Summary
クリア方法最適化されたプロトコルを使用して 3 次元 (3 D) 画像ひと膵臓セクションにパッシブを紹介します。この原稿は、複数の蛍光染色膵島を支配する自律神経・感覚神経回路網の重要な要素を識別するために続いてパッシブ光クリアの手順を示します。
Abstract
従来の組織学的方法を使用して、研究者はイメージ全体に彼らの能力で妨げられる組織や臓器大規模 3 D で。組織切片は、< 20 μ m としてホルマリン固定パラフィン切片スライド ガラスのまたは < 浮遊固定セクション 500 μ m。したがって、広範な努力、シリアルセクショニングとサンプルの 3 D を再現する大規模な画像再構成法に必要な > 500 μ m の従来の方法を使用します。さらに、高分子、特に脂質の組織内からの光の散乱により深度イメージング > 最も共焦点顕微鏡で 150 μ m。光の拡散を抑えると単純な共焦点顕微鏡を用いた深部組織イメージングを可能にするのには、さまざまな光の清算方法が齧歯動物および人間のティッシュのサンプルに関連する固定である浸漬によって開発されています。いくつかの方法は、関連し、アクリルアミドとドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とクリア組織タンパク質架橋を使用します。他光クリア技術は、さまざまな長所と短所、各変更に各種溶剤を使用しました。ここでは、ひと膵臓の神経支配の研究、特に膵島の神経支配の尋問、最適化されたパッシブ光クリアする方法を説明します。
Introduction
最近まで、大規模な組織や全臓器の 3次元 (3 D) 復興を骨の折れるシリアルセクショニング、染色、および複数のセクションの再構成を行った。これらのメソッドは、大量の連続切片、抗体、および散乱防止組織内深部イメージングの貧しい人々 の組織浸透への依存を含むいくつかの欠点を持っていた。大きい光と抗体浸透できるように、研究者は光散乱の脂質の大部分を除去しながら蛋白質の抗原を維持するために化学的方法を開発しました。複数の関連するメソッドは、堅いイメージング組織の Clear Lipid-Exchanged アクリルアミド ハイブリダイズ ハイドロゲル (透明度)、受動的な明快さテクニック (協定) と灌流支援エージェント リリース原(PARS) (文献1,2 ,3,4,5,6)。わかりやすくメソッドは、ホルムアルデヒド、アクリルアミド、SDS ソリューション2で電気泳動を用いた脂質除去に続いて bis ハイドロゲルを用いたタンパク質の安定化に基づいています。このアプローチ後クリア パッシブ修正され画像7を高度な。さらに最適化は、協定8と呼ばれる手法の最短クリア時間と最適な抗原の安定化を取得する bis の除去とゲル溶液 (1-4%) のパラホルムアルデヒドをさまざまな割合につながった。これらの光クリアの技術を開発する初期の試みには、トランスジェニック マウス モデルで焼入れの内因性蛍光タンパク質や作品に困難であった有機または他の化合物が関与しています。これらの追加メソッドは、スケール、遮るもののない脳/体カクテルおよび計算の分析 (キュービック)、スイッチと Dimensional Imaging of Solvent-Cleared の器官 (ディスコ) メソッドは、さまざまな長所と短所9とすべて含まれて 10、11,12。脂質豊富なマウス脳組織の元の明快さのメソッドを開発し、光の清算方法は、ヒト組織7,8,11,13,14 テスト限られました。.
