Summary
Vi præsenterer her, en protokol til billede menneskelige bugspytkirtlen sektioner i tre dimensioner (3D) ved hjælp af optimeret passiv clearing metoder. Dette manuskript viser disse procedurer for passiv optisk clearing efterfulgt af flere immunofluorescens farvning for at identificere nøgleelementerne i de autonome og sensoriske neurale netværk innerverer menneskelige Holme.
Abstract
Ved hjælp af traditionelle histologiske metoder, forskere er hæmmet i deres evne til at billedet hele væv eller organer i storstilede 3D. Histologiske sektioner er generelt begrænset til < 20 µm som formalin fast paraffin afsnit på glas dias eller < 500 µm til frit svævende fast sektioner. Derfor, omfattende bestræbelser er nødvendige for serielle skæring og omfattende billede genopbygning metoder til at genskabe 3D prøver > 500 µm ved hjælp af traditionelle metoder. Derudover lys scatters fra makromolekyler i væv, især lipider, forhindrer imaging til en dybde > 150 µm med mest Konfokal mikroskoper. At reducere lysspredningen og give mulighed for dybe væv imaging ved hjælp af simple konfokalmikroskopi har forskellige optiske clearing metoder udviklet, er relevante for gnavere og menneskelige vævsprøver fast ved nedsænkning. Flere metoder er relateret og bruge protein crosslinking med acrylamid og væv clearing med sodium dodecyl sulfat (SDS). Andre optiske clearing-teknikker, der anvendes forskellige opløsningsmidler selv hver ændring havde forskellige fordele og ulemper. Her, er en optimeret passiv optisk clearing metode beskrevet for undersøgelser af den menneskelige bugspytkirtlen innervation og specifikt for afhøring af innervation af menneskelige Holme.
Introduction
Indtil for nylig, blev 3-dimensionelle (3D) genopbygning af store væv eller hele organer udført gennem besværlige seriel afsnitsinddeling, farvning og billede genopbygning af flere sektioner. Disse metoder havde flere ulemper, herunder afhængighed af et stort antal serielle sektioner, dårlig væv penetration med antistoffer, og lys spredning forhindrer dybe imaging inden for væv. For at give mulighed for større lys og antistof penetration, udviklet forskere kemiske metoder for at bevare protein antigener mens du fjerner fleste af lys-spredning lipider. Flere relaterede metoder er Clear Lipid-Exchanged acrylamid-hybridiseret stive Imaging væv hYdrogel (klarhed), passiv klarhed teknik (PAGTEN) og Perfusion-assisteret Agent Release in situ (PARS) (gennemgik i 1,2 ,3,4,5,6). Metoden klarhed er baseret på stabilisering af proteiner ved hjælp af en formaldehyd, acrylamid og bis hydrogel efterfulgt af lipid fjernelse ved hjælp af elektroforese i en SDS løsning2. Denne tilgang blev senere ændret til passiv clearing og avanceret billedbehandling7. Yderligere optimering førte til afskaffelsen af bis og forskellige procentdele af PARAFORMALDEHYD i hydrogel løsning (1-4%) at opnå optimal antigen stabilisering med den korteste clearing tid til en teknik kaldet PAGTEN 8. Tidlige forsøg på at udvikle disse teknikker, optisk clearing involveret økologisk eller andre forbindelser, der var svære at arbejde med og bratkølet endogene fluorescerende proteiner i transgene musemodeller. Disse supplerende metoder indgår skalaer, uhindret hjernen/kroppen Cocktails og numerisk analyse (CUBIC), SWITCH og Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organer (diskotek) metoder, alle med forskellige fordele og ulemper9, 10,11,12. Den oprindelige klarhed metode blev udviklet i lipid-rige mus hjernevæv og optisk clearing metoder havde begrænset testning i humane væv7,8,11,13,14 .
