Summary
Qui, presentiamo un passivo di protocollo per sezioni di pancreas umano immagine in tre dimensioni (3D) utilizzando ottimizzato metodi di compensazione. Questo manoscritto viene illustrato queste procedure per schiarimento ottico passivo seguita da più immunofluorescenza che macchia per identificare gli elementi chiave delle reti neurali autonomiche e sensoriale che innervano isolotti umani.
Abstract
Usando i metodi istologici tradizionali, i ricercatori sono ostacolati nella loro capacità di immagine intera tessuti o organi in 3D su larga scala. Le sezioni istologiche sono generalmente limitate a < 20 µm come formalina fisso paraffina sezione sulle lastre di vetro o < 500 µm per digalleggiante ante fisse. Pertanto, gli sforzi profusi sono necessari per sezionamento seriale e metodi di ricostruzione su larga scala immagine per ricreare 3D per campioni > 500 µm con metodi tradizionali. Inoltre, disperde luce da macromolecole all'interno dei tessuti, in particolare i lipidi, previene la formazione immagine a una profondità > 150 µm con microscopi confocali più. Per ridurre la dispersione di luce e per consentire per l'imaging dei tessuti profondi usando la microscopia confocal semplice, sono stati sviluppati vari metodi di schiarimento ottico che sono rilevanti per i campioni di tessuto umano e del roditore corretti per immersione. Diversi metodi sono legati e utilizzano proteine reticolazione con acrilammide e tessuto di compensazione con sodio dodecil solfato (SDS). Altre tecniche di schiarimento ottico utilizzato vari solventi se ogni modifica ha avuto vari vantaggi e svantaggi. Qui, un metodo di compensazione ottica passiva ottimizzata è descritto per gli studi dell'innervazione pancreas umano e in particolare per l'interrogatorio dell'innervazione degli isolotti umani.
Introduction
Fino a poco tempo, 3-dimensionale (3D) ricostruzione di grandi tessuti o organi interi è stato effettuato con sezionamento seriale laborioso, colorazione e ricostruzione dell'immagine di più sezioni. Questi metodi hanno avuti diversi svantaggi tra cui affidarsi a un gran numero di sezioni di serie, penetrazione difficile del tessuto con gli anticorpi e luce scattering prevenzione formazione immagine profonda all'interno dei tessuti. Per consentire una maggiore luce e penetrazione dell'anticorpo, i ricercatori hanno sviluppato metodi chimici per preservare gli antigeni della proteina durante la rimozione la maggior parte dei lipidi di luce-dispersione. Diversi correlati metodi sono ibridate Clear Lipid-Exchanged acrilamide rigida Imaging tessuto idrogel (chiarezza), Passive chiarezza tecnica (patto) e assistita da aspersione Agent Release in situ (PARS) (Recensito in 1,2 ,3,4,5,6). Il metodo di chiarezza si basa sulla stabilizzazione delle proteine usando un formaldeide, acrilammide e bis idrogel seguita da rimozione dei lipidi mediante elettroforesi in una soluzione di SDS2. Questo approccio è stato successivamente modificato per passivo di compensazione e advanced imaging7. Ulteriore ottimizzazione portato all'eliminazione del bis e percentuali variabili di paraformaldeide nella soluzione idrogel (1-4%) per ottenere la stabilizzazione dell'antigene ottimale con il minor tempo di schiarimento per una tecnica chiamata patto 8. I primi tentativi di sviluppare queste tecniche di compensazione ottica coinvolti composti organici o di altri che erano difficili da lavorare e proteine fluorescenti endogene estiguute in modelli murini transgenici. Questi metodi aggiuntivi inclusi scale, sgomberata cervello/corpo cocktail e computazionale analisi (cubico), metodi di SWITCH e Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organi (discoteca), tutti con diversi vantaggi e svantaggi9, 10,11,12. Il metodo originale di chiarezza è stato sviluppato nel tessuto di cervello del mouse ricca di lipidi e metodi di schiarimento ottico avevano limitato test in tessuti umani7,8,11,13,14 .