光の清算方法は、そのままマウスの中枢神経系のように長距離にわたってトレース神経に最適です。膵臓は自律神経・感覚神経系によっても支配されています。膵内分泌コンパートメント、ランゲルハンス島、全体の器官 (1-2%) の非常に小さい部分を構成して、小島はサイズ (50-250 μ m)、内分泌細胞比率と糖尿病 ( 15 の見直しを中心に密度の不均一性を知られています。 ,16)。プロトコルを開発する上でいくつかの光の清算方法は、ひと膵臓を調べたし、協定プロシージャは神経と島の優れた形態温存 (〜 2 週間) をクリアする時間の最適なバランスを提供するために発見されました。最後の最適化手順が記載されて神経島国的なネットワークの大規模な (ミリ波距離) やそのまま複数の膵島の高解像度の 3 D イメージング。手法は、サンプルと同様に、ストレージ中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込まれた後直後固定ひと膵臓または適してです。サンプルは共焦点イメージングのために適しているまたは lightsheet 顕微鏡。
Protocol
フロリダ大学治験審査委員会と連邦政府のガイドラインに従ってすべての実験を行った。
注意: パラホルムアルデヒド、アクリルアミドは、有害刺激です。適切な個人用保護具 (白衣、手袋、眼の保護) と発煙のフードで試薬を処理します。
1. ホルマリン固定組織の deparaffinization (新鮮な組織で作業する場合は手順 2 に進みます)
- 新しいかみそりの刃やメスを使用して、組織の表面に垂直なパラフィンをカットします。それを緩めるまで組織の端にパラフィンをカットします。軽く緩めてをクリアする光学的組織を削除する鉗子やヘラを使用します。へら (図 1 a) を使用して組織から余分なパラフィンを優しくこすり取る。
- キシレン (組織部 3 mm x 3 x 3 約 30 mL) でガラス容器を満たし、室温 (RT) で 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい。
- 1.2.1 と同じボリュームと新鮮なキシレンで別のガラス容器を満たしなさい。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい
- 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 100% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい
- 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 95% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい
- 1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 70% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい
- リンスで 0.01 M リン酸組織緩衝生理食塩水 (PBS) と組織、パラフィン (図 1 b、右側のパネル) がしたことを確認、24 時間平衡に円錐管で 0.01 M の PBS の場所。
2. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の定着剤を準備します。
- 16 %10 mL のピペット 50 mL の円錐管に PFA 4 mL 0.1 M PBS を追加し、26 mL 脱イオン蒸留水 (ddH2O) を追加。キャップを閉じるし、一時的に混ぜます。
- 4% の大量先行と因数で冷凍は、PFA が行うことができます。4 ° C で 1 週間、-20 ° C で 1 ヶ月、因数は室温 (RT) で 1 日良い
3. 膵臓固定
- 作りたての 4% 膵臓サンプル (≤ 1 × 1 × 2 cm) を修正 48 h の 4 ° C で PFA。サンプルが 1 × 1 × 2 cm、小さいに解剖するメスや剃刀の刃を使用するよりも大きい場合は厚さが 1 cm 以上の部分します。少なくとも 15 分 0.01 M PBS の 3 つの変更で組織サンプル各洗浄を洗浄し、0.01 %pfa/0.01 M PBS または 0.5% ナトリウム アジ化/0.01 M PBS で 15 mL 遠心管に使用するまでを格納します。
- 固定後に、、さらなる処理のための 1-2 mm 厚いセクションに組織をセクションします。断面も支援するために、vibratome を使用します。
注: セクションの最終的な数が開始のサンプルのサイズによって異なります。
4. ハイドロゲルにティッシュを埋め込む
- 次のとおりの 4% アクリルアミド/1% パラホルムアルデヒド (A4P1) ハイドロゲル モノマー溶液 200 mL を準備します。
- 電磁攪拌プレートの上にバケツに氷にフラスコを配置します。フラスコは平らに座っているかどうかを確認し、電磁攪拌棒を追加します。