Optisk clearing metoder er ideel til sporing nerver over lange afstande som i det intakte mus centralnervesystemet. Bugspytkirtlen er godt innerveres af både autonome og sensoriske nervesystem. Pancreas endokrine rummet, Holme af Langerhanske, udgør en meget lille del af hele orglet (1-2%) og holme har kendt heterogenitet i størrelser (50-250 µm), endokrine celle proportioner og tæthed især i diabetes (gennemgik i 15 ,16). Udvikle en protokol, flere optiske clearing metoder blev testet for menneskets bugspytkirtel og en PAGT procedure blev anset for at give den bedste balance af tid til at rydde (~ 2 uger) med fremragende morfologiske bevarelse af nerver og holme. Den endelige optimerede procedure er beskrevet her i afgrænsningen af det neuro-ø netværk for storstilet (millimeter afstande) og høj opløsning 3D imaging af flere intakt i bugspytkirtlen Holme. Teknikken er velegnet til menneskelig bugspytkirtlen umiddelbart efter optagelsen eller efter oplagring samt prøver fast i neutral bufferet formalin og indlejret i paraffin voks. Prøverne er egnet til billeddannelse af Konfokal eller lightsheet mikroskopi.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i henhold til University of Florida institutionelle Review Board og føderale retningslinjer.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD og acrylamid er giftige irritanter. Håndtere reagenser i et stinkskab med passende personlige værnemidler (laboratoriekittel, handsker, øjenbeskyttelse).
1. deparaffinization af formaldehyd-fast væv (hvis arbejde med frisk væv, springe til trin 2)
- Brug en ny barberblad eller skalpel til at skære gennem paraffinen vinkelret på overfladen af vævet. Skære paraffin på kanten af væv til at løsne det er færdig. Bruge pincet eller en spatel til at forsigtigt løsne og fjerne væv skal ryddes optisk. Forsigtigt skrabe overskydende paraffin fra væv ved hjælp af en spatel (figur 1A).
- Fyld en glasbeholder med xylen (ca. 30 mL for et 3 x 3 x 3 mm sektion af væv) og inkuberes væv i denne løsning i 24 timer ved stuetemperatur (RT).
- Fyld en anden glasbeholder med friske xylen med samme volumen som 1.2.1. Overføre og inkuberes væv i denne løsning i 24 timer ved RT.
- Placere 100% ethanol i en konisk slange med samme volumen som 1.2.1. Overføre og inkuberes væv i denne løsning i 24 timer ved RT.
- Placere 95% ethanol i en konisk slange med samme volumen som 1.2.1. Overføre og inkuberes væv i denne løsning i 24 timer ved RT.
- Placere 70% ethanol i en konisk slange med samme volumen som 1.2.1. Overføre og inkuberes væv i denne løsning i 24 timer ved RT.
- Skyl væv i 0,01 M phosphat bufferet saltvand (PBS) og sted i 0,01 M PBS i en konisk rør til blandingen henstår i 24 timer ved RT. sikre at vævet er gratis af paraffin (figur 1B, højre panel).
2. Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fiksativ
- Der afpipetteres 10 mL 16% PFA i en 50 mL konisk rør, tilføje 4 mL 0,1 M PBS, og tilføje 26 mL destilleret deioniseret vand (ddH2O). Luk hætten og bland kortvarigt.
- Større mængder af 4% PFA kan gøres videre og frosne i delprøver. Delprøver er godt for 1 dag ved stuetemperatur (RT), en uge ved 4 ° C, og 1 måned ved-20 ° C.
3. bugspytkirtlen fiksation
- Fix bugspytkirtlen prøven (≤ 1 x 1 x 2 cm) i frisklavede 4% PFA ved 4 ° C for 48 h. Hvis prøven er større end 1 x 1 x 2 cm, bruge en skalpel eller barberblad til dissekere i mindre stykker, ikke mere end 1 cm tyk. Vaske vævsprøve i tre ændringer af 0,01 M PBS i mindst 15 min. hver vask og gemme i 15 mL centrifugeglas i 0,01% PFA/0,01 M PBS eller 0,5% natrium indeholder/0,01 M PBS indtil brug.
- Efter fiksering, afsnit vævet i 1-2 mm tyk sektioner til videreforarbejdning. Brug en vibratome til at hjælpe i selv skæring.
Bemærk: Det endelige antal sektioner vil afhænge af størrelsen af den første prøve.