Metodi di schiarimento ottico sono ideali per i nervi l'analisi sulle lunghe distanze come nel sistema nervoso centrale intatto del mouse. Il pancreas è ben innervato dal sistema nervoso sia autonomico e sensoriale. Il vano del pancreas endocrino, isolotti di Langerhans, costituiscono una parte molto piccola dell'organo intero (1-2%) e isolotti hanno conosciuto eterogeneità nelle dimensioni (50-250 µm), cellula endocrina proporzioni e densità particolarmente in diabete (rivisto in 15 ,16). Nello sviluppo di un protocollo, sono stati testati diversi metodi di schiarimento ottico per pancreas umano e una procedura di patto è stata trovata per fornire il miglior equilibrio tra tempo per cancellare (~ 2 settimane) con ottima conservazione morfologica dei nervi e isolotti. La procedura ottimizzata finale è descritto qui nel delineare la rete neuro-insulare per su larga scala (Distanze di millimetro) e imaging ad alta risoluzione 3D degli isolotti pancreatici intatti più. La tecnica è adatta per pancreas umano segue immediatamente la fissazione o dopo deposito così come i campioni fissati in formalina neutra tamponata e incorporato in paraffina. I campioni sono adatti per l'imaging di confocal o microscopia lightsheet.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la University of Florida Institutional Review Board e le linee guida federali.
Attenzione: Paraformaldeide e acrilammide sono irritanti tossici. Reagenti in una cappa con appropriati dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali di protezione).
1. Sparaffinatura dei tessuti formaldeide-fisso (se lavora con tessuti freschi, andare al passaggio 2)
- Utilizzare una nuova lama di rasoio o bisturi per tagliare attraverso la paraffina perpendicolare alla superficie del tessuto. Tagliare la paraffina al bordo del tessuto alla fine esso allentamento. Utilizzare pinze o una spatola per delicatamente allentare e rimuovere il tessuto otticamente essere liquidati. Raschiare delicatamente la paraffina in eccesso dal tessuto con una spatola (Figura 1A).
- Riempire un contenitore di vetro con xilene (circa 30 mL per un 3 x 3 x 3, sezione mm di tessuto) e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a temperatura ambiente (TA).
- Riempire un altro contenitore di vetro con xilene fresco con lo stesso volume come 1.2.1. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA.
- Inserire etanolo al 100% in una provetta conica con lo stesso volume come 1.2.1. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA.
- Inserire un tubo conico con lo stesso volume come 1.2.1 di etanolo al 95%. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA.
- Inserire un tubo conico con lo stesso volume come 1.2.1 di etanolo al 70%. Trasferire e incubare il tessuto in questa soluzione per 24 h a TA.
- Sciacquare il tessuto in 0,01 M di fosfato tampone salino (PBS) e posto in PBS 0,01 M in una provetta conica per equilibrare per 24 h a RT. Assicurarsi che il tessuto sia privo di paraffina (Figura 1B, pannello di destra).
2. preparare 4% paraformaldeide (PFA) fissativo
- Pipettare mL 10 16% PFA in una provetta conica da 50 mL, aggiungere 4 mL di PBS + 0.1 M e 26 mL di acqua distillata o deionizzata (ddH2O). Chiudere il tappo e mescolare brevemente.
- Volumi maggiori di 4% PFA può essere fatto in anticipo e congelato in aliquote. Le aliquote sono buone per 1 giorno a temperatura ambiente (TA), una settimana a 4 ° C e 1 mese a-20 ° C.