- 順序で、次を追加: 250 mg VA 044 イニシエーター、12.2 mL 16 %pfa 溶液、20 mL 冷 (4-8 ° C) 40% アクリルアミド溶液 20 mL 0.1 M PBS 147.8 mL 冷たい (4-8 ° C) ddH2O。少なくとも 10 分のための磁気攪拌棒全体ハイドロゲル ソリューションをミックスし、次のステップのための氷にソリューションを残します。
- 15 mL コニカル管氷で横に配置ゲル溶液フラスコ。管にピペットのモノマー液 14 mL と 1-2 mm 厚固定ティッシュ サンプルの一枚を追加します。チューブをキャップします。
- モノマー溶液サンプルをインキュベート 4 ° C で 3 日間、光から保護します。割り切れる任意の残りのモノマー ソリューションと将来の使用のための-20 ° C でストア。
5. ドガ モノマー ソリューションと、ゲルの重合
- ガス N28を使用してゲル モノマー溶液から酸素を取り除きます。
- 氷のバケツを準備し、氷上ハイドロゲル モノマー溶液サンプルを配置します。
- サンプル、パラフィンの膜、およびタイマーごと 2-3、18 ゲージ注射針を収集します。窒素タンクにチューブを接続し、窒素が流れることができるようにします。氷のサンプルを保ちながら慎重に 1 つの側面のサンプルを含む円錐管のキャップに穴を開けるし、それまでを通して注射針は液体モノマー溶液の表面の下を押します。
- キャップの反対側を穿刺する別の注射針を使用、浸水になることはできません。
注: 2 番目の針はチューブにはけ口をつけるでしょう。 - ヒドロゲルの下に沈め注射針に窒素タンクからチューブを接続し、それが液体を着実にバブルまで窒素ゆっくりに入れます。
- 10 分の液体をバブルに窒素を許可します。
- 酸素を削除すると、すぐに両方の針を削除し、ガス管と環境の間の任意の一層の交流を防ぐためにパラフィン フィルムとキャップをカバーします。3 h、ゲルの重合を 37 ° C でインキュベーターで脱サンプルを配置します。
6. 組織クリア
- クリア ソリューション (ph 8.5 4 %sds) 500 mL を準備します。DdH2O の ~ 300 mL、電磁攪拌棒で攪拌しながら、50 mL の 0.1 M PBS と 20 g SDS 粉末を追加します。水酸化ナトリウムと塩酸 8.5 を使用してソリューションを調整します。最終巻が 500 mL になるまでは、ddH2O を追加します。
- 重合後余分なゲルを垂れ流し、化学廃棄物容器に捨てます。優しくサンプルから離れてハイドロゲルを一掃し、化学廃棄物容器に捨てる紙タオルを使用します。
- 0.01 M PBS の 3-5 交流 (化学廃棄物に捨てる洗浄液) のサンプル 15 分各洗浄ステップを洗います。バッファーをクリア 40 mL と 50 mL の円錐管にサンプルを転送します。
- 37 ° C でクリア バッファーにサンプルをインキュベートし、他の毎日新鮮なクリア バッファーにサンプルを変更します。
- 適切な決済を確保するためにサンプルのサイズ (3 mm × 3 mm × 3 mm サンプル 〜 8 週間) に応じて 2-8 週間のクリアリング バッファー内のサンプルをままにします。
- 組織の清算を監視し、完了を停止します。適切な決済を確認する光まで保持することによって、サンプルが十分に透明であることを確認 (通常いくつかの日焼け着色は外分泌腺領域で維持されます)。
注: 過剰消去されたサンプルが端擦り切れ表示され、テクスチャーが鉗子で拾ったとき非常に柔らかくなります。均等にないをクリアするサンプルが一般的です。また、組織は完全に透明 (挿入、図 1) メディアのマウントに配置されるまでできません。
7. 複数の蛍光
- 40 mL 0.01 M PBS 新鮮なバッファー頻繁 (4-5 バッファー変更、合計 40 mL で洗うたび、最終的な洗浄まですべての時間を変更する) に変更すると RT で 1 日 60 rpm でシェーカーでサンプルを洗います。一晩室温に続ける最終的な洗浄をしましょう
- 協定染色バッファーを準備します。500 mL の 0.01 M PBS、アジ化ナトリウム 50 mg、0.5 mL TritonX 100 を追加します。よく混ぜます。
- 一次抗体とサンプルをインキュベートします。
- 2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり少なくとも 1 mL 容量を推奨)。
- 染色バッファー 2% 血清/協定に一次抗体を追加します。(つまり場合は、抗体はの標準的な免疫組織化学、協定の汚損のための使用 1: 100 希釈 1: 500) 標準的な免疫組織化学に使用できる協定の汚損のため約 5 x の一次抗体の量を使用します。
- ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと一次抗体溶液をチューブ内に配置します。