4. Integrer væv i Hydrogel
- Forberede 200 mL 4% acrylamid/1% PARAFORMALDEHYD (A4P1) hydrogel monomer løsning som følger:
- Placer en kolbe på isen i en spand på toppen af en magnetisk røre pladen. Sørg for, at kolben sidder fladt og tilføje en magnetisk røre bar.
- Tilføj følgende i rækkefølge: 147.8 mL koldt (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M PBS, 20 mL koldt (4-8 ° C) 40% acrylamid løsning, 12,2 mL 16% PFA løsning og 250 mg VA-044 initiativtager. Bland hele hydrogel løsning med en magnetisk røre bar til mindst 10 min. og lad løsningen på isen for det næste skridt.
- Placere en 15 mL konisk rør i isen ud for kolbe indeholdende hydrogel løsning. 14 mL monomer opløsning pipetteres i røret og tilføje et stykke af 1-2 mm tyk fast vævsprøve. Derefter cap røret.
- Inkuber prøven i monomer løsning i 3 dage ved 4 ° C og beskytte mod lys. Alikvot eventuelle resterende monomer løsning og opbevares ved-20 ° C til fremtidig brug.
5. afgasses monomere og polymerisere Hydrogel
- Fjerne ilt fra hydrogel monomer løsning ved hjælp af luftformige Nørgaard28.
- Forberede en spand med is og Placer prøven i hydrogel monomer løsning på is.
- Samle 2-3, 18-gauge kanyler pr. prøve, paraffin film og en timer. Tilslutning slangen til kvælstof tank, så kvælstof kan flyde. Samtidig med at prøve på ice, omhyggeligt gennembore hætten af en konisk rør, der indeholder eksemplet på den ene side og tryk på en subkutan nål gennem indtil det er under overfladen af flydende monomer løsning.
- Brug en anden kanyle til at punktere den modsatte side af fælles landbrugspolitik, men ikke tillader det at blive oversvømmet.
Bemærk: Den anden nål vil lufte røret. - Tilslut slangen fra kvælstof tank til kanyle neddykket under hydrogel og langsomt vende på kvælstof, indtil det boblende støt gennem væsken.
- Tillad kvælstof til boble gennem væsken i 10 min.
- Når ilt er fjernet, hurtigt fjerne både nåle og cover hætten med en paraffin film at forebygge enhver yderligere udveksling af gasser mellem røret og miljøet. Afgassede prøven anbringes i et varmeskab ved 37 ° C til 3 h til at polymerisere hydrogel.
6. væv Clearing
- Forberede 500 mL clearing løsning (4% SDS ved pH 8,5). ~ 300 mL af Hedeselskabet2O, tilføje 50 mL 0,1 M PBS og 20 g SDS pulver under omrøring med en magnetisk røre bar. Justere løsningen ved hjælp af natriumhydroxid og saltsyre til pH 8,5. Tilføje ddH2O, indtil den endelige rumfang er 500 mL.
- Efter polymerisering, hæld væk overskydende hydrogel og smide det i en kemisk affald beholder. Brug et stykke køkkenrulle til at forsigtigt tørre væk hydrogel fra prøven og kassér i en kemisk affald beholder.
- Vask prøven i 3-5 udveksling af 0,01 M PBS (discard vask væske ind i det kemiske affald) i 15 min. hver vask trin. Overføre prøven i et 50 mL konisk slange med 40 mL med at rydde bufferen.
- Inkuber prøven i clearing buffer ved 37 ° C og ændre prøven til frisk clearing buffer hver anden dag.
- Lad prøven i clearing buffer for 2-8 uger alt efter prøvestørrelse (~ 8 uger for en 3 mm x 3 mm x 3 mm eksempel) for at sikre ordentlig clearing.
- Overvåge væv clearing og stoppe når du er færdig. Sikre, at stikprøven er tilstrækkeligt gennemsigtige ved at holde det op mod lyset skal kontrolleres for korrekt clearing (normalt nogle tan farve vil forblive i de eksokrine regioner).
Bemærk: En over ryddet prøve vises flosset i kanterne og tekstur vil være meget blød når afhentes med pincet. Det er almindeligt, at prøve at klare ujævnt. Også, væv vil ikke være fuldt gennemsigtige før placeret i montering medier (Indsæt, figur 1 c).