3. pancreas fissazione
- Correggere l'esempio del pancreas (≤ 1 x 1 x 2 cm) in preparati 4% PFA a 4 ° C per 48 h. Se il campione è più grande di 1 x 1 x 2 cm, utilizzare un bisturi o lametta per sezionare in piccoli pezzi non più di 1 cm di spessore. Lavare il campione di tessuto in tre cambi di PBS 0,01 M per almeno 15 min ogni lavaggio ed immagazzinare in provetta da centrifuga da 15 mL in 0,01% PFA/0,01 M PBS o 0,5% sodio azide/0,01 M PBS fino all'utilizzo.
- Dopo la fissazione, la sezione del tessuto in sezioni spesse 1-2 mm per l'ulteriore elaborazione. Usare una vibratome per assistere in anche di sezionamento.
Nota: Il numero finale delle sezioni dipenderà la dimensione del campione iniziale.
4. incorporare tessuto in idrogel
- Preparare 200 mL di soluzione di monomero di 4% acrilammide/1% paraformaldeide (A4P1) idrogel come segue:
- Posto un pallone sul ghiaccio in un secchio sulla cima di una piastra magnetica. Accertarsi che il pallone sia seduto piatto e aggiungere un ancoretta magnetica.
- Aggiungere il codice seguente nell'ordine: 147,8 mL freddo (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL di PBS + 0.1 M, soluzione di acrilammide per 20ml fredda (4-8 ° C) 40%, 12,2 mL di soluzione di 16% PFA e iniziatore di 250 mg VA-044. Miscelare la soluzione intera idrogel con un ancoretta magnetica per almeno 10 min e lasciare la soluzione sul ghiaccio per il passaggio successivo.
- Inserire un tubo conico di 15 mL nel ghiaccio accanto alla beuta contenente la soluzione di idrogel. Pipettare 14 mL di soluzione di monomero nella provetta e aggiungere un pezzo del campione di tessuto fisso spesso 1-2 mm. Quindi richiudere la provetta.
- Incubare il campione nella soluzione di monomero per 3 giorni a 4 ° C e proteggere dalla luce. Aliquotare qualsiasi restante soluzione di monomero e conservare a-20 ° C per un uso futuro.
5. degassare la soluzione di monomero e polimerizzare l'idrogel
- Rimuovere l'ossigeno dalla soluzione di monomero di idrogel utilizzando gassosi N28.
- Preparare un secchio di ghiaccio e posizionare il campione nella soluzione di monomero di idrogel su ghiaccio.
- Raccogliere gli aghi ipodermici 18g 2-3, per esempio, pellicola di paraffina e un timer. Collegare il tubo al serbatoio di azoto affinché l'azoto può fluire. Pur mantenendo il campione sul ghiaccio, perforare con attenzione il tappo di una provetta contenente il campione su un lato e premere un ago ipodermico attraverso fino a quando è sotto la superficie della soluzione monomero liquido.
- Utilizzare un altro ago ipodermico per pungere il lato opposto della PAC, ma non permettono di diventare sommerso.
Nota: Il secondo ago sarà sfiatare il tubo. - Collegare il tubo dal serbatoio di azoto per l'ago ipodermico sommerso sotto l'idrogel e girare lentamente l'azoto fino a essa ribolle costantemente attraverso il liquido.
- Consentire l'azoto a bolla attraverso il liquido per 10 min.
- Una volta rimosso l'ossigeno, rimuovere entrambi gli aghi rapidamente e coprire il tappo con un film di paraffina per prevenire qualsiasi ulteriore scambio di gas tra il tubo e l'ambiente. Il campione degassato viene posto in un incubatore a 37 ° C per 3 h di polimerizzare l'idrogel.
6. i tessuti schiarimento
- Preparare 500 mL di soluzione (4% SDS a pH 8,5) di compensazione. A ~ 300 mL di ddH2O, aggiungere 50 mL 0.1 M PBS e 20 g SDS polvere continuando a mescolare con un ancoretta magnetica. Regolare la soluzione utilizzando idrossido di sodio e acido cloridrico a pH 8,5. Aggiungere ddH2O fino a quando il volume finale è di 500 mL.