- 2-4 日 60 rpm でシェーカーの RT で孵化させなさい。0.01 M PBS 新鮮なバッファーを 4-5 回の変更手順 7.1 のように一晩で最終的な洗浄に出入りで 60 rpm でシェーカーの RT でサンプルを徹底的に洗います。
- 二次抗体のサンプルをインキュベートします。
- 2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり 1 mL 容量を推奨)。
- 1: 200 (1 mL バッファーで 5 μ l) の濃度で二次抗体を追加します。
注: 複数の一次抗体を使用している場合、小さいフォーマットの抗体は最寄りと高いクロス吸着抗体です。 - ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと二次抗体溶液をチューブ内に配置します。
- 2 日間 60 rpm でシェーカーの RT でインキュベートし、光からサンプルを保護します。
- サンプルを徹底的に洗って、一晩で洗う手順 7.1 では、新鮮なバッファーを 4-5 回の変更と決勝を残して 0.01 M PBS で 60 rpm でシェーカーで常温のように、洗浄中に光から守る。
8. 画像のサンプルを実装
- 屈折率整合ソリューション (リム) バッファーを準備します。
- 非イオン性の密度勾配媒体 (例えば、Histodenz) の 11 g を量りし、慎重に 50 mL の円錐管に転送します。
- 〜 5 mL 0.02 M リン酸バッファー (PB)8をへらを使用して粉体非イオン密度勾配媒体から空気を解放するを追加します。
注: ソリューションは非常に粘りがある、よく混ぜます。 - 多くの鉛を使用して 10 の mL にボリュームをもたらす、ヘラで混ぜるし、チューブにヘラを過剰をこすり。
- 37 ° C 溶解するまでインキュベート リム、反転、優しく混ぜる必要に応じて。
- リムにサンプルを転送します。これを行うには、1 mL をピペット 2 mL 平底チューブにリムします。ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくとリム ソリューションとチューブ内に配置します。
- リムのサンプルが水没するチューブが軽きます。リムのイメージングの前に 2-4 日間常温の光から保護されてベンチにサンプルを配置します。
- 画像、8 ウェル coverslip 下部チャンバー スライドにリムの少量を配置します。だけだけで十分なコートの下を追加しよりフローティング逆スコープの画像がより困難にするサンプルの原因となります。井戸の中にサンプルを追加し、イメージング用スライド キャップします。
9。 画像
- 共焦点顕微鏡とイメージング ソフトウェア
- 使用協定サンプルを染色する蛍光物質の発光スペクトルの励起の適切なレーザーを選択します。チャンネル間のすべての重複が排除され、集録ソフトウェアの設定を調整します。(2 つ fluorophores が付いている同様の励起スペクトル) は、必要に応じて個別のトラックを使用します。
- 画像の取得を設定します。
- 最大集録速度、16 ビット、4 つ以上の平均値および 1024 × 1024 の解像度を選択するかより良い。
- イメージを作成するオブジェクトをズームインします。
注: これは写真漂白を削減し、ファイル サイズと下流編集減らすも集録時間を減らします。
- Z スタックをセットアップします。
- 使用されている目的のために最適な断面を選択します。デコンボリューションは、後で必要な場合は、z ステップを 1 μ m など最適なより小さいの使用にします。
- Z スタック補正を使用します。
- 組織の表面に最も近い開始目的を z 平面を通る焦点を当て、利得を上げるし、訂正を追加します。補正のためのレーザーの設定を変えてはいけない!
- 1 つの平均、512 x 512 の解像度、最大集録速度のテスト スタックを取得します。最終的な高解像度の z スタックを取得する前に各色のスタック全体で均一な輝度があることを確認する 3 D でイメージを確認します。
- Lightsheet イメージング
- サンプルはイメージングの商工会議所で新鮮なリムにサンプルを転送、少なくとも 1 日の商工会議所で平衡することができること、理想的には、少なくとも 24 時間のイメージングのリムで平衡されているを確認します。
- イメージングのサンプルをマウントします。
- サンプルをマウントする最小 (黒) 毛細血管を選択します。
- 使用するパテまたは毛細血管の最後にスーパー接着剤を塗布しながらサンプルを保持するために料理します。少しとして可能な限り組織の表面に触れる毛細血管に組織を接着します。
- イメージングのサンプルを挿入します。
- 5 X、25 X 目標適切なピボットを使用して光学的にクリアされたサンプル スキャン オプションを使用してイメージ。シャドウやぼかしが発生した場合、サンプルを回転やり直して、や続きをリムで平衡にサンプルを聞かせてください。
注: 1 mm スタックは、設定によっては 5 分未満で一般的に取得できます。 - 表示および画像解析ソフトウェアを使用して画像のスタックを編集します。