7. flere immunfluorescens
- Vask prøver på en shaker ved 60 rpm på RT for en dag med 40 mL 0,01 M PBS skiftende til frisk buffer ofte (4-5 buffer ændringer i alt 40 mL hver vask, skiftende hver h indtil den endelige vask). Lad den sidste vask fortsætter natten over på RT.
- Forberede PAGTEN farvning buffer. 500 mL 0,01 M PBS, tilføje 50 mg natriumazid og 0,5 mL TritonX-100. Bland godt.
- Inkuber prøve med primære antistoffer.
- Tilføje 2% normal serum (samme arter som sekundær antistof) base pagten farvning buffer i en 2-mL flad bund tube (mindst 1 mL samlede volumen anbefales pr. prøve/tube).
- Tilføje primære antistof til 2% serum/PAGTEN farvning buffer. Bruge ca 5 x mængden af primære antistof til PAGTEN farvning, som vil blive brugt til standard Immunhistokemi (dvs. Hvis et antistof er fortyndet 1: 500 for standard immunhistokemi, brug 1: 100 for PAGTEN farvning).
- Brug en spatel til at fjerne prøven fra wash buffer og ising den overskydende buffer ud på et stykke køkkenrulle, og derefter placere i røret med en primær antistof løsning.
- Inkuber 2-4 dage på RT på en shaker ved 60 rpm. Vask prøver grundigt på RT på en shaker ved 60 rpm i 0,01 M PBS til frisk buffer 4 - 5 gange og forlader den sidste vask om natten som i trin 7.1.
- Inkuber prøver med sekundære antistoffer.
- Tilføje 2% normal serum (samme arter som sekundær antistof) base pagten farvning buffer i en 2-mL flad bund tube (1 mL samlede volumen anbefales pr. prøve/tube).
- Tilføje sekundære antistoffer på en koncentration af 1:200 (5 µl i 1 mL buffer).
Bemærk: Lille format antistoffer er foretrukne, samt meget cross-adsorberet antistoffer, hvis du bruger mere end én primær antistof. - Brug en spatel til at fjerne prøven fra wash buffer og ising den overskydende buffer ud på et stykke køkkenrulle, og derefter placere i røret med en sekundær antistof løsning.
- Der inkuberes ved RT på en shaker ved 60 rpm i 2 dage og beskytte prøven fra lys.
- Vask grundigt, prøverne, som i trin 7.1, på RT på en shaker ved 60 rpm i 0,01 M PBS ændring til den friske buffer 4 - 5 gange og forlader endelige vaske om natten, beskytte mod lys under vasker.
8. montering prøver til billedbehandling
- Forberede brydningsindeks matchede løsning (fælge) buffer.
- Afvejes 11 g af nonioniske tæthed gradient medium (f.eks. Histodenz) og omhyggeligt overføre til en 50 mL konisk slange.
- Tilføje ~ 5 mL 0,02 M fosfat buffer (PB)8 ved hjælp af en spatel til at frigive luft fra pulver nonioniske tæthed gradient medium.
Bemærk: Løsningen vil være meget tyktflydende, bland godt. - Bringe volumen til 10 mL ved hjælp af flere PB, blandes med en spatel og Skrab overskydende off spatel ind i røret.
- FÆLGE der inkuberes ved 37 ° C indtil opløst, vend og forsigtigt blandes efter behov.
- Overføre prøver til fælge. Det gør der afpipetteres 1 mL fælge i en 2-mL flad bund tube. Brug en spatel til at fjerne prøven fra wash buffer og ising den overskydende buffer ud på et stykke køkkenrulle, og derefter placere i røret med fælge løsning.
- Tryk forsigtigt på røret for at dykke prøven i fælge. Prøveemner i fælge på bænken beskyttet mod lys på RT for 2-4 dage før billeddannelse.
- For at billede, placere en lille mængde af fælge i en 8-godt coverslip bunden kammer dias. Tilføj kun lige nok til at coat nederst, mere vil forårsage prøven til float gør det vanskeligere at billede på en inverteret anvendelsesområde. Tilføje prøven til brønden og cap glideslidsen for billeddannelse.