- Dopo la polimerizzazione, levate l'eccesso idrogel e gettarlo in un contenitore per rifiuti chimici. Utilizzare un tovagliolo di carta per delicatamente pulire idrogel lontano dal campione e gettare in un contenitore per rifiuti chimici.
- Lavare il campione in 3-5 scambi di 0,01 M PBS (liquido di lavaggio scartare nei rifiuti chimici) per 15 min ogni passaggio di lavaggio. Trasferire il campione in una provetta conica da 50 mL con 40 mL di tampone di compensazione.
- Incubare il campione nel buffer di compensazione a 37 ° C e cambiare il campione al buffer di schiarimento freschi ogni altro giorno.
- Lasciare il campione nel buffer di compensazione per 2-8 settimane a seconda della dimensione del campione (~ 8 settimane per un 3 x 3 mm x 3 mm campione) per garantire la corretta compensazione.
- Monitoraggio schiarimento dei tessuti e l'arresto al termine. Assicurare che il campione sia adeguatamente trasparente tenendolo fino alla luce per verificare la corretta compensazione (di solito qualche colorazione conciare rimarrà nelle regioni esocrine).
Nota: Un campione di over-eliminato apparirà sfilacciato ai bordi e la trama sarà molto morbida quando prelevati con il forcipe. È comune per il campione cancellare in modo non uniforme. Inoltre, il tessuto non sarà completamente trasparente fino a quando inserito nel montaggio supporti (inserire, Figura 1).
7. più immunofluorescenza
- Lavare i campioni su un agitatore a 60 giri/min a RT per un giorno con 40 mL di PBS 0,01 M cambiando a fresco buffer spesso (4-5 buffer cambia in totale, 40 mL di ogni lavaggio, cambiando ogni h fino a quando il lavaggio finale). Lasciare il lavaggio finale continuare tutta la notte a TA.
- Preparare il patto macchiatura buffer. Per 500 mL di PBS 0,01 M, aggiungere 50 mg sodio azide e 0,5 mL TritonX-100. Mescolare bene.
- Incubare il campione con gli anticorpi primari.
- Aggiungere 2% siero normale (stessa specie come l'anticorpo secondario) al patto di base macchiatura tampone in una provetta 2 mL fondo piatto (almeno 1 mL di volume totale è consigliato per campione/tubo).
- Aggiungere il 2% del siero/patto macchiatura buffer anticorpo primario. Utilizzare circa 5 volte la quantità di anticorpo primario per la colorazione del patto che viene utilizzata per immunohistochemistry standard (cioè se un anticorpo è diluito 1: 500 per immunohistochemistry standard, utilizzo 1: 100 per la colorazione del patto).
- Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con una soluzione di anticorpo primario.
- Incubare per 2-4 giorni a temperatura ambiente in un agitatore a 60 giri/min. Lavare accuratamente i campioni a RT su un agitatore a 60 rpm in PBS 0,01 M cambiando a tampone fresco 4 - 5 volte e lasciando il lavaggio finale durante la notte come descritto al punto 7.1.
- Incubare i campioni con anticorpi secondari.
- Aggiungere 2% siero normale (stessa specie come l'anticorpo secondario) al patto di base tampone in una provetta 2 mL fondo piatto di colorazione (1 mL di volume totale è consigliato per campione/tubo).
- Aggiungere gli anticorpi secondari ad una concentrazione di 1: 200 (5 µ l in 1 mL di tampone).
Nota: Piccolo formato gli anticorpi sono anticorpi preferiti, così come altamente cross-adsorbito in se utilizza più di un anticorpo primario. - Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con una soluzione di anticorpo secondario.
- Incubare a RT su un agitatore a 60 giri/min per 2 giorni e proteggere il campione dalla luce.