Representative Results
これらの染色の手順は、小島と関連付けられたネットワーク自律神経と感覚を調べる人間の膵臓の大規模な検討を提供するために開発されました。透明度7、iDISCO17, を含むいくつかのプロシージャがテストされた、ひと膵臓と共焦点イメージング協定8最高見られる協定方法が適しています。
一次抗体最初でテストされた適切な正と負のコントロールのサンプルとひと膵臓サンプルを固定 (マウスの脳、その他)。一次抗体と推奨希釈は、多くの数および組織のソースによって抗体の希薄を最適化するために各研究室が期待できる、材料表に表示されます。一次抗体のロットごとに変動できる染色強度と、特異性に影響を与えるし、旧試薬と同程度の汚れ輝度を達成するために検証を必要とします。
ひと膵臓の小島が線引きインスリン, グルカゴンおよび secretogranin 3 (図 2)。シュワン細胞はグリア線維性酸性蛋白 (GFAP、図 2および図 3 a) を使用して区切られただった。Lightsheet (図 3 b) の神経副交感神経マーカー血管作動性腸管ペプチド (VIP) に対する抗体で染色をイメージしました。交感神経は、チロシン水酸化酵素 (図示せず) 染色と見ることができます。
図 1。ひと膵臓の光クリア。(A)かみそりの刃を使用カットしてティッシュ セクションを削除して、(底面) の組織から離れて余分なパラフィンをこする前にパラフィン包埋組織 (最上位のパネル) のセクションを緩めます。(B 左 C 上)前に、とプロトコル] セクションに記載されている、パラフィン埋め込まれたティッシュの(B の右、C の中間)の光クリア後、代表組織サンプルが表示されます。クリア、固定組織は、 (B C トップ)とよく組織をクリアした後は完全に透明ではない腫れすることができます感謝(C、中央のパネル)。クリアされた組織は、リム(C, 下部のパネル)の平衡の後完全に透明になります。スケール バー: 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。人間の神経島嶼ネットワーク。ひと膵臓サンプルは、前述の nPOD ドナーやアーカイブのパラフィン包埋組織からクリアされました。(A ~ D)シュワン細胞 (GFAP + 白) と内分泌細胞がステンド グラス (赤) インスリンおよびグルカゴン (緑) で表示されます。(A)共焦点顕微鏡と最大強度投影法 (MIP) 膵周囲血管の横に走ることと、島に拡張の神経シュワン細胞 (GFAP +) のトレースが表示されます。はめ込みは、高解像度, GFAP + シュワン細胞と内分泌細胞間の接触を示しますを示します。(B)パネルの 3 D 画像 (スケール: x = 50 μ m、y = 20 μ m、z = 25 μ m) a.共焦点顕微鏡を介してイメージにパラフィン協定のサンプルと最大強度投影(C)と 3 D (D)を提示、スケール: x, y = 50 μ m、z = 25 μ m)。スケール バー 、C: 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3. 3次元可視化とステッチします。3 つのステッチの画像のスタックは、シュワン細胞 GFAP と共焦点顕微鏡を用いた染色し、画像解析ソフトウェアで突起トレーサー プラグインを使用してトレースの買収されました。(A)トレースの 3 D の塗りつぶしが表示されます (バーをスケール: x = 150 μ m、y = 200 μ m (0.2 mm)、z = 120 μ m) (B) A 協定サンプル VIP 抗体で染色された、lightsheet 顕微鏡を使ってイメージ化します。スタックが > 高解像度 1 ミリメートルの深さと神経線維が見えます。ダクト (D、フォア グラウンド) と神経節 (G, 背景) を包む繊維を見ることができる (大規模なグリッド: x、y、z = 200 μ m; 目盛: x、y、z = 40 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
新しい光の清算方法の可用性は、動物モデルで中央の前例のない大規模な試験と末梢神経系を許可しています。ひと膵臓の全体的な神経支配のパターンが主として未踏査組織密度と高品質 biospecimens の取得の難しさのためです。このプロトコルでは、固定またはパラフィン埋め込まれたアーカイブのサンプルからのひと膵臓組織のためのプロトコルをクリア最適化された組織を提供しています。