9. billedbehandling
- Konfokal mikroskopi og tænkelig programmel
- Vælg passende lasere for excitation og emission spektre af fluorophores anvendes til at plette PAGTEN prøver. Justere indstillingerne for erhvervelse software, således at enhver overlapning mellem kanaler er elimineret. Bruge separate spor om nødvendigt, (når to fluorophores har lignende excitation spectra).
- Oprette image erhvervelse
- Vælg maksimal erhvervelse hastighed, 16-bit, 4 eller flere gennemsnit og 1024 x 1024 opløsning eller bedre.
- Zoom ind på objektet at være fotograferet.
Bemærk: Dette vil mindske erhvervelse tid til at reducere foto-blegning og også mindske filstørrelsen og downstream redigering.
- Opsætning af z-stakken.
- Vælg den optimal skæring til målet om at blive brugt. Hvis deconvolution ønskes senere, skal du bruge en z-trin mindre end optimal som 1 µm.
- Bruge z-stakken korrektion.
- Begynde nærmeste overfladen af vævet og øge gevinsten som målet fokuserer gennem z-fly og tilføje rettelser. Ændre ikke indstillingerne laser for korrektion!
- Erhverve en test stak med en gennemsnitlig, 512 x 512 opløsning og maksimale erhvervelse hastighed. Tjek billedet i 3D for at sikre, at der er samme lysstyrke i hele stakken for hver farve før erhverve den endelige høj opløsning z-stakken.
- Lightsheet Imaging
- Sikre, at prøverne har været ekvilibreres i fælge til imaging for mindst 24 h. ideelt, overføre prøverne til friske fælge i den billeddiagnostiske afdeling og lad Blandingen henstår i salen i mindst en dag.
- Montere prøve for billedbehandling
- Vælg den mindste (sort) kapillær at montere prøven
- Bruge putty eller en parabol til at afholde prøven samtidig gennemføre super lim til slutningen af kapillar. Lim væv til kapillær at røre så lidt en overflade på vævet som muligt.
- Indsæt eksemplet for billeddannelse.
- Billedet ved hjælp af 5 X eller 25 X mål egnet for optisk ryddet prøver ved hjælp af pivot scanne mulighed. Hvis shadowing eller sløring opstår, rotere prøven og prøv igen, eller lad prøven fortsat reagensglasset i fælge.
Bemærk: En 1 mm stak kan generelt erhverves i mindre end fem minutter, afhængigt af indstillingerne. - Få vist og Rediger billedstakke ved hjælp af billede analyse software.
Representative Results
Disse farvning procedurer blev udviklet for at give en omfattende undersøgelse af den menneskelige bugspytkirtlen til at undersøge Holme og tilknyttede autonome og sensoriske netværk. Flere procedurer blev testet, herunder klarhed7, iDISCO17, og PAGTEN8 med metoden PAGTEN fandt bedst egnet til menneskets bugspytkirtel og konfokal billeddannelse.
Primære antistoffer i første omgang blev testet på fast menneskelige bugspytkirtlen prøver med passende positive og negative kontrolprøver (mus hjernen, andre). Den primære antistoffer og foreslåede fortyndinger er angivet i Tabel af materialer, selvom hvert laboratorium kan forvente at optimere antistof fortyndinger afhængigt af masse tal og væv kilde. Primære antistof lot-for-lot variation kan påvirke farvning intensiteten og specificitet og kræver validering at opnå samme grad af pletten intensitet som med tidligere reagenser.
I den menneskelige bugspytkirtlen, blev Holme afgrænset af insulin, glucagon og secretogranin 3 (figur 2). Schwann celler blev afgrænset ved hjælp af glial fibrillære syre protein (GFAP, figur 2 og figur 3A). Nerver farves med antistoffer mod den parasympatiske markør vasoaktive intestinal peptid (VIP) blev afbildet på Lightsheet (figur 3B). Sympatiske nerver kan ses med farvning for tyrosin hydroxylase (ikke vist).