- Lavare accuratamente i campioni, come descritto al punto 7.1, a RT su un agitatore a 60 rpm in PBS 0,01 M cambiando nel buffer fresco 4 - 5 volte e lasciando la finale lavare tutta la notte, proteggere dalla luce durante i lavaggi.
8. esempi di montaggio per l'Imaging
- Preparare il tampone di soluzione abbinati (cerchi) di indice di rifrazione.
- Pesare 11 g di medio gradiente di densità non ionici (ad esempio, Histodenz) e trasferire con cautela in una provetta conica da 50 mL.
- Aggiungere con una spatola per liberare l'aria dal mezzo di gradienti di densità non ionici polvere ~ 5 mL 0,02 M fosfato tampone (PB)8 .
Nota: La soluzione sarà molto viscoso, mescolare bene. - Portare il volume a 10 mL utilizzando più PB, mescolare con una spatola e raschiare l'eccesso fuori la spatola nella provetta.
- Cerchi di incubare a 37 ° C fino a completa dissoluzione, invertire e mescolare delicatamente come necessario.
- Trasferire campioni nei bordi. A tale scopo, Pipettare 1 mL cerchi in una provetta da 2 mL a fondo piatto. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione dal tampone di lavaggio e tamponare il tampone in eccesso su un tovagliolo di carta, poi posto nel tubo con soluzione di cerchioni.
- Picchiettare delicatamente il tubo per immergere il campione in cerchi. Posizionare il campione in cerchi in panchina al riparo dalla luce a temperatura ambiente per 2-4 giorni prima di formazione immagine.
- Per realizzare l'immagine, mettere una piccola quantità di cerchi in una diapositiva di camera inferiore 8 pozzetti vetrino coprioggetti. Aggiungere solo quanto basta per rivestire la parte inferiore, più causerà il campione in float rendendo più difficile per l'immagine su un ambito invertito. Aggiungere il campione e la diapositiva per l'imaging di cap.
9. imaging
- Microscopia confocale e software di imaging
- Selezionare laser appropriato per l'eccitazione e spettri di emissione di fluorofori utilizzati a macchiare i campioni del patto. Regolare le impostazioni del software di acquisizione in modo che eventuali sovrapposizioni tra i canali sono eliminata. Se necessario utilizzare tracce separate (quando due fluorofori hanno spettri di eccitazione simili).
- Impostare l'acquisizione di immagini
- Scegliere la velocità massima di acquisizione, 16 bit, 4 o più medie e risoluzione 1024 x 1024 o superiore.
- Ingrandire l'oggetto essere imaged.
Nota: Ciò farà diminuire il tempo di acquisizione per ridurre foto-candeggio e anche diminuire la dimensione del file e la modifica a valle.
- Programma di installazione lo z-stack.
- Selezionare il sezionamento ottimali per l'obiettivo utilizzato. Volendo poi deconvoluzione, utilizzare un z-passo inferiore a ottimale come 1 µm.
- Utilizzare la correzione dello stack z.
- Iniziare la superficie del tessuto più vicina e aumentare il guadagno come l'obiettivo mette a fuoco attraverso il piano z e aggiungere le correzioni. Non modificare le impostazioni di laser per la correzione!
- Acquisire una pila di prova con una media, la risoluzione di 512 x 512 e velocità massima di acquisizione. Controllare l'immagine in 3D per assicurarsi che ci sia uguale luminosità in tutto lo stack per ogni colore prima di acquisire il finale ad alta risoluzione z-stack.
- Lightsheet Imaging
- Assicurarsi che i campioni hanno stati equilibrati in cerchi per imaging per almeno 24 h. idealmente, trasferire i campioni freschi cerchi nella camera di imaging e permettono di equilibrare in aula per almeno un giorno.
- Inserire il campione per l'imaging
- Selezionare il più piccolo capillare (nero) per montare il campione
- Utilizzare mastice o un piatto per tenere il campione durante l'applicazione di colla super all'estremità del capillare. Incollare il tessuto per il capillare toccando come poco una superficie del tessuto come possibile.