クリア サンプル サイズ、固定型、期間、保存期間に依存し、次の考慮事項が重要ですので、1-8 週間を必要があります。長期的なストレージ クリア時間が長くなりますので可能であれば 4 %pfa 固定後すぐに組織をクリアすることをお勧めします。クリア時間を最小限に抑えるためハイドロゲル モノマーの PFA の量はひと膵臓に 1% 固定ステップで使用される 4% から減少しました。PFA は、抗原を維持するために十分なゲル剛性を提供するために必要な量、その他の組織、特にマウス臓器の経験的に決定する必要があります。抗体の浸透が悪いクリア組織縮小され二次抗体による染色表面が増加するので、十分なクリアも不可欠です。クリア ソリューションを変更する他のすべての日 (またはも毎日) pH 定数と洗剤を新鮮に保つために最適です。逆に、悪影響をクリア過剰細胞形態に影響を与えるし、組織壊が増加します。以来、いくつかの膵臓サンプルはオフに均等に慢性膵炎の線維化の領域など固有の病態や他の疾患のためには、このプロセスを頻繁に監視することが重要です。Vibratome 厚いセクションの厚さの均一にも使えますまだ必須ではありません。光はサンプルでは、簡単に通過するとすぐにサンプルが洗剤から削除されますので、クリア処理を監視には、サンプルが十分にクリアされることが保証されます。
抗体の侵入と表面の汚損は、協定サンプルで考慮すべき重要な問題です。良い抗体浸透するように、少なくとも 2 日間の一次抗体のサンプルをインキュベートするが重要です。様々 な抗体が異なる拡散率がある個別に最適化する必要があります、ほとんどの抗体の 4 日間は 1 mm3サンプルの完全溶込みの十分な期間。表面の汚損は、問題は場合、Lightsheet イメージングの特にサンプルは、半分にカットする可能性があります。 または染色後表面を離れて解剖。小さなフォーマット抗体利用可能な場合は組織浸透8を支援するために期待されます。Preconjugated 抗体は同じ非クローンだけでなく、動作するように表示されない、非特異的な結合および貧しい組織侵入から高い背景は、まったく動かないかどうかを観察。Preconjugated 抗体を用いた改善成功のため増加血清と染色の TritonX 100 濃度バッファーし長い孵化を使用 (> 4 日間)。汚損の後数日間リムでサンプルの培養が重要です。PBS とリム孵化クリア組織膨潤は、縮小する元のサイズに戻るようになります。Lightsheet イメージングと特にサンプルは、イメージングの前に完全に平衡する必要があります。
イメージングの共焦点顕微鏡のサンプルとき、補正は新しい位置を選択するたびに設定する必要があります。さまざまな買収深さの染色組織全体の変化は、最適なイメージを作成する組織の各領域の調整を必要とします。同様に、使用される二次抗体を慎重に考慮する必要があります。共焦点顕微鏡での排出量をフィルター処理するときに明るい信号を確保するための低励起または排出の重複、fluorophores が付いてを適切に選択する必要がありますスペクトル分離協定のサンプルでは困難です。各アプリケーションの写真漂白なし最高品質の画像を得ることができるように、解像度、イメージング速度とノイズ低減のバランスを打たれなければなりません。1024 x 1024 より高い解像度は人間の目によって検出されていないが、汚れの定量化が必要な場合特定のアプリケーションの必要があります。
光消去技法を選択するとき、他のより伝統的な方法を介して光をクリアを選択するときに考慮すべき多くのものがあります。豊富な低抗原は、抗原の検出に限界がある協定メソッドを使用して検出できない場合があります。免疫学的抗原 (CD3, CD4, CD8,など) などの特定の抗原協定法によって破壊される、にもかかわらず、それらを検出する使用可能な高品質の抗体検出されません。このメソッドのもう一つの制限は、染色をクリア後まで見分けることは困難であるドナーの膵臓間自然な可変性です。オフにし、プロシージャ間同様に汚れがちである各ドナー組織が異なるドナー組織広く様々 なクリア時間と組織形態品質クリア後。これ徹底的に調査されていないが患者の膵臓サンプル数が多いへの十分なアクセスを持つことができます 1 つ場合、アーカイブの組織を使用する能力はこの制限を軽減可能性があります。ここ報告協定プロトコルが安価で容易に標準的な実験装置を使って実装する見つかりました。クリアのサンプル Lightsheet 技術と従来の共焦点顕微鏡と同様 2 光子イメージングに適した、高解像度の神経と人間の膵臓の大部分に島の 3 D 画像を提供します。この手順の将来のアプリケーションには、2 型糖尿病と 1 型の膵島研究外分泌と内分泌の両方のコンパートメントの胎児の膵臓の発達に関する研究が含まれます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、博士アン フーとジョセフ Canzano のテクニカル サポートと貴重なアドバイスの博士ジェニファー Treweek、博士クリスティン オーバートン、博士 Karl Deisseroth スタンフォード大学わかりやすくワーク ショップを通じて MCT に訓練のためにありがとうございます。JDRF nPOD と臓器調達機関は、組織サンプルを提供しました。この作品は、JDRF (47-2014-1)、ヘルムスレー公益信託 (HCT 2015-PG-T1D052)、MCT に NIDDK 1OT2 TR001773 によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
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