Figur 1. Menneskets bugspytkirtel optisk clearing. (A) et barberblad er brugt til at skære og løsne et afsnit af paraffin-embedded væv (top paneler) før at fjerne afsnittet væv og skrabe væk overskydende paraffin fra væv (bunden paneler). Repræsentative vævsprøver er vist før (B, C øverst til venstre) og efter (B ret, C midten) optisk clearing af paraffin-embedded væv, som beskrevet i afsnittet protokol. De ryddede, faste væv er ikke fuldstændig gennemsigtig efter clearing (B ret, C højest) og ofte væv hævelser kan blive værdsat (C, midterste panel). De ryddede væv bliver fuldt gennemsigtig efter ækvilibrering i fælge (C, nederste panel). Skalere barer: 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Menneskets neuro-ø netværk. Menneskets bugspytkirtel prøver blev ryddet som beskrevet fra nPOD organdonorer eller archival paraffin-embedded væv. (A-D) Schwann celler (GFAP +, hvid) og endokrine celler er vist farves af insulin (rød) og glukagon (grøn). (A) Confocal mikroskopi og maksimal intensitet projektion (MIP) viser sporing af Schwann celler (GFAP +) på nerverne løbe ved siden af blodkar i Holmen periferien og strækker sig ind i Holme. Indsatsen viser høj opløsning fremstillet og viser kontakt mellem GFAP + Schwann celler og endokrine celler. (B) et 3D billede af panel (skala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. En paraffin-PAGTEN prøve er vist afbildet via Konfokal mikroskopi og præsenteret som en max intensitet projektion (C) og i 3D (D), Skaler: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Skala barer en, C: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. 3D-visualisering og syninger. Tre syet billedstakke blev erhvervet af Schwann celler farves med GFAP og konfokal mikroskopi og spores ved hjælp af en neurite tracer plugin i billed analyse software. (A) 3D fyld af sporingen er vist (skala barer: x = 150 µm, y = 200 µm (0.2 mm), z = 120 µm) (B) en PAGT prøven var plettet med VIP antistof og afbildet ved hjælp af en lightsheet mikroskop. Stakken er > 1 mm i dybden og nervefibre ses tydeligt i høj opløsning. Fibre indpakning en kanal (D, forgrund) og en ganglion (G, baggrunden) kan ses (stort gitter: x, y, z = 200 µm; kryds mærker: x, y, z = 40 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Tilgængeligheden af nye optiske clearing metoder har tilladt hidtil uset store undersøgelser af centralt og perifere nervesystem i dyremodeller. De samlede innervation mønstre af menneskelige bugspytkirtlen er stort set uudforskede væv tæthed og vanskeligheder med at erhverve høj kvalitet biospecimens. Denne protokol tilbyder en optimeret væv clearing protokol for menneskets bugspytkirtel væv fra faste eller paraffin-embedded arkivers prøver.
Clearing-tid afhænger af stikprøvestørrelse, Fikseringsvæske type, varighed, opbevaring varighed og kan kræve 1-8 uger, så de følgende betragtninger er kritisk. Det er bedst at rydde væv snart efter 4% PFA fiksering hvis det er muligt fordi langtidsopbevaring øger clearing tid. Du kan reducere clearing tid, var mængden af PFA i hydrogel monomer faldt fra 4% som anvendes i trinnet fiksering på 1% for den menneskelige bugspytkirtlen. For andre væv, især mus væv, skal mængden af PFA nødvendigt at give tilstrækkelig hydrogel stivhed at bevare antigener bestemmes empirisk. Passende clearing er også afgørende, da antistof penetration er reduceret i dårligt ryddet væv og overflade farvning af sekundære antistoffer er steget. Ændre opløsningen clearing er hver anden dag (eller endda daglige) bedst at holde pH konstant og vaskemiddel frisk. Omvendt, over clearing negativt påvirker cellulære morfologi og øger væv skørhed. Da nogle bugspytkirtlen prøver klare ujævnt på grund af iboende patologier såsom regioner af fibrose fra kronisk pancreatitis eller andre patologier, er det vigtigt at ofte overvåge denne proces. Brug af vibratome tykke sektioner kan også bruges til at lave ensartet tykkelser endnu er ikke påkrævet. Overvågning af clearing processen, så prøver er fjernet fra vaskemiddel som lys passerer let gennem prøven, sikrer, at stikprøven er tilstrækkeligt ryddet.