- Inserire il campione per l'imaging.
- Immagine utilizzando 5 X o 25 X obiettivi adatti per opzione di analisi di campioni otticamente cancellati usando il perno. Se si verifica lo shadowing o sfocatura, ruotare il campione e riprovare o lasciare che il campione continuano a equilibrare in cerchi.
Nota: Una pila di 1 mm può essere acquisita in genere in meno di cinque minuti, a seconda delle impostazioni. - Visualizzare e modificare gli stack di immagine utilizzando il software di analisi di immagine.
Representative Results
Queste procedure di colorazione sono state sviluppate per fornire un esame su larga scala del pancreas umano per esaminare gli isolotti e reti associate autonomiche e sensoriale. Diverse procedure sono state provate compreso chiarezza7, iDISCO17, e patto8 con il metodo di patto trovato migliore adatto per pancreas umano e imaging confocale.
Gli anticorpi primari erano inizialmente testati su fisso campioni di pancreas umano con campioni di controllo positivi e negativi (mouse cervello, altri). Gli anticorpi primari e diluizioni consigliate sono elencati nella Tabella materiali, se ogni laboratorio può aspettare ottimizzare diluizioni di anticorpo a seconda della fonte di numero e del tessuto del sacco. Anticorpo primario lotto--lotto variazione può influire l'intensità di colorazione e la specificità e richiedono la convalida per raggiungere lo stesso grado di intensità di colorazione come con reagenti ex.
Nel pancreas umano, isolotti sono stati delineati da insulina, glucagone e secretogranina 3 (Figura 2). Cellule di Schwann sono state delineate utilizzando la proteina acida fibrillare gliale (GFAP, Figura 2 e Figura 3A). Nervi macchiati con gli anticorpi contro il peptide intestinale vasoattivo (VIP) di marcatore parasimpatico erano imaged su Lightsheet (Figura 3B). Nervi simpatici possono essere visto con la macchiatura per tirosina idrossilasi (non mostrato).
Figura 1. Schiarimento ottico pancreas umano. (A) viene utilizzata una lama di rasoio per tagliare e allentare una sezione del tessuto paraffina-incastonato (pannello superiore) prima di rimuovere la sezione di tessuto e raschiando via paraffina in eccesso dal tessuto (pannello inferiore). Campioni rappresentativi del tessuto sono mostrati prima (alto a sinistra, in C di B) e dopo (destra B, middle C) compensazione ottica del tessuto paraffina-incastonato, come descritto nella sezione protocollo. Il tessuto deselezionato, fisso non è completamente trasparente dopo aver deselezionato (B destra, parte superiore C) e spesso tessuto gonfiore può essere apprezzato (C, pannello centrale). Il tessuto deselezionato diventa completamente trasparente dopo l'equilibratura in cerchi (C, pannello inferiore). Scala bar: 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rete di neuro-insulare umano. Campioni di pancreas umano sono stati liquidati come descritto da nPOD donatori di organi o tessuti paraffina-incastonati archivistici. (A-D) Cellule di Schwann (GFAP +, bianco) e cellule endocrine sono mostrate macchiate da insulina (rosso) e glucagone (verde). (A) confocale microscopia e la massima intensità proiezione (MIP) Mostra l'analisi delle cellule di Schwann (GFAP +) sui nervi che scorrono accanto a vasi sanguigni alla periferia dell'isolotto ed estendendo in isolotti. L'inserto viene illustrato ad alta risoluzione ottenute e Mostra il contatto tra le cellule di Schwann GFAP + e cellule endocrine. (B) un'immagine 3D del pannello (scala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. È riportato un esempio di paraffina-patto imaged tramite microscopia confocale e presentato come una proiezione di intensità massima (C) e in 3D (D), scala: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Scala bar A, C: 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. visualizzazione 3D e impunture. Tre serie di cucito immagini sono state acquisite delle cellule di Schwann macchiati usando GFAP e microscopia confocale e tracciata utilizzando un plugin di tracciante del neurite del software di analisi di immagine. (A) il riempimento 3D della traccia è indicato (scala bar: x = 150 µm, y = 200 µm (0,2 mm), z = 120 µm) (B) un patto campione era macchiato con l'anticorpo di VIP e imaging utilizzando un microscopio di lightsheet. Lo stack è > 1 mm in profondità e fibre nervose sono chiaramente visibili in alta risoluzione. Fibre avvolgendo un condotto (D, primo piano) e un ganglio (G, sfondo) possono essere visto (griglia grande: x, y, z = 200 µm; segni di graduazione: x, y, z = 40 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Disponibilità di nuovi metodi di compensazione ottica ha permesso gli esami su larga scala senza precedenti del centrale e sistema nervoso periferico in modelli animali. Il pattern di innervazione del pancreas umano sono in gran parte inesplorato a causa della densità del tessuto e difficoltà nell'acquisizione di alta qualità biospecimens. Questo protocollo offre un tessuto ottimizzato protocollo per il tessuto del pancreas umano da fissi o paraffina-incastonati archivistici campioni di compensazione.
Tempo di compensazione dipende la dimensione del campione, tipo di fissativo, durata durata di archiviazione e può richiedere 1-8 settimane, quindi le considerazioni seguenti sono critiche. Si consiglia di deselezionare i tessuti presto dopo la fissazione di PFA del 4% se possibile perché archiviazione a lungo termine aumenta il tempo di schiarimento. Per ridurre al minimo tempo di compensazione, la quantità di PFA nel monomero idrogel è stata diminuita da 4% come utilizzata nel passaggio fissazione all'1% per il pancreas umano. Per altri tessuti, soprattutto tessuti di topo, la quantità di PFA necessario fornire sufficiente rigidità di idrogel di preservare gli antigeni deve essere determinata empiricamente. Un'adeguata compensazione anche è essenziale poiché la penetrazione dell'anticorpo è ridotta nei tessuti scarsamente deselezionate e superficie macchiatura di anticorpi secondari è aumentata. Cambiare la soluzione di schiarimento ogni altro giorno (o, anche giornalmente) è preferibile mantenere il pH costante e detergente fresco. Al contrario, sovra-compensazione negativamente influisce la morfologia cellulare e aumenta la friabilità del tessuto. Dal momento che alcuni campioni di pancreas deselezionare irregolarmente a causa di patologie inerenti come regioni di fibrosi da pancreatite cronica o altre patologie, è importante monitorare frequentemente questo processo. Usare delle sezioni spesse vibratome può essere utilizzato anche per fare degli spessori uniformi ma non sono necessari. Monitoraggio del processo di schiarimento, così i campioni vengono rimossi dal detersivo, non appena la luce passa facilmente attraverso il campione, assicura che il campione sia sufficientemente deselezionato.
Penetrazione dell'anticorpo e marcatura di superficie sono aspetti importanti da considerare con campioni di patto. Per garantire una buona anticorpo penetrazione, è fondamentale per incubare i campioni con gli anticorpi primari per almeno 2 giorni. Vari anticorpi hanno tassi di diffusione differenti e dovrebbero essere ottimizzati singolarmente, ma per la maggior parte degli anticorpi, 4 giorni era durata sufficiente per la penetrazione completa in un campione di3 di 1 mm. Se colorazione superficiale è un problema, soprattutto per l'imaging di Lightsheet, il campione può essere tagliato a metà, o la superficie sezionata distanza dopo la colorazione. Gli anticorpi di piccolo formato quando disponibile dovrebbe assistere con tessuto vaginale8. Preconjugated anticorpi non sembrano funzionare così come lo stesso clone non coniugato e più elevato background di legame non specifico e più poveri penetrazione tissutale può essere osservata se funzionano affatto. Per maggiore successo con gli anticorpi preconjugated, aumento del siero e concentrazioni TritonX-100 nella macchiatura buffer e utilizzano le incubazioni più a lungo (> 4 giorni). Dopo la colorazione, l'incubazione del campione in cerchi per diversi giorni è fondamentale. Sgomberati tessuti si gonfiano in PBS e cerchi l'incubazione li induce a ridursi alle dimensioni originali. Soprattutto con formazione immagine di lightsheet, il campione dovrebbe essere equilibrato completamente prima di formazione immagine.
