל עבור רוב נוגדנים, 4 ימים היה משך מספיקה לחדירה מלאה במדגם3 1 מ מ. אם צביעת משטח היא בעיה, במיוחד עבור Lightsheet הדמיה, המדגם אולי לחצי או המשטח גזור משם לאחר מכתים. יהיה צפוי נוגדנים תבנית קטנה כאשר היא זמינה כדי לסייע עם חדירה לרקמות8. נוגדנים preconjugated אינם מופיעים לעבודה כמו גם השיבוט unconjugated אותו, רקע גבוה יותר מן הכריכה לא ספציפית וחדירה לרקמות עניים יכולים להיות שנצפו אם הם עובדים בכלל. להצלחה משופרת עם נוגדנים preconjugated, להגדיל את הנסיוב, TritonX-100 ריכוזים ב ההכתמה מאגר ולהשתמש incubations ארוך יותר (> 4 ימים). לאחר צביעת, דגירה של המדגם של המכון במשך מספר ימים היא קריטית. רקמות שנוקה נהדר ב- PBS, שפות ולשונות הדגירה גורם להם להתכווץ חזרה לגודל המקורי. במיוחד עם lightsheet הדמיה, המדגם צריך להיות באופן מלא equilibrated לפני הדמיה.
כאשר הדמיה דוגמאות על מיקרוסקופ קונפוקלי, התיקון חייב להיות קבוע בכל פעם שמיקום חדש נבחר. רכישת במעמקי השונות וריאציה מכתים בעוצמה לאורך כל הרקמה מצריך התאמות עבור כל אזור הרקמה לדימות בצורה אופטימלית. באופן דומה, הנוגדנים משני המשמש להתייחס בקפידה. Unmixing רפאים הוא מאתגר בדגימות ברית, כך fluorophores כראוי יש לבחור חפיפה עירור או פליטה נמוכה להבטיח קליטה בהירים בעת סינון פליטות על מיקרוסקופ קונפוקלי. עבור כל יישום, איזון חייב להיות פגע בין רזולוציה, מהירות הדמיה הפחתת רעש כך ניתן לרכוש את התמונה באיכות הטובה ביותר מבלי הלבנת-צילום. הרזולוציה גדול מ- 1024 x 1024 אינו ניתן לגילוי על ידי העין האנושית, אך ייתכן הכרחי עבור יישומים מסוימים אם כימות של כתם יש צורך.
ישנם דברים רבים לשקול בעת בחירת שיטת ניקוי אופטי בעת בחירת סליקה אופטי כל השיטות מסורתיים יותר. אנטיגנים שפע נמוך לא ניתן לזיהוי באמצעות השיטה ההסכם לכן קיימות מגבלות זיהוי אנטיגן. אנטיגנים מסוימים כגון אנטיגנים אימונולוגי (CD3, CD4, CD8, וכו ') נהרסים על ידי שיטת ברית, לא ניתנים לגילוי למרות באיכות גבוהה נוגדנים זמינים לגלות אותם. מגבלה נוספת של שיטה זו הוא ההשתנות הטבועה בין הלבלב התורם אשר קשה להבחין עד לאחר ניקוי כתמים. כל רקמה נוטה כדי לנקות את כתם דומה בין הליכים, אבל תורם שונים רקמות יש פעמים סליקה נרחב משתנה ואיכות מורפולוגיה רקמות לאחר ניקוי. היכולת להשתמש רקמות ארכיוני עשוי להמתיק מגבלה זו אם אחד יכול לקבל גישה נאותה מספר רב של דוגמאות הלבלב החולה למרות זה לא נחקר ביסודיות. פרוטוקול ההסכם דיווח בזאת נמצאה להיות זולה מיושמים בקלות עם ציוד מעבדה סטנדרטיים. דוגמאות שנוקה היו מתאימים עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתיים, כמו גם 2-פוטון וטכנולוגיות Lightsheet וסיפק ברזולוציה גבוהה תמונות 3D של העצבים ושל בחלקים נרחבים בלבלב האנושי. יישומים עתידיים של הליך זה כוללים מחקרים על התפתחות עוברית הלבלב עבור תאים אקסוקרינית והן האנדוקרינית, איון לימודי סוג 1 וסוכרת סוג 2.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה ד ר אן פו, ג'וזף Canzano לקבלת סיוע טכני, ד ר ג'ניפר Treweek עצה שלא יסולא בפז, ד ר קריסטין אוברטון, ד ר קרל Deisseroth עבור הכשרה MCT דרך בית המלאכה בהירות אוניברסיטת סטנפורד. האגודה לסוכרת נעורים nPOD הארגונים רכש איברים מסופקים דגימות רקמה. עבודה זו מומן על ידי האגודה לסוכרת נעורים (47-2014-1), הלמסלי צדקה אמון (של HCT 2015-PG-T1D052), NIDDK TR001773 1OT2 כדי MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