Antistof penetration og overflade farvning er vigtige spørgsmål at overveje med PAGTEN prøver. For at sikre god antistof penetration, er det kritisk at udruge prøver med de primære antistoffer i mindst 2 dage. Forskellige antistoffer har forskellige diffusion priser og bør optimeres individuelt, men for de fleste antistoffer, 4 dage var tilstrækkeligt varighed for fuld indtrængen i en 1 mm3 prøve. Hvis overfladen farvning er et problem, især for Lightsheet billeddannelse, prøven kan skæres i halve, eller overfladen dissekeret væk efter farvning. Lille format antistoffer når tilgængelige forventes at bistå med væv penetration8. Preconjugated antistoffer synes ikke at arbejde ud over den samme ukonjugeret klon og højere baggrund fra uspecifik bindende og fattigere væv penetration kan være overholdt, hvis de arbejder på alle. For forbedret succes med preconjugated antistoffer, øge serum og TritonX-100 koncentrationer i farvning buffer og bruge længere inkubationer (> 4 dage). Efter farvning, er inkubation af prøven i fælge i flere dage kritiske. Ryddet væv swell i PBS og fælge inkubation får dem til at vige tilbage til oprindelige størrelse. Især med lightsheet imaging, skal prøven være fuldt ekvilibreres før imaging.
Når imaging prøver på Konfokal mikroskop, angives korrektionen hver gang en ny stilling er valgt. Forskellige erhvervelse dybder og variation i farvning intensitet i hele vævet nødvendiggør justeringer for hvert område af væv til afbildning optimalt. Ligeledes, de sekundære antistoffer bruges skal overvejes nøje. Spectral urtåge udfordrende i PAGTEN prøver, så fluorophores skal være korrekt valgt for en lav excitation eller emission overlap til at sikre en lyse signal når filtrering emissioner på Konfokal mikroskop. For hvert program sikres en balance mellem opløsning, imaging hastighed og støjreduktion således at de bedste kvalitet billede kan erhverves uden foto-blegning. Opløsning større end 1024 x 1024 er ikke kan påvises ved det menneskelige øje, men kan være nødvendige for visse programmer, hvis kvantificering af en plet er nødvendig.
Der er mange ting at overveje, når du vælger en optisk clearing teknik, og når du vælger optisk clearing over andre mere traditionelle metoder. Lav overflod antigener må ikke kunne påvises ved hjælp af metoden PAGT findes således begrænsninger på antigen påvisning. Visse antigener såsom immunologiske antigener (CD3, CD4, CD8, etc.) er ødelagt af metoden PAGTEN og målbart trods høj kvalitet antistoffer tilgængelige til at registrere dem. En anden begrænsning ved denne metode er den iboende variabiliteten mellem donor bugspytkirtel, hvilket er vanskeligt at skelne indtil efter clearing farvning. Hver donorvæv tendens til at rydde og plet på samme måde mellem procedurer, men forskellige donor væv har meget varierende clearing-tid og væv morfologi kvalitet efter clearing. Evnen til at bruge arkivers væv kan afbøde denne begrænsning, hvis man kan have passende adgang til et stort antal patient bugspytkirtlen prøver, men dette ikke er blevet grundigt undersøgt. PAGTEN protokollen rapporteret heri fandtes for at være billig og let gennemføres med almindeligt laboratorieudstyr. Ryddet prøver var egnet til billeddannelse via traditionelle Konfokal mikroskopi, samt 2-foton og Lightsheet teknologier og forudsat høj opløsning 3D billeder af nerver og Holme i store dele af den menneskelige bugspytkirtlen. Fremtidige anvendelser af denne procedure omfatter undersøgelser af udviklingen af føtal bugspytkirtlen eksokrine og endokrine rum og Holmen undersøgelser i type 1 og type 2 diabetes.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. Ann Fu og Joseph Canzano for teknisk bistand, Dr. Jennifer Treweek for uvurderlige råd, og Dr. Kristin Overton og Dr. Karl Deisseroth for uddannelse til MCT gennem Stanford University klarhed workshop. JDRF nPOD og orgel indkøb organisationer forudsat vævsprøver. Dette arbejde blev finansieret af JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) og NIDDK 1OT2 TR001773 til MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