Quando i campioni sul microscopio confocal di formazione immagine, la correzione deve essere impostata ogni volta che una nuova posizione viene scelto. Diverse profondità di acquisizione e variazione di intensità durante il tessuto di colorazione richiede regolazioni per ogni area del tessuto essere imaged in modo ottimale. Allo stesso modo, gli anticorpi secondari utilizzati devono essere attentamente valutati. Unmixing spettrale è impegnativo in campioni di patto, quindi fluorofori devono essere scelti in modo appropriato per una sovrapposizione di eccitazione o emissione bassa garantire un segnale luminoso quando si filtrano le emissioni sul microscopio confocale. Per ogni applicazione, una deve essere equilibrio tra risoluzione e la velocità di formazione immagine, riduzione del rumore affinché la migliore qualità dell'immagine possono essere acquisite senza foto-candeggio. Risoluzione superiore a 1024 x 1024 non è rilevabile dall'occhio umano, ma può essere necessaria per alcune applicazioni se è richiesta la quantificazione di una macchia.
Ci sono molte cose da considerare quando si sceglie una tecnica di compensazione ottica e quando si sceglie di schiarimento ottico rispetto ad altri metodi più tradizionali. Gli antigeni abbondanza bassa potrebbero non essere rilevabili utilizzando il metodo di patto, così ci sono limitazioni sulla rilevazione dell'antigene. Alcuni antigeni quali antigeni immunologici (CD3, CD4, CD8, ecc.) vengono distrutti dal metodo patto e sono rilevabili nonostante gli anticorpi di alta qualità disponibili per individuarli. Un'altra limitazione di questo metodo è la variabilità inerente tra pancreas del donatore che sono difficili da discernere fino a dopo la macchiatura di compensazione. Ogni tessuto del donatore tende a cancellare e macchia allo stesso modo tra procedure, ma tessuti diversi donatori hanno ampiamente diversi tempi di schiarimento e qualità morfologia del tessuto dopo schiarimento. La possibilità di utilizzare tessuto archivistico può attenuare questa limitazione, se uno può avere un accesso adeguato a un numero elevato di campioni paziente pancreas, anche se questo non è stato accuratamente studiato. Il protocollo di patto riportato nel presente documento è stato trovato per essere poco costoso e facilmente implementato con normale attrezzatura da laboratorio. Sgomberati campioni erano adatti per l'imaging tramite microscopia confocale tradizionale, come pure 2-fotone e Lightsheet tecnologie e fornito di alta risoluzione 3D immagini di nervi e isolotti nelle grandi sezioni del pancreas umano. Applicazioni future di questa procedura includono studi sullo sviluppo del pancreas fetale per compartimenti sia esocrine ed endocrine, studi di isolotto in tipo 1 e diabete di tipo 2.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Ann Fu Joseph Canzano per assistenza tecnica, Dr. Jennifer Treweek per preziosi consigli e Dr. Kristin Overton e Dr. Karl Deisseroth per formazione di MCT attraverso il laboratorio di Stanford University chiarezza. JDRF nPOD e le organizzazioni di approvvigionamento organo fornito campioni di tessuto. Questo lavoro è stato finanziato dalla JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) e TR001773 di 1OT2 NIDDK di MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
